亞低溫對大鼠腦損傷后TNF-α、IL-1β及NF-κB表達(dá)的影響

王亞楠 張 勇 王 寧 劉鑫穎 (唐山市工人醫(yī)院檢驗(yàn)科，唐山063000)

亞低溫對大鼠腦損傷后TNF-α、IL-1β及NF-κB表達(dá)的影響

王亞楠①張 勇②王 寧 劉鑫穎 (唐山市工人醫(yī)院檢驗(yàn)科，唐山063000)

目的:觀察亞低溫治療對創(chuàng)傷性腦損傷大鼠腦組織腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor alpha，TNF-α)、白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)及核轉(zhuǎn)錄因子-κB(Nuclear factor-κB，NF-κB)表達(dá)的影響，探討亞低溫的腦保護(hù)作用及可能機(jī)制。方法:將45只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(Sham組)，腦損傷組(TBI組)，亞低溫治療組。采用Marmarou’s法建立創(chuàng)傷性腦損傷大鼠模型，損傷后立即開始誘導(dǎo)亞低溫，持續(xù)3 h，于傷后1 d、3 d、5 d分別處死各組大鼠留取腦組織。采用干濕重法測量腦組織含水量，免疫組織化學(xué)法及Western blot法檢測各組大鼠腦組織TNF-α、IL-1β及NF-κB的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果:與Sham組相比，TBI組大鼠腦組織含水量升高(P＜0.05)，3 d達(dá)水腫高峰，TNF-α、IL-1β和 NF-κB的表達(dá)顯著增加(P＜0.05)，均為1 d達(dá)高峰，持續(xù)高表達(dá)至5 d;與TBI組相比，亞低溫治療組大鼠各時間點(diǎn)腦組織含水量降低(P＜0.05)，TNF-α、IL-1β和NF-κB的表達(dá)明顯減少(P＜0.05)。結(jié)論:高表達(dá)的TNF-α、IL-1β和NF-κB參與了TBI的病理過程。亞低溫治療可通過下調(diào)NF-κB信號分子，減輕創(chuàng)傷性腦損傷后腦組織的炎性反應(yīng)，緩解腦水腫，進(jìn)而起到腦保護(hù)作用。

亞低溫;創(chuàng)傷性腦損傷;腦水腫;大鼠

創(chuàng)傷性腦損傷(Traumatic brain injury，TBI)是神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病，占全身各部位損傷的第二位，死亡率居第1位，有較高的致殘率和致死高，嚴(yán)重影響人類的健康[1]。隨著對腦損傷發(fā)病機(jī)制的深入研究，細(xì)胞因子在繼發(fā)性腦損傷中發(fā)揮的作用開始備受關(guān)注。其中 TNF-α、IL-1β 及 NF-κB 在 TBI誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)中起核心作用[2]。近幾年來，顱腦外傷的亞低溫治療開始被國內(nèi)外學(xué)者所重視。亞低溫可緩解腦組織繼發(fā)性損傷，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)，具有明顯的腦保護(hù)作用[3]。盡管亞低溫在TBI的實(shí)驗(yàn)研究和臨床治療中都取得了一定的成效，但其具體作用機(jī)制尚有待進(jìn)一步研究。然而，亞低溫治療對TBI后大鼠腦組織 TNF-α、IL-1β及NF-κB 表達(dá)影響的報(bào)道少見。本實(shí)驗(yàn)擬利用Marmarou’s法建立大鼠TBI模型，通過免疫組化與免疫印跡方法檢測TNF-α、IL-1β 及 NF-κB 的蛋白表達(dá)情況，并進(jìn)行細(xì)胞因子表達(dá)的相關(guān)性分析，驗(yàn)證亞低溫通過抑制NF-κB活化，下調(diào)炎性因子TNF-α和IL-1β的表達(dá)，阻斷炎癥級聯(lián)反應(yīng)，減輕或避免繼發(fā)性炎癥反應(yīng)引起的腦水腫，最終達(dá)到腦保護(hù)作用。以期為亞低溫治療腦損傷的臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑 兔抗大鼠 TNF-α、IL-1β及 NF-κB多克隆抗體均購自Cell Signaling Technology公司;小鼠抗大鼠β-actin單克隆抗體購自Santa Cruz公司;羊抗兔或羊抗小鼠IgG-AP二抗購自武漢博士德生物有限公司;BCIP/NBT試劑購自南京建成生物有限公司;SABC免疫組化試劑盒、BCA試劑盒、TRIzol裂解液及蛋白酶抑制劑等均購自武漢博士德生物有限公司;DAB顯色試劑盒購自福州邁新生物有限公司。

1.2 動物與分組 SPF清潔級成年健康雄性SD大鼠45只，體質(zhì)量(260±20)g，均由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供。將SD大鼠隨機(jī)分為三組:①假手術(shù)組(僅給予頭皮切開縫合，但不致傷)，②腦損傷組，③亞低溫治療組。根據(jù)各組取材時間點(diǎn)不同，每組又分為1 d、3 d、5 d三個亞組，每個亞組5只大鼠。

1.3 模型制備與亞低溫處理 參照改良Marmarou’s法[4]制備臨床常見的大鼠中度彌漫性腦創(chuàng)傷動物模型。腦損傷后立即將大鼠置于溫控環(huán)境中誘導(dǎo)亞低溫，誘導(dǎo)時間約為30 min，使大鼠肛溫控制在31℃ ～33℃，并持續(xù)3 h。

1.4 腦組織水含量測定 各組大鼠在各時間相斷頭并快速取腦組織，采用干濕重法測定水含量。用濾紙吸干腦表面水分，電子分析天平稱得濕重，后置入100℃烘箱烘烤至恒重，再稱其干重。按公式計(jì)

算腦組織水含量:腦組織水含量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.5 免疫組織化學(xué)染色 腦組織標(biāo)本經(jīng)常規(guī)固定、脫水透明、石蠟包埋、連續(xù)冠狀切片，按SABC免疫組化試劑盒說明進(jìn)行操作。60℃烤片60 min，脫蠟至水，3%H2O2滅活 15 min，抗原熱修復(fù)，5%BSA封閉20 min，甩干后分別滴加兔抗大鼠的TNF-α、IL-1β 及NF-κB 多克隆抗體(稀釋濃度均為1∶50)，4℃冰箱過夜。羊抗兔或羊抗小鼠的IgG室溫孵育30 min，SABC 室溫 20 min，DAB 顯色5 min，雙蒸水終止顯色，封片后置于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6 Western blot分析 取各組大鼠的皮層腦組織100 mg，蛋白裂解液裂解，12 000 r/min，4℃離心 15 min，收集上清液，-80℃保存?zhèn)溆?。進(jìn)行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離后，

轉(zhuǎn)移至PVDF膜上。5% 脫脂奶粉封閉1 h，兔抗大鼠的 TNF-α、IL-1β、NF-κB(稀釋濃度均為 1∶500)，小鼠抗大鼠β-actin(稀釋濃度為1∶500)，4℃孵育過夜。羊抗兔或羊抗小鼠的 IgG-AP，37℃孵育2 h，BCIP/NBT避光顯色5 min，雙蒸水終止顯色。以Image J軟件對蛋白表達(dá)條帶進(jìn)行灰度掃描及定量分析。以目標(biāo)蛋白與 β-actin蛋白平均吸光度值(OD值)的比值作為分析對象。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用Excel建庫，實(shí)驗(yàn)中所得數(shù)據(jù)均用x-±s表示，用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組間比較選用t檢驗(yàn)，單因素多組間比較用單因素方差分析，TNF-α和IL-1β與NF-κB相關(guān)關(guān)系采用 Pearson相關(guān)分析，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 腦組織含水量 Sham組腦組織含水量各時間點(diǎn)無明顯差異，TBI組1 d即出現(xiàn)明顯腦水腫，3 d水腫達(dá)高峰，5 d水腫逐漸消退，與Sham組相比均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。亞低溫治療組各時間點(diǎn)較TBI組腦組織含水量明顯減少(P＜0.05)。見表1。

2.2 腦皮質(zhì)TNF-α的定位表達(dá) TNF-α陽性細(xì)胞呈現(xiàn)棕褐色，主要分布在神經(jīng)細(xì)胞及炎性細(xì)胞的細(xì)胞漿及細(xì)胞膜。Sham組偶見 TNF-α陽性細(xì)胞。TBI組大鼠1 d在損傷灶及其周圍皮質(zhì)可見較多深棕褐色陽性細(xì)胞，3 d及5 d有所減少。與TBI組同時相相比，亞低溫治療組TNF-α陽性細(xì)胞明顯減少，見圖1。

表1 各組大鼠腦組織的含水量(%，±s，n=10)Tab.1 Water content of brain tissue in each group(%， ± s，n=10)

表1 各組大鼠腦組織的含水量(%，±s，n=10)Tab.1 Water content of brain tissue in each group(%， ± s，n=10)

Note:Compared with Sham group，1)P ＜0.05;compared with TBI group，2)P ＜0.05.

Groups 1 d 3 d 5 d Sham group 77.49 ±0.37 77.81 ±0.41 77.62 ±0.28 TBI group 82.39 ±0.391)83.96 ±0.281)82.64 ±0.271) Treatment group 79.03 ±0.262)80.15 ±0.332)79.98 ±0.322)

表2 腦組織中TNF-α蛋白表達(dá)的定量分析(OD值，±s，n=10)Tab.2 Quantitative analysis of TNF-α expression in brain tissue(OD value， ± s，n=10)

表2 腦組織中TNF-α蛋白表達(dá)的定量分析(OD值，±s，n=10)Tab.2 Quantitative analysis of TNF-α expression in brain tissue(OD value， ± s，n=10)

Note:Compared with Sham group，1)P ＜0.05;compared with TBI group，2)P ＜0.05.

028 TBI group 1.225 ±0.0461)1.014 ±0.0321)0.904 ±0.0411) Treatment group 0.841 ±0.0372)0.682 ±0.0352)0.585 ±0.0292) Groups 1 d 3 d 5 d Sham group 0.219 ±0.024 0.193 ±0.016 0.202 ±0.

表3 腦組織中IL-1β蛋白表達(dá)的定量分析(OD值，±s，n=10)Tab.3 Quantitative analysis of IL-1β expression in brain tissue(OD value， ± s，n=10)

表3 腦組織中IL-1β蛋白表達(dá)的定量分析(OD值，±s，n=10)Tab.3 Quantitative analysis of IL-1β expression in brain tissue(OD value， ± s，n=10)

Note:Compared with Sham group，1)P ＜0.05;compared with TBI group，2)P ＜0.05.

027 TBI group 1.472 ±0.0491)1.183 ±0.0371)1.003 ±0.0381) Treatment group 0.906 ±0.0422)0.741 ±0.0352)0.681 ±0.0262) Groups 1 d 3 d 5 d Sham group 0.236 ±0.023 0.274 ±0.018 0.292 ±0.

圖1 腦組織中TNF-α的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)Fig.1 Expression of TNF-α in brain tissue(Immunohistochemical staining，× 400)

圖2 腦組織中IL-1β的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)Fig.2 Expression of IL-1β in brain tissue(Immunohistochemical staining，× 400)

圖3 腦組織中NF-κB的表達(dá)(免疫組織化學(xué)染色，×400)Fig.3 Expression of NF-κB in brain tissue(Immunohistochemical staining，× 400)

表4 腦組織中NF-κB蛋白表達(dá)的定量分析(OD值，±s，n=10)Tab.4 Quantitative analysis of NF-κB expression in brain tissue(OD value， ± s，n=10)

表4 腦組織中NF-κB蛋白表達(dá)的定量分析(OD值，±s，n=10)Tab.4 Quantitative analysis of NF-κB expression in brain tissue(OD value， ± s，n=10)

Note:Compared with Sham group，1)P ＜0.05，compared with TBI group，2)P ＜0.05.

029 TBI group 0.968 ±0.0471)0.806 ±0.0381)0.764 ±0.0321) Treatment group 0.543 ±0.0362)0.415 ±0.0272)0.391 ±0.0212) Groups 1 d 3 d 5 d Sham group 0.285 ±0.025 0.279 ±0.033 0.309 ±0.

圖4 Western blot檢測腦組織中TNF-α蛋白的表達(dá)Fig.4 Expression of TNF-α in brain tissue by Western blot

圖5 Western blot檢測腦組織中IL-1β蛋白的表達(dá)Fig.5 Expression of IL-1β in brain tissue by Western blot

圖6 Western blot檢測腦組織中NF-κB蛋白的表達(dá)Fig.6 Expression of NF-κB in brain tissue by Western blot

2.3 腦皮質(zhì)IL-1β的定位表達(dá) IL-1β陽性細(xì)胞為細(xì)胞漿或細(xì)胞膜出現(xiàn)棕褐色顆粒，主要定位在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和浸潤的炎癥細(xì)胞。Sham組少見IL-1β的表達(dá)。TBI組大鼠皮質(zhì)區(qū)IL-1β陽性細(xì)胞較多，1 d達(dá)高峰，3 d及5 d有所減少。亞低溫治療組較TBI組同時間相相比IL-1β陽性細(xì)胞數(shù)減少。見圖2。

2.4 腦皮質(zhì)NF-κB的定位表達(dá) NF-κB陽性細(xì)胞呈現(xiàn)棕褐色，主要分布在細(xì)胞漿和細(xì)胞核。Sham組偶見NF-κB陽性細(xì)胞。TBI組大鼠1 d即在皮質(zhì)區(qū)出現(xiàn)較多NF-κB陽性細(xì)胞，傷后1 d即達(dá)高峰，3 d及5 d有所減少。與TBI組同時相相比，亞低溫治療組大鼠的NF-κB陽性細(xì)胞明顯減少。見圖3。

2.5 腦皮質(zhì)TNF-α的定量表達(dá) Sham組大鼠皮質(zhì)區(qū)僅有微量TNF-α表達(dá)，TNF-α蛋白表達(dá)量在各時間點(diǎn)無變化;TBI組TNF-α的表達(dá)較Sham組明顯增多(P＜0.05)，動態(tài)表達(dá)與免疫組化結(jié)果相吻合;亞低溫治療組TNF-α蛋白表達(dá)時程與TBI組相似，但表達(dá)減少，各時間點(diǎn)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。見圖4，表2。

2.6 腦皮質(zhì)IL-1β的定量表達(dá) Sham組大鼠皮質(zhì)區(qū)IL-1β蛋白呈弱表達(dá)，且表達(dá)量在各時間點(diǎn)無變化;與Sham組相比，TBI組TNF-α的表達(dá)明顯增多(P＜0.05)，動態(tài)表達(dá)與免疫組化結(jié)果相吻合;與TBI組同時相相比，亞低溫治療組TNF-α蛋白表達(dá)顯著減少(P ＜0.05)。見圖5，表3。

2.7 腦皮質(zhì)NF-κB的定量表達(dá) Sham組各時間相NF-κB有微量的基礎(chǔ)表達(dá);與Sham組相比，TBI組NF-κB的蛋白表達(dá)明顯增多(P＜0.05)，動態(tài)表達(dá)與免疫組化結(jié)果相吻合;亞低溫治療組NF-κB的蛋白表達(dá)與 TBI組同時相相比明顯減少(P＜0.05)。見圖6，表4。

2.8 相關(guān)性分析 創(chuàng)傷性腦損傷后損傷皮質(zhì)區(qū)NF-κB的蛋白表達(dá)與TNF-α的蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)(各組r值均大于0，假設(shè)檢驗(yàn)P＜0.01);同時與IL-1β的蛋白表達(dá)水平也呈正相關(guān)(各組r值均大于0，假設(shè)檢驗(yàn) P ＜0.01)。

3 討論

本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大鼠創(chuàng)傷后腦損傷后早期腦組織中 TNF-α、IL-1β和NF-κB升高，并維持高表達(dá)狀態(tài)至傷后5 d，提示可能這些細(xì)胞因子間的相互作用引起炎癥級聯(lián)反應(yīng)導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷的發(fā)生與發(fā)展。NF-κB是炎癥反應(yīng)中關(guān)鍵性核轉(zhuǎn)錄因子，在非激活狀態(tài)下，NF-κB與其抑制分子(I-κB)以無活性形式存在于胞漿中，不具備轉(zhuǎn)錄活性[5]，被激活后與I-κB發(fā)生解體，啟動效應(yīng)細(xì)胞中多種炎性因子的基因轉(zhuǎn)錄?；谶@些推知 TBI后 NF-κB被激活，NF-κB可誘導(dǎo)腦組織效應(yīng)細(xì)胞釋放大量炎性細(xì)胞因子，其中以TNF-α和IL-1β為主。二者主要來源小膠質(zhì)細(xì)胞，可使腦組織發(fā)生過度炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致繼發(fā)性腦損傷。

本實(shí)驗(yàn)就 TBI后 NF-κB的表達(dá)與 TNF-α(或IL-1β)的表達(dá)進(jìn)行了相關(guān)性分析，結(jié)果顯示NF-κB與 TNF-α(或 IL-1β)均呈正相關(guān)性，揭示 NF-κB 可能正向調(diào)控TNF-α和IL-1β蛋白的表達(dá)，從而引發(fā)炎癥反應(yīng)。TBI發(fā)生早期NF-κB的激活促進(jìn)TNF-α和IL-1β的釋放，同時，TNF-α和IL-1β的釋放同樣可以反過來激活 NF-κB，引發(fā)級聯(lián)放大效應(yīng)。這些細(xì)胞因子及其彼此間的相互作用共同維持組織過度的炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致腦水腫、顱內(nèi)壓升高、神經(jīng)細(xì)胞死亡及神經(jīng)功能損害等繼發(fā)性腦損傷。其中腦水腫是最主要的繼發(fā)性腦損傷，是多種因素參與的復(fù)雜過程[6]。腦水腫是創(chuàng)傷性腦損傷早期死亡的主要原因，因此TBI發(fā)生后早期及時有效地控制腦水腫，可提高患者存活率。炎癥反應(yīng)、自由基以及血管通透性的改變是腦水腫發(fā)生的主要機(jī)制。另外2013年 Rossi等[7]利用TBI小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)肌球蛋白輕鏈激酶(Myosin light-chain kinase，MLCK)增加腦組織的含水量，MLCK的抑制劑可緩解腦水腫，促進(jìn)神經(jīng)功能的恢復(fù)。本實(shí)驗(yàn)通過干濕重法測量各組大鼠腦組織的含水量，發(fā)現(xiàn)TBI后1 d即有明顯腦水腫出現(xiàn)，3 d達(dá)水腫高峰，水腫一直持續(xù)到傷后5 d。水腫高峰比炎性因子高峰出現(xiàn)的滯后性可以用腦水腫發(fā)生的炎癥機(jī)制解釋。

TBI后急性期的治療已經(jīng)日趨成熟，但是對于TBI后多種繼發(fā)性腦損傷的治療尚沒有好的方案。目前，減輕腦水腫正成為治療繼發(fā)性腦損傷的關(guān)鍵靶點(diǎn)。因?yàn)門BI后誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在腦水腫的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，所以通過抑制與炎性反應(yīng)相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)或釋放，對于腦水腫的治療有十分重要的意義。近年來，隨著亞低溫(28℃ ～35℃)對多種疾病治療的不斷推廣，多數(shù)國內(nèi)研究已證實(shí)亞低溫對TBI具有明顯的腦保護(hù)作用[8-10]。國外臨床研究顯示亞低溫可降低TBI患者的顱內(nèi)壓，改善腦神經(jīng)功能的恢復(fù)，顯著降低死亡率，且不產(chǎn)生任何嚴(yán)重并發(fā)癥[11]。據(jù)報(bào)道治療性亞低溫的多效性與潛在機(jī)制與如下幾點(diǎn)有關(guān):降低腦代謝率，為氧的供給和需求之間營造平衡;減少自由基的形成;減少興奮性神經(jīng)遞質(zhì)的產(chǎn)生;防止神經(jīng)細(xì)胞的死亡等[12，13]。Western blot結(jié)果顯示:TBI后給予亞低溫治療可顯著下調(diào)TNF-α、IL-1β和NF-κB的表達(dá)，同時降低腦組織含水量，促進(jìn)腦損傷的恢復(fù)。

本研究發(fā)現(xiàn) TNF-α、IL-1β 和 NF-κB 的高表達(dá)參與TBI的發(fā)生發(fā)展過程，成為腦水腫的形成機(jī)理之一。TBI后立即給予亞低溫治療可下調(diào)NF-κB活性，抑制炎性細(xì)胞因子TNF-α和IL-1β的合成和釋放，緩解炎癥級聯(lián)反應(yīng)所導(dǎo)致的腦水腫的形成。本次實(shí)驗(yàn)完善了亞低溫腦保護(hù)作用機(jī)制的研究，為亞低溫臨床應(yīng)用提供理論及實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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[收稿2013-10-15 修回2013-12-11]
(編輯 倪 鵬)

Effect of mild hypothermia on expression of TNF-α，IL-1β and NF-κB after traumatic brain injury in rats

WANG Ya-Nan，ZHANG Yong，WANG Ning，LIU Xin-Ying.Department of Laboratory，Tangshan Workers’Hospital，Tangshan 063000，China

Objective:To investigate the expression of TNF-α，IL-1β and NF-κB in the cortex after traumatic brain injury in rats，in order to further explore the protective effects and possible mechanisms of mild hypothermia treatment.MethodsThe forty-five SD rats were randomly divided into Sham group，TBI group，treatment group.Rats model of TBI were established via Marmarou′s method.The animals were sacrificed at 1 d，3 d and 5 d post-TBI.The brain tissue was taken out to measure the water content based on wetdry weight method.The expression of TNF-α，IL-1β and NF-κB proteins were detected by Immunohistochemistry and Western blot analysis.ResultsCompared with the Sham group，the brain water content was increased(P ＜0.05)，reached peak at 3 d post-TBI，the expression of TNF-α，IL-1β and NF-κB was significantly increased(P ＜0.05)，reached peak at 1 d，sustained higher expression to 5 d post-TBI.Mild hypothermia treatment remarkably reduced the brain water content(P ＜ 0.05)，down-regulated TNF-α，IL-1β and NF-κB expression in comparision to the TBI group(P ＜0.05).ConclusionThe higher expression of TNF-α，IL-1β and NF-κB in the cortex may play an important role in the pathogenesis of TBI.Mild hypothermia can suppress NF-κB signaling pathway，reduce inflammatory reactions，relieve cerebral edema，finally promoting brain injury recovery.

Mild hypothermia;Traumatic brain injury;Brain edema;Rats

R322.8

A

1000-484X(2014)05-0618-05

10.3969/j.issn.1000-484X.2014.05.010

①唐山市工人醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，唐山063000。

②通訊作者，E-mail:zy20131015@126.com。

王亞楠(1975年-)，女，主管檢驗(yàn)師，主要從事腦損方面的研究。