7型腺病毒受體同源性多肽的篩選和研究①

許元生 田新貴 劉銘龍 李晨陽(yáng) 周 榮

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510120)

7型腺病毒受體同源性多肽的篩選和研究①

許元生 田新貴 劉銘龍 李晨陽(yáng) 周 榮

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸疾病國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510120)

目的:篩選7型腺病毒的結(jié)合多肽，并研究其與腺病毒受體的相關(guān)性。方法:利用噬菌體肽庫(kù)，篩選7型腺病毒的結(jié)合多肽，并制備其抗體，利用抗體進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，觀察抗體與細(xì)胞膜的結(jié)合情況。結(jié)果:篩選到了GTS09多肽，其與噬菌體的復(fù)合物能特異的結(jié)合7型腺病毒，親和常數(shù)可以達(dá)到1.93×1010L/mol;制備了GTS09的兔多克隆抗體，免疫熒光顯示，該抗體可以特異地結(jié)合在293細(xì)胞的細(xì)胞膜上。結(jié)論:抗GTS09的抗體可以特異的結(jié)合于細(xì)胞膜上，表明7型腺病毒受體可能與GTS09具有一定的同源性，為鑒定和分離7型腺病毒受體打下了基礎(chǔ)。

7型腺病毒;受體;多肽;免疫熒光

腺病毒受體可以高效的黏附腺病毒，并介導(dǎo)腺病毒基因組進(jìn)入細(xì)胞核，而且與多種腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有密切關(guān)系[1-5]。隨著人們對(duì)使用腺病毒載體所進(jìn)行的基因治療研究的增多，腺病毒受體的研究近十幾年來(lái)得到迅速發(fā)展，多個(gè)腺病毒受體相繼被發(fā)現(xiàn)和鑒定。但7型腺病毒的受體至今尚未被發(fā)現(xiàn)和分離[6]。

本研究利用噬菌體肽庫(kù)篩選了一個(gè)能特異結(jié)合7型腺病毒的多肽，并利用該多肽的多克隆抗體研究該多肽和7型腺病毒受體的一些關(guān)聯(lián)，對(duì)發(fā)現(xiàn)7型腺病毒受體做了一些探索性的嘗試工作。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 噬菌體展示12肽文庫(kù)試劑盒(Ph.D.-12 Phage Display Peptide Library Kit)購(gòu)自美國(guó)New England Biolabs，噬菌體宿主菌為ER2738; HRP/Anti-M13 Monoclonal Conjugate購(gòu)自美國(guó) GE公司;7型腺病毒(Ad7)由本實(shí)驗(yàn)室保存和培養(yǎng)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 7型腺病毒對(duì)噬菌體12肽庫(kù)進(jìn)行淘選 淘選方法參照NEB公司Ph.D.-12試劑盒使用手冊(cè):將Ad7腺病毒包被于ELISA板，4℃過(guò)夜;BSA封閉1 h。加入4×1010的噬菌體，室溫溫和搖動(dòng)60 min。TBST緩沖液洗板10次;pH2.2的 Glycine-HCl洗脫。洗脫物加入ER2738培養(yǎng)物中，37℃劇烈搖動(dòng)培養(yǎng)4.5 h;培養(yǎng)物4℃ 10 000 r/min離心10 min，加入1/6體積的 PEG/NaCl，4℃沉淀過(guò)夜。4℃、10 000 r/min離心，沉淀重懸于200 μl TBS中，即為擴(kuò)增后的洗脫物。取少量用LB/IPTG/Xgal平板滴定擴(kuò)增后的洗脫物。取100 μl進(jìn)行第二輪淘選，如此進(jìn)行四輪淘選。經(jīng)4輪淘選的平板上隨機(jī)挑取單個(gè)噬菌斑，擴(kuò)增后做ELISA進(jìn)行陽(yáng)性克隆鑒定。將Ad7以1 μg/孔的量加入ELISA板，于4℃包被過(guò)夜。BSA封閉，然后分別加入制備好的噬菌體上清，于37℃保溫1 h，用PBST(PBS+0.3%Tween20)洗3次后，加入 HRP/Anti-M13 Monoclonal Conjugate(1∶5000稀釋)，于37℃保溫1 h，再用PBST洗3次。TMB顯色，測(cè)定OD450 nm值。ELISA鑒定為陽(yáng)性的噬菌體克隆，送測(cè)序公司測(cè)序。

1.2.2 抗多肽抗體的制備 將篩選到的多肽用BSA偶聯(lián)后，委托艾比瑪特生物醫(yī)藥(上海)有限公司(Abmart)制備兔多克隆抗體，并用相應(yīng)的多肽偶聯(lián)樹(shù)脂對(duì)制備的兔血清進(jìn)行純化。

1.2.3 非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)親和常數(shù) 采用非競(jìng)爭(zhēng)ELISA方法測(cè)定與7型腺病毒的親和常數(shù)[7]:分別用2 ×109、1 ×109、0.5 ×109、0.25 ×109的 Ad7 包被ELISA板，調(diào)整噬菌體濃度，并按1∶2～1∶256倍比稀釋，加至不同包被量的反應(yīng)孔中，加HRP/Anti-M13 Monoclonal Conjugate(1∶5 000 稀釋)，TMB 顯色，測(cè)OD450，根據(jù)抗原抗體結(jié)合的s曲線帶入公式Ka=(n-1)/(nAb′-Ab)計(jì)算親和常數(shù)，式中Ab和Ab′，分別表示當(dāng)抗原濃度為Ag和Ag′時(shí)，產(chǎn)生半數(shù)吸光值的抗體濃度(mol/L)，n=Ag/Ag′，當(dāng) n=2時(shí)，可得3個(gè)值，n=4時(shí)，可得2個(gè)值，n=8時(shí)，可得1個(gè)Ka值，求出6個(gè)Ka的均值作為最終結(jié)果。

1.2.4 免疫熒光 將生長(zhǎng)良好的293細(xì)胞接種于蓋玻片上，培養(yǎng)過(guò)夜，洗滌后，5%脫脂牛奶封閉1 h，加適量兔抗多肽抗體孵育1 h，洗滌后加FITC標(biāo)記的羊抗兔二抗，孵育1 h，PBS洗滌后，熒光顯微鏡觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 噬菌體肽庫(kù)淘選結(jié)果 經(jīng)四輪淘選后，ELISA鑒定的23個(gè)陽(yáng)性克隆(結(jié)果見(jiàn)圖1)送測(cè)序公司測(cè)序，結(jié)果有4 個(gè)(9#、118#、136#、138#)對(duì)應(yīng)的12 肽序列為GTSAFHKPTSFP(命名為GTS09)，且這4個(gè)克隆的ELISA值都很高(比陰性對(duì)照高出20倍以上)。

2.2 親和常數(shù)測(cè)定 采用非競(jìng)爭(zhēng)ELISA法測(cè)定GTS09-phage與Ad7的親和常數(shù)，結(jié)果如圖2所示。經(jīng)計(jì)算，親和常數(shù)為(1.93 ±0.72)×1010L/mol。

2.3 免疫熒光結(jié)果 將GTS09偶聯(lián)BSA后制備其兔多抗血清，再經(jīng)GTS09偶聯(lián)的樹(shù)脂純化后，得到抗GTS09的多抗。將此抗體與293細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光試驗(yàn)，結(jié)果如圖3所示，對(duì)照(無(wú)關(guān)兔抗體)與細(xì)胞幾乎沒(méi)有結(jié)合(圖3A)，而anti-GTS09特異的結(jié)合在293的細(xì)胞膜上(圖3B)。

圖1 23個(gè)陽(yáng)性克隆的ELISA結(jié)果Fig.1 ELISA of 23 positive clones

圖2 GTS09-phage與不同量的Ad7結(jié)合反應(yīng)的ELISA曲線Fig.2 ELISA curves of GTS09-phage to different amount of coated Ad7

圖3 anti-GTS09的免疫熒光結(jié)果(×200)Fig.3 Immunofluorescence of anti-GTS09 antibody on 293 cell(×200)

3 討論

腺病毒利用不同的受體黏附于細(xì)胞表面分子，然后穿入、內(nèi)化，導(dǎo)致細(xì)胞感染。在過(guò)去的幾年里，受體分子的研究進(jìn)展迅速，但是腺病毒許多血清型的特異性受體還沒(méi)有確定，也可能還有其他受體尚未發(fā)現(xiàn)。

我們利用7型腺病毒對(duì)噬菌體肽庫(kù)進(jìn)行篩選，得到了能特異結(jié)合7型腺病毒的結(jié)合多肽GTS09，其與噬菌體的復(fù)合物與7型腺病毒的親和常數(shù)可以達(dá)到1.93×1010L/mol，高于一般的抗原抗體的親和常數(shù)，我們制備了其多克隆抗體，與293細(xì)胞進(jìn)行免疫熒光實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)該抗體可以特異的結(jié)合于293細(xì)胞的細(xì)胞膜上，我們推測(cè)7型腺病毒的受體可能與GTS09有一定的同源性。展望未來(lái)，通過(guò)2D電泳、質(zhì)譜分析等技術(shù)，我們就有可能得到7型腺病毒的受體及其序列等信息，為該受體的發(fā)現(xiàn)和分離奠定基礎(chǔ)。

[1]Kawabata K，Tashiro K，Sakurai F，et al.Positive and negative regulation of adenovirus infection by CAR-like soluble protein，CLSP[J].Gene Ther，2007，14:1199-1207.

[2]Meier O，Greber UF.Adenovirus endocytosis[J].J Gene Med，2004，6:S152-S163.

[3]Zhang LL，He DL，Li X，et al.Overexpression of coxsackie and adenovirus receptor inhibit growth of human bladder cancer cell in vitro and in vivo[J].Acta Pharmacol Sin，2007，28(6): 895-900.

[4]Qin M，Escuadro B，Dohadwala M，et al.A novel role for the coxsackie adenovirus receptor in mediating tumor formation by lung cancer cells[J].Cancer Res，2004，64(18):6377-6380.

[5]Fok PT，Huang KC，Holland PC，et al.The Coxsackie and adenovirus receptor binds microtubules and plays a role in cell migration[J].J Biol Chem，2007，282(10):7512-7521.

[6]Zhang Y，Bergelson JM.Adenovirus receptors[J].J Virol，2005，79(19):12125-12131.

[7]Beatty JD，Beatty BG，Vlahos WG.Measurement of monoclonal antibody affinity by non-competitive enzyme immunoassay[J].J Immunol Methods，1987，100(1-2):173-179.

[收稿2013-12-01 修回2014-02-27]

(編輯 倪 鵬)

Screening and research of homologous peptide with adenovirus receptor

XU Yuan-Sheng，TIAN Xin-Gui，LIU Ming-Long，LI Chen-Yang，ZHOU Rong.State Key Lab of Respiratory Disease，the First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510120，China

Objective:To screen the binding peptide against adenovirus type 7(Ad7)and evaluate the relevance with the adenovirus receptor.MethodsBinding peptide against Ad7 was screened by panning the phage display 12 peptides library.The antibody against the selected peptide was prepared and was used to study the binding to the membrane by immunofluorescence technique.ResultsUsing Ad7 as the target protein，GTS09 peptide was selected from the phage display 12 peptides library by biopanning.GTS09-phage complex could significantly bind Ad7，with the affinity constant up to 1.93 × 1010L/mol;at the same time，immunofluorescence showed that antibody of GTS09 could specifically bind to membrane of 293 cell.ConclusionAntibody against GTS09 peptide could specifically bind to membrane of 293 cell，which shows that the peptide may presumably have homology with the cell receptors of Ad7.

Adenovirus type 7;Receptor;Peptide;Immunofluorescence

R392.11

A

1000-484X(2014)05-0651-03

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.018

①本文為中國(guó)博士后基金(2012M511780)。

許元生(1975年-)，男，博士，主要從事人源抗體和多肽藥物的研發(fā)工作。

及指導(dǎo)教師:周 榮(1965年-)，男，研究員，主要從事病毒學(xué)方面研究。