8種胞外酶在香菇不同生長階段的活性變化

王偉科，陸 娜，周祖法，宋吉玲，袁衛(wèi)東，閆 靜

（浙江省杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江 杭州 310024）

8種胞外酶在香菇不同生長階段的活性變化

王偉科，陸 娜，周祖法，宋吉玲，袁衛(wèi)東，閆 靜

（浙江省杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江 杭州 310024）

研究了香菇生長過程不同階段胞外酶纖維素酶系 （羧甲基纖維素酶、濾紙纖維素酶、β-葡萄糖苷酶）、木質(zhì)素酶系 （漆酶、愈創(chuàng)木酚酶、多酚氧化酶）、淀粉酶、半纖維素酶的活性變化。結(jié)果表明,香菇生長不同階段均能檢測(cè)到上述8種酶的活性,說明這些酶參與了香菇生長發(fā)育的全過程。各種酶活性峰值出現(xiàn)時(shí)間不盡相同,木質(zhì)素酶的活性高峰出現(xiàn)在營養(yǎng)生長期,纖維素酶的活性高峰出現(xiàn)在生殖生長期,說明香菇生長過程中優(yōu)先利用木質(zhì)素。8種酶活性在香菇生殖生長階段變化趨勢(shì)較一致,從原基形成到子實(shí)體成熟均呈現(xiàn)逐步下降趨勢(shì)。

胞外酶活性；香菇；不同生長階段；變化規(guī)律

香菇屬擔(dān)子菌綱、傘菌目、側(cè)耳科、香菇屬［1］,其主要栽培基質(zhì)是雜木屑。香菇生長過程中所需的營養(yǎng)主要通過菌絲向胞外分泌各種酶將木質(zhì)纖維素及其他有機(jī)大分子物質(zhì)降解后再吸收進(jìn)細(xì)胞,并轉(zhuǎn)化為蛋白及多糖等［2］獲取。研究不同培養(yǎng)條件對(duì)香菇胞外酶活性影響的報(bào)道較為多見,但對(duì)香菇從菌絲生長到子實(shí)體成熟采收全過程中的酶活性變化研究報(bào)道甚為少見,為此測(cè)定并分析了8種胞外酶在香菇生長過程6個(gè)重要階段的活性及變化過程,旨在深入了解香菇對(duì)栽培基質(zhì)的降解利用規(guī)律和生長發(fā)育過程中的生理變化,為栽培基質(zhì)配方的設(shè)置提供理論依據(jù)。現(xiàn)將有關(guān)結(jié)果報(bào)道如下。

l 材料與方法

1.1 菌種

香菇808引自縉云縣山農(nóng)農(nóng)產(chǎn)品科技開發(fā)有限公司。

1.2 培養(yǎng)基配方

雜木屑78%,麩皮20%,石膏1%和糖1%。

1.3 粗酶液提取

每一生長階段隨機(jī)挑取3個(gè)菌棒,搗碎后混勻,準(zhǔn)確稱取培養(yǎng)料2份,每份5 g。1份樣品加入25 m L去離子雙蒸水,40℃浸提2 h,5 000 r· min-1,4℃離心10 min,取上清液,得粗酶液。另1份樣品置于80℃下烘至恒重,稱重。

1.4 葡萄糖和木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

［3］的方法制作葡萄糖和木糖的標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y= 0.812X-0.037,R2=0.958 6,木糖標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程Y=0.780 3X-0.027 6,R2=0.983 4。

1.5 胞外酶活性測(cè)定與定義

羧甲基纖維素酶。往試管中加入0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液 （用pH值4.6,0.1 mol·L-1醋酸鹽緩沖液配制）1.5 m L,再加入粗酶液0.5 m L,混勻,50℃恒溫水浴保溫30 m in,取出后立即加入DNS試劑1.5 m L,煮沸5 min,取出,冷卻后加蒸餾水定容至20 m L,充分混勻。分光光度計(jì)540 nm波長處測(cè)光密度值 （D）,以煮沸滅活的酶液作對(duì)照,每組3次重復(fù),取平均值。酶活力單位定義：1 g干培養(yǎng)物中的酶量與底物作用30 min釋放出1 mg葡萄糖為1個(gè)活力單位 （U）。

濾紙纖維素酶。往試管中加入粗酶液0.5 m L,再加入濾紙條50 mg（新華定量濾紙,約1 cm×6 cm）,50℃恒溫水浴保溫1 h,其后操作與羧甲基纖維素酶活性測(cè)定相同。酶活力單位定義：1 g干培養(yǎng)物中的酶量與底物作用60 m in釋放出1 mg葡萄糖為1 U。

半纖維素酶。往試管中加入0.5% （用pH值4.6,0.1 mol·L-1醋酸鹽緩沖液配制）木聚糖溶液1.5 mL,加入粗酶液混勻,50℃水浴保溫1 h,其后操作與羧甲基纖維素酶活性測(cè)定相同。酶活力單位定義：1 g干培養(yǎng)物中的酶量與底物作用30 min釋放出1 mg木糖為1 U。

淀粉酶。往試管中加入0.5%的可溶性淀粉溶液（用pH值5.8,0.1 mol·L-1醋酸鹽緩沖液配制）1.5 m L,加粗酶液0.5 m L,混勻,38℃恒溫水浴保溫30 min,其后操作與羧甲基纖維素酶活性測(cè)定相同,并于520 nm測(cè) D值。酶活力單位定義：1 g干培養(yǎng)物中的酶量與底物作用30 min釋放出1 mg葡萄糖為1 U。

β-葡萄糖苷酶。取0.5 m L粗酶液,加入0.5 m L,10 mmol·L-1β-D-葡萄糖苷。將此反應(yīng)混合液37℃反應(yīng)2.5 h,待反應(yīng)結(jié)束后,立即加入2.5 mL,1 mol·L-1Na2CO3終止液終止反應(yīng),冷卻至室溫后在400 nm波長處測(cè)D值。另外,取相同條件的反應(yīng)液立即置于沸水浴中加熱5 min滅活后加入2.5 m L,1 mol·L-1Na2CO3溶液,作為空白對(duì)照。酶活力單位：1U指使底物改變0.01吸光度所需要的酶量。

漆酶。往試管中加入3.36 mmol·L-1的鄰聯(lián)甲苯胺0.5 mL和pH值4.6,0.1 mol·L-1醋酸緩沖液3.4 mL,樣品管中再加入粗酶液0.1 mL,對(duì)照管中加入煮沸滅活的粗酶液0.1 mL,混勻,28℃恒溫水浴保溫30 min,取出后立即于分光光度計(jì)600 nm波長測(cè)D值。酶活力以樣品與底物反應(yīng)30 min后的光密度的改變值表示。酶活力單位定義：1 g干培養(yǎng)物中的酶量每分鐘使D600值改變0.01為1 U。

多酚氧化酶。在試管中加入2.0 m L, 0.1 mol·L-1的鄰苯二酚,2.0 m L,0.05 mol·L-1的磷酸鉀 （pH值6.0）緩沖液和0.1 m L粗酶液。反應(yīng)液28℃保溫30 m in后立即用紫外分光光度計(jì)400 nm處測(cè)D值。酶活力單位定義：1 g干培養(yǎng)物30 min內(nèi)改變0.1個(gè)光密度值為1 U。

愈創(chuàng)木酚酶。取0.5 m L粗酶液,加入3 m L pH值4.6,0.1 mol·L-1乙酸鹽緩沖液,0.5 m L 80 mmol·L-1愈創(chuàng)木酚,28℃恒溫水浴反應(yīng)30 min,取出在600 nm處測(cè)定D值。1 U為使底物改變0.01吸光度所需要的酶量。

2 結(jié)果與分析

2.1 羧甲基纖維素酶、濾紙纖維素酶活性變化

從圖1可知,從發(fā)菌到子實(shí)體成熟整個(gè)過程看,羧甲基纖維素酶的活性呈現(xiàn)為先降后升再降的變化過程。在發(fā)菌期,羧甲基纖維素酶活性較為穩(wěn)定,基本維持在5 U左右；當(dāng)菌棒進(jìn)入轉(zhuǎn)色階段后,其活性稍有下降；而當(dāng)原基至幼菇形成階段,其活性又隨之升高；從幼菇生長到子實(shí)體成熟階段,其活性又呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。濾紙纖維素酶活性則在原基期至幼菇期達(dá)到峰值6.92 U,從幼菇到子實(shí)體成熟階段又表現(xiàn)為逐漸下降。

2.2 β-葡萄糖苷酶活性變化

從圖2可以看出,β-葡萄糖苷酶活性從菌絲發(fā)菌初期開始逐漸上升,到原基形成階段達(dá)到高峰,峰值為88.33 U,隨后隨著原基的分化和幼菇生長,其活性又逐漸下降,到子實(shí)體成熟階段,其活性也降至最低點(diǎn)。

圖1 不同香菇生長發(fā)育階段羧甲基纖維素酶、濾紙纖維素酶活力的變化

圖2 不同香菇生長發(fā)育階段β-葡萄糖苷酶活力的變化

2.3 半纖維素酶活性變化

試驗(yàn)結(jié)果 （圖3）表明,半纖維素酶活性變化表現(xiàn)為 “M”型走勢(shì),在菌絲營養(yǎng)生長階段緩慢上升,在菌絲滿袋到轉(zhuǎn)色期這一階段,其活性快速上升并達(dá)到高峰,峰值為5.24 U,原基形成階段稍有下降,到幼菇生長階段再次上升到5.13 U。從幼菇生長到子實(shí)體成熟階段的變化又表現(xiàn)為下降。

圖3 不同香菇生長發(fā)育階段半纖維素酶活力的變化

2.4 淀粉酶活性變化

圖4可知,淀粉酶活性在香菇整個(gè)生長發(fā)育階段呈現(xiàn)典型的先升后降趨勢(shì)。在營養(yǎng)生長階段活性變化不大,基本維持在2 U水平；當(dāng)菌棒進(jìn)入轉(zhuǎn)色階段時(shí),其活性迅速上升達(dá)到峰值5.14 U,隨著原基分化、幼菇形成直至最后子實(shí)體成熟,淀粉酶活性逐漸下降,子實(shí)體成熟采摘期淀粉酶活性降至最低。

圖4 不同香菇生長發(fā)育階段淀粉酶活力的變化

2.5 漆酶、愈創(chuàng)木酚酶和多酚氧化酶活性變化

漆酶、愈創(chuàng)木酚酶和多酚氧化酶的活性可以衡量香菇菌絲對(duì)木質(zhì)素的降解能力。結(jié)果 （圖5-6）表明,3種酶的活性變化趨勢(shì)表現(xiàn)十分相似。菌絲生長初期三者均表現(xiàn)為較高的活性,到菌絲滿袋階段活性均有所下降；當(dāng)菌棒進(jìn)入轉(zhuǎn)色階段后,三者的活性又呈現(xiàn)上升趨勢(shì)；此后又一致呈現(xiàn)為下降趨勢(shì)。三者在營養(yǎng)生長階段活性均高于生殖生長階段,說明對(duì)木質(zhì)素的利用集中在菌絲生長階段。

圖5 不同香菇生長發(fā)育階段漆酶、愈創(chuàng)木酶活力的變化

圖6 不同香菇生長發(fā)育階段多酚氧化酶活力的變化

3 小結(jié)與討論

試驗(yàn)結(jié)果表明,從纖維素酶系中的羧甲基纖維素酶、濾紙纖維素酶和 β-葡萄糖苷酶 3種酶的變化趨勢(shì)看,總體呈現(xiàn)出一定的相似性,均在原基和幼菇形成階段達(dá)到峰值,說明在這一階段培養(yǎng)基質(zhì)中大量的纖維素被降解利用,從而為香菇原基的分化和幼菇正常生長提供充足的碳源。

在木質(zhì)素降解過程中漆酶、多酚氧化酶、愈創(chuàng)木酚酶等酚氧化酶起著重要作用。香菇在菌絲生長階段的前期,漆酶、多酚氧化酶、愈創(chuàng)木酚酶的活性較高,這與馮志勇等［4］的研究結(jié)果相一致。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),漆酶、愈創(chuàng)木酚酶和多酚氧化酶在香菇生長發(fā)育的過程中變化趨勢(shì)十分相似,因此這3種酶對(duì)于分解木質(zhì)素是否具有相互促進(jìn)作用還有待于進(jìn)一步研究。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)：香菇胞外酶的木質(zhì)素降解酶活性高峰位于菌絲營養(yǎng)生長階段；纖維素降解酶的活性高峰集中出現(xiàn)在生殖生長階段；而非纖維木質(zhì)素酶系的半纖維素酶和淀粉酶活性高峰卻出現(xiàn)在轉(zhuǎn)色期。由此可見,一是香菇胞外酶系之間的活性變化可能存在一定的互補(bǔ)性,這更有利于充分降解利用栽培基質(zhì)中的各種營養(yǎng)成分,使得香菇生長發(fā)育過程中能獲得持續(xù)不斷的營養(yǎng)供給。另一方面也說明香菇生長發(fā)育過程中會(huì)優(yōu)先降解栽培基質(zhì)中的木質(zhì)素,這與張曉昱［5］研究相一致。即當(dāng)進(jìn)入生殖生長階段后,木質(zhì)素酶系活性會(huì)迅速降低,纖維素酶系活性則快速上升,促進(jìn)纖維素分解和利用,從而為原基形成、分化與生長提供能量。

在香菇整個(gè)生長發(fā)育過程中,菌棒轉(zhuǎn)色是一個(gè)十分關(guān)鍵且特有的階段。本次試驗(yàn)測(cè)定的8種胞外酶除了羧甲基纖維素酶活性在這一階段稍有下降外,其余7種酶的活性在這一階段均表現(xiàn)為上升趨勢(shì),而且其中有5種酶活性在這個(gè)階段形成峰值,之后又迅速下降。而香菇轉(zhuǎn)色成功與否與產(chǎn)量和質(zhì)量均具有密切的關(guān)系［6-7］,因此這些酶與香菇產(chǎn)量、品質(zhì)等是否具有相關(guān)性有待于進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：吳益?zhèn)ィ?/p>

S 646

：A

：0528-9017（2014）04-0498-03

文獻(xiàn)著錄格式：王偉科,陸娜,周祖法,等.8種胞外酶在香菇不同生長階段的活性變化 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2014（4）：498-501.

2014-02-11

杭州市科技發(fā)展計(jì)劃社會(huì)發(fā)展科研專項(xiàng) （20120433B11）

王偉科 （1981-）,男,浙江寧海人,農(nóng)藝師,大學(xué)本科,主要從事食用菌育種和栽培技術(shù)研究工作。E-mail：akeok@126.com。

袁衛(wèi)東,男,高級(jí)農(nóng)藝師,主要從事食用菌研究與推廣工作。E-mail：ywd0507@126.com。