鐵皮石斛組培快繁關(guān)鍵技術(shù)研究

吳 菊，嚴(yán)中琪，楊 飛，殷武平

（浙江省舟山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江 舟山 316000）

鐵皮石斛組培快繁關(guān)鍵技術(shù)研究

吳 菊，嚴(yán)中琪，楊 飛，殷武平

（浙江省舟山市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院,浙江 舟山 316000）

以鐵皮石斛種子和莖段為材料,研究鐵皮石斛快繁從原球莖誘導(dǎo)、增殖、分化,及壯苗生根的過(guò)程中不同時(shí)期的基本培養(yǎng)基及激素濃度和有機(jī)物等。結(jié)果表明,3/4MS為種子及莖段誘導(dǎo)、增殖、分化、壯苗生根階段較合適的基本培養(yǎng)基,且種子作為外植體誘導(dǎo)增殖效果較莖段好；原球莖誘導(dǎo)培養(yǎng)基3/4MS+1.0 mg· L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA,增殖激素濃度為1.0～2.0 mg·L-16-BA+0.1～0.2 mg·L-1NAA時(shí)效果最好,原球莖的分化激素配比為1.0 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-16-BA,壯苗和生根培養(yǎng)基為3/4MS+1.0 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-16-BA+10%馬鈴薯汁；有機(jī)添加物為10%的馬鈴薯汁,效果較好。

鐵皮石斛；組培；快繁

鐵皮石斛又名黑節(jié)草,是蘭科石斛屬多年生草本植物,為傳統(tǒng)名貴中藥,在 《神農(nóng)本草經(jīng)》中被列為上品,具有滋陰清熱、生津益胃、潤(rùn)肺止咳、潤(rùn)喉明目、延年益壽之功效,被稱(chēng)為中華九大“救命仙草”之首。鐵皮石斛含有石斛堿、石斛次堿等生物堿及石斛寧和多糖等成分,具有抗腫瘤、抗衰老和擴(kuò)張血管的作用［1-3］。然而,鐵皮石斛生長(zhǎng)對(duì)環(huán)境要求苛刻,自然條件下萌發(fā)率極低,加上其具有極高的藥用與經(jīng)濟(jì)價(jià)值,人們長(zhǎng)期無(wú)節(jié)制的采挖,致使野生鐵皮石斛資源愈來(lái)愈稀少,種源已臨枯竭,被列為瀕危種。為實(shí)現(xiàn)鐵皮石斛資源的可持續(xù)利用,多年來(lái)國(guó)內(nèi)外不少機(jī)構(gòu)對(duì)鐵皮石斛人工栽培技術(shù)進(jìn)行了研究,尤其是進(jìn)入21世紀(jì),我國(guó)研究人員在鐵皮石斛組培快繁技術(shù)方面的研究報(bào)道很多［4-8］。本研究在前人研究的基礎(chǔ)上,以鐵皮石斛為研究材料,系統(tǒng)地研究從外植體到原球莖誘導(dǎo),增殖、分化及試管苗壯苗、生根過(guò)程的技術(shù),為工廠(chǎng)化育苗提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

l.l 試驗(yàn)材料

以野生鐵皮石斛種子和一年生鐵皮石斛莖段為試材。

l.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 無(wú)菌系建立

種子。取鐵皮石斛成熟蒴果保持新鮮,未開(kāi)裂。采取人工授粉180 d以后,成熟,尚未開(kāi)裂蒴果,用洗潔精溶液清洗蒴果表面,并在自來(lái)水下面沖洗30 m in。用刀片輕輕削去表面臟物,沖洗干凈后,在超凈工作臺(tái)上用75%的酒精消毒30 s,然后用無(wú)菌水沖洗3次,然后再將莖段放入0.1%的HgCl2溶液中滅菌12 m im,滅菌過(guò)程中不斷輕輕搖動(dòng)燒杯使滅菌更加徹底,最后用無(wú)菌水沖洗5～6次,置于無(wú)菌濾紙上,表面水吸干后,用刀片從前端切去1段,使種子可以從前端孔處倒出,用鑷子夾住蒴果,將種子輕輕抖動(dòng)播在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

莖段。從生長(zhǎng)旺盛的1年生鐵皮石斛植株上選擇生長(zhǎng)健壯的莖段,摘去葉片和膜質(zhì)葉鞘,以莖芽為中心,芽的上下各留1 cm,取長(zhǎng)約2 cm的莖段,用洗潔精溶液浸泡20 m in,并在自來(lái)水下面沖洗30 min。在超凈工作臺(tái)上用75%的酒精消毒30 s,用無(wú)菌水沖洗3次,然后再將莖段放入0.1%的HgCl2溶液中滅菌10 mim,滅菌過(guò)程中不斷輕輕搖動(dòng)燒杯使滅菌更加徹底,最后用無(wú)菌水沖洗5～6次,然后將莖段放在無(wú)菌濾紙上,將莖段的前后分別切去0.2 cm,切成長(zhǎng)約0.5 cm左右的莖段,接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2.2 培養(yǎng)條件

在無(wú)菌室內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng),培養(yǎng)溫度 （25±1）℃,全光譜日光燈照射,光照強(qiáng)度為1 600～2 000 lx,光照時(shí)數(shù)12 h·d-1。

1.2.3 培養(yǎng)基的配制

根據(jù)不同試驗(yàn)階段配置不同基本培養(yǎng)基,以MS或1/2MS作為基本培養(yǎng)基,然后根據(jù)不同培養(yǎng)目的添加不同濃度的激素,糖和有機(jī)添加物等,培養(yǎng)基pH值5.8。加7.5 g·L-1的瓊脂粉。滅菌條件是121℃,0.105 MPa,滅菌時(shí)間為30 min。

l.3 研究?jī)?nèi)容

1.3.1 鐵皮石斛原球莖的誘導(dǎo)和增殖研究

外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選。采用 1/2MS,3/ 4MS,MS,B5,N6等5種基本培養(yǎng)基,附加1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA進(jìn)行不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛原球莖和擬原球莖誘導(dǎo)和增殖試驗(yàn)。

原球莖 （擬原球莖）誘導(dǎo)和增殖激素的篩選。將鐵皮石斛種子和莖段各自分別接種于含不同濃度的生長(zhǎng)素2,4-D,NAA,IBA和不同濃度的細(xì)胞分裂素6-BA和KT進(jìn)行生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素交互作用對(duì)原球莖 （擬原球莖）誘導(dǎo)和增殖試驗(yàn)。

原球莖增殖激素配比試驗(yàn)方法。選取相同條件下生長(zhǎng)良好的原球莖,約1.5 cm直徑的團(tuán)塊,分別接種到9種不同培養(yǎng)基,每種接種5瓶,每瓶接種3個(gè)原球莖團(tuán),35 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

天然有機(jī)附加物對(duì)原球莖 （擬原球莖）增殖影響研究。在3/4MS基本培養(yǎng)基中加1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA條件下,分別添加20%的椰乳、馬鈴薯汁、香蕉泥、番茄汁,考察原球莖的增殖率和苗的健壯程度。

1.3.2 鐵皮石斛原球莖分化培養(yǎng)基激素的篩選

以3/4MS為基本培養(yǎng)基,取相同條件下生長(zhǎng)良好的原球莖,切成1.5 cm直徑的團(tuán)塊,分別接種到附加NAA,6-BA和KT等培養(yǎng)基上進(jìn)行激素配比篩選試驗(yàn),每種培養(yǎng)基接種10瓶,每瓶接種3個(gè)原球莖團(tuán),45 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

1.3.3 鐵皮石斛試管苗壯苗和生根研究

以3/4MS為培養(yǎng)基,研究不同添加物及不同激素配比對(duì)鐵皮石斛試管苗壯苗和生根的影響。取株高為1～2 cm,具有1～2片真葉的無(wú)根叢生苗,分別接種到不同培養(yǎng)基中。每種培養(yǎng)基接10瓶,每瓶接6株小苗,分別于45 d和60 d后統(tǒng)計(jì)結(jié)果。

2 結(jié)果和分析

2.l 鐵皮石斛原球莖的誘導(dǎo)和增殖

2.1.1 不同外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基篩選

采用1/2MS,3/4MS,MS,B5,N6等5種基本培養(yǎng)基,附加1.0 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA進(jìn)行不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛不同外植體的原球莖 （擬原球莖）誘導(dǎo)和增殖試驗(yàn)。

由表1可以看出,種子在這5種培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率均較高,且種子比莖段的誘導(dǎo)率高,而誘導(dǎo)時(shí)間不同,培養(yǎng)基差異不明顯。相比而言,MS培養(yǎng)基上種子的誘導(dǎo)率較高,其中3/4MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率最高,為85%,可見(jiàn)種子萌發(fā)及發(fā)育需要鹽分較高的培養(yǎng)基,但過(guò)高的鹽分也會(huì)使種子萌發(fā)率下降,原球莖顏色偏黃。在不同培養(yǎng)基上,種子誘導(dǎo)的原球莖均為魚(yú)籽狀,較小,量大,顏色為淡綠色或綠色；莖段產(chǎn)生的愈傷較小,有擬原球莖產(chǎn)生,但量比較少。B5和N6培養(yǎng)基誘導(dǎo)率較高,誘導(dǎo)率達(dá)60%～70%,原球莖或擬原球莖顏色為淡綠或黃綠色。總體看來(lái),3/4MS培養(yǎng)基效果最好,以種子作為外植體的原球莖產(chǎn)生的數(shù)量大,快繁速度優(yōu)于莖段。

表1 不同外植體誘導(dǎo)培養(yǎng)基對(duì)原球莖 （擬原球莖）誘導(dǎo)情況

由表2,3可以看出,這5種基本培養(yǎng)基以3/ 4MS培養(yǎng)基增殖系數(shù)最高,為10.5,且健壯程度最高；其次是B5和N6,且健壯程度較高；種子平均增殖系數(shù)為8.5,顯著高于莖段的3.7,種子的年增殖率為8.36×109顯著高于莖段的6.58×106,種子的原球莖增殖速度顯著高于莖段,且原球莖綠色,較小,節(jié)間短。

2.1.2 擬原球莖誘導(dǎo)激素的篩選

將莖段分別接種于以3/4MS為基本培養(yǎng)基,含不同濃度的生長(zhǎng)素2,4-D,NAA,IBA和不同濃度的細(xì)胞分裂素6-BA進(jìn)行生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素交互作用對(duì)擬原球莖誘導(dǎo)和增殖試驗(yàn)。

表2 不同培養(yǎng)基、外植體對(duì)原球莖增殖情況

表3 種子及莖段外植體原球莖平均增殖情況比較

由試驗(yàn)結(jié)果表4可知,不同處理對(duì)擬原球莖的誘導(dǎo)影響有顯著差異,6-BA+NAA激素組合的平均擬原球莖誘導(dǎo)率51.94%,高于其他激素組合,同時(shí)誘導(dǎo)時(shí)間為20.25 d,總體比較短,處理2組合的擬原球莖誘導(dǎo)率最高,為60.00%,但NAA濃度過(guò)高,原球莖較松散且有玻璃化現(xiàn)象,所以擬原球莖的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg· L-1NAA,誘導(dǎo)率達(dá)60.00%,誘導(dǎo)時(shí)間最短,僅為17 d。

2.1.3 原球莖增殖激素的篩選

在鐵皮石斛組織培養(yǎng)過(guò)程中,原球莖增殖是關(guān)鍵環(huán)節(jié),原球莖增殖是用最短的時(shí)間獲得大量組培苗的有效方法,其中影響原球莖增殖系數(shù)的一個(gè)關(guān)鍵因素是培養(yǎng)基中激素濃度的配比。為研究激素配比對(duì)石斛原球莖增殖的影響,以3/4MS為基本培養(yǎng)基,添加6-BA和NAA等激素進(jìn)行配比試驗(yàn),表5表明,6-BA和NAA配合使用有利于原球莖的增殖,原球莖生長(zhǎng)狀況良好,原球莖簇生,較為松散、淡綠色；且處理1～6的原球莖生長(zhǎng)還比較健壯,顏色為綠色或淡綠色,原球莖為致密或較松散,增殖系數(shù)隨處理濃度的提高而增加；隨著6-BA和NAA濃度的提高,即處理7～9增殖系數(shù)最高,為6.17～9.13,但玻璃化現(xiàn)象越來(lái)越嚴(yán)重,原球莖為黃綠色,甚至透明,更松散。這表明：較高濃度的6-BA配合較低濃度的NAA,有利于原球莖的增殖,但濃度過(guò)高會(huì)引起玻璃化現(xiàn)象,原球莖不健康,造成畸形,根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果：較為理想的原球莖增殖激素濃度為1.0～2.0 mg·L-16-BA+0.1～0.2 mg· L-1NAA。

表4 擬原球莖誘導(dǎo)激素種類(lèi)的篩選

表5 6-BA與NAA濃度對(duì)原球莖增殖的影響

2.1.4 天然有機(jī)附加物對(duì)原球莖增殖影響研究

在3/4MS基本培養(yǎng)基加1.0 mg·L-16-BA+ 0.1 mg·L-1NAA條件下,分別添加20%的椰乳、馬鈴薯汁、香蕉泥、番茄汁,考查原球莖的增殖率和苗的健壯程度。

由表6可見(jiàn),4種天然有機(jī)添加物對(duì)鐵皮石斛苗增殖的影響不同,椰子汁與馬鈴薯汁效果最好,且兩者差異不顯著,組培苗均較粗壯,葉色濃綠。香蕉泥增殖效果次之,苗長(zhǎng)勢(shì)一般,葉色稍淺,但與前兩者差異極顯著,番茄汁增殖效果最差,且組培苗細(xì)弱發(fā)黃。

表6 天然有機(jī)添加物對(duì)幼苗增殖率的影響

2.2 鐵皮石斛分化培養(yǎng)基激素的篩選

為研究不同激素配比對(duì)鐵皮石斛原球莖分化的影響,以3/4MS為基本培養(yǎng)基,附加NAA,6-BA和KT等進(jìn)行激素配比試驗(yàn)。培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計(jì)原球莖分化的情況,結(jié)果如表7所示。 （1）添加一定濃度的NAA,6-BA,KT,可以增加分化芽數(shù)。處理①不使用激素的分化芽數(shù)最少,為30個(gè)；處理④,⑤,⑧之間差異不顯著,分化芽數(shù)較多,為60個(gè)左右,其中,處理⑧的效果最好,分化芽數(shù)為65個(gè)。處理④,⑤,⑧與處理⑥,⑦間差異顯著,而處理⑥,⑦與處理①,②,③間差異顯著,這表明1.0～2.0 mg·L-1NAA與0.1～0.2 mg· L-16-BA對(duì)原球莖的分化有較好的促進(jìn)作用,且苗的健壯度和整齊度較好,1.0 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1KT的激素組合,原球莖的分化率最高,健壯度較好,但整齊度一般,原球莖增殖較多。據(jù)此建議原球莖的分化激素配比為1.0 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-16-BA,分化率較高,健壯度、整齊度最好。

2.3 鐵皮石斛壯苗及生根

為研究不同添加物對(duì)石斛試管苗壯苗和生根的影響,以3/4MS為基本培養(yǎng)基,附加NAA,6-BA, IBA和有機(jī)物馬鈴薯汁,培養(yǎng)45 d后統(tǒng)計(jì)壯苗和生根情況 （表8）。（1）培養(yǎng)基中不添加任何植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和馬鈴薯汁,植株長(zhǎng)勢(shì)差,葉色淡綠,健壯度低。（2）在培養(yǎng)基中加入較高濃度的NAA（1～2 mg·L-1）和較低濃度的6-BA（0.1～0.2 mg·L-1）,以及馬鈴薯汁,試管苗的葉色更綠,長(zhǎng)勢(shì)更強(qiáng),健壯程度也會(huì)提高。在苗的生長(zhǎng)勢(shì)均較強(qiáng)的情況下,盡量降低植物生長(zhǎng)素的使用濃度,以利于提高組培苗移栽成活率,所以建議壯苗培養(yǎng)基為1.0 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-16-BA+10%馬鈴薯汁。

表7 不同激素對(duì)原球莖分化的影響

表8 不同激素及添加物對(duì)試管苗壯苗的影響

當(dāng)分化后的小苗長(zhǎng)成1～2 cm高,并分化出1～2片葉片時(shí),將小苗接種在小苗生根培養(yǎng)基上,接種60 d后記錄生根情況。無(wú)根小苗在接種20 d后開(kāi)始出現(xiàn)根的分化,在莖基部或節(jié)上出現(xiàn)淺黃綠色突起,尖端顏色較淺,長(zhǎng)度約1 mm。接種60 d后各處理的生根率在10%～65%。平均根長(zhǎng)在2.43～4.10 cm,平均根數(shù)在5～12條,根為淺綠色,根表面光滑,一些小苗長(zhǎng)出氣生根,氣生根特點(diǎn)是其表面有白色茸毛組成的根被。表9研究了不同濃度的NAA,6-BA,IBA及馬鈴薯汁對(duì)試管苗生根的影響 （表9）,當(dāng)不用任何激素和有機(jī)添加物時(shí),60 d后生根率最低,僅為20%,平均根數(shù)也最少為5條,平均根長(zhǎng)最短為2.43 cm,生長(zhǎng)勢(shì)也較弱,使用一定濃度的生長(zhǎng)素NAA,配合一定濃度的6-BA,和添加10%的馬鈴薯汁對(duì)生根誘導(dǎo)有明顯的促進(jìn)作用,其中處理④和⑤組合的生根率相對(duì)較高,分別為60%和65%,平均根數(shù)和根長(zhǎng)及生長(zhǎng)勢(shì)綜合表現(xiàn)最好。建議生根植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑為1.0～2.0 mg·L-1NAA+0.1～0.2 mg·L-16-BA,并添加10% 的馬鈴薯汁。

表9 不同激素配比及添加物對(duì)試管苗生根的影響

3 小結(jié)

采用1/2MS,3/4MS,MS,B5,N6等5種基本培養(yǎng)基,附加1.0 mg·L-1NAA+0.5 mg·L-16-BA進(jìn)行不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛不同外植體的原球莖 （擬原球莖）誘導(dǎo)和增殖的影響,發(fā)現(xiàn)3/ 4MS為種子及莖段誘導(dǎo)最合適的基本培養(yǎng)基,且種子作為外植體,原球莖產(chǎn)生的數(shù)量大,從快繁速度上優(yōu)于莖段,種子誘導(dǎo)原球莖增殖速度顯著高于莖段,即種子做為外植體誘導(dǎo)增殖效果較莖段好。

莖段在3/4MS的基本培養(yǎng)基,在不同濃度的生長(zhǎng)素2,4-D,NAA,IBA和不同濃度的細(xì)胞分裂素6-BA進(jìn)行生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素交互作用對(duì)擬原球莖誘導(dǎo)和增殖試驗(yàn)得出,莖段的誘導(dǎo)培養(yǎng)基1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg·L-1NAA組合下,誘導(dǎo)率最高可達(dá)60.00%,誘導(dǎo)時(shí)間最短,僅為17 d。原球莖增殖激素濃度為1.0～2.0 mg·L-16-BA +0.1～0.2 mg·L-1NAA時(shí)效果最好。

在3/4MS基本培養(yǎng)基加1.0 mg·L-16-BA+ 0.1 mg·L-1NAA條件下,分別添加20%的椰乳、馬鈴薯汁、香蕉泥、番茄汁,考查天然有機(jī)附加物對(duì)原球莖 （擬原球莖）增殖影響結(jié)果表明,椰子汁與馬鈴薯汁效果最好,且兩者差異不顯著,組培苗均較粗壯,葉色濃綠。有機(jī)物因地制宜采用本地資源馬鈴薯較為適宜,效果較好。

以3/4MS為基本培養(yǎng)基,附加NAA,6-BA和KT等進(jìn)行激素配比試驗(yàn)研究不同激素配比對(duì)鐵皮石斛原球莖分化的影響,結(jié)果表明,原球莖的分化激素配比為1.0 NAA+0.1 mg·L-16-BA,分化率較高,健壯度、整齊度最好。

以3/4MS為基本培養(yǎng)基,附加NAA,6-BA, IBA和有機(jī)物馬鈴薯汁研究不同添加物對(duì)石斛試管苗壯苗和生根的影響得出,壯苗培養(yǎng)基為1.0 mg· L-1NAA+0.1 mg·L-16-BA+10%馬鈴薯汁。生根培養(yǎng)基為1.0～2.0 mg·L-1NAA+0.1～0.2mg· L-16-BA,并添加10%馬鈴薯汁。

4 討論

4.l 不同外植體研究

可用于鐵皮石斛離體快繁的外植體有莖尖、莖節(jié)、葉片、花梗、側(cè)芽、腋芽和種子等類(lèi)型,據(jù)調(diào)查,現(xiàn)在生產(chǎn)應(yīng)用最多是種子和莖段的快繁,由種子離體培養(yǎng)產(chǎn)生的胚性組織稱(chēng)為原球莖,莖尖、莖段等誘導(dǎo)形成的胚性組織稱(chēng)為擬原球莖。

種子作為外植體相比莖段,原球莖產(chǎn)生的數(shù)量多大,從快繁速度上優(yōu)于莖段,種子的年增殖率為8.36×109,顯著高于莖段的6.58×106；種子誘導(dǎo)原球莖增殖速度顯著高于莖段,即種子作為外植體誘導(dǎo)增殖效果較莖段好。且種子誘導(dǎo)萌發(fā)后,約40 d左右轉(zhuǎn)接1次,基本培養(yǎng)基選擇3/4MS,用較低濃度的植物生長(zhǎng)素,原球莖增殖激素濃度為1.0～2.0 mg·L-16-BA+0.1～0.2 mg·L-1NAA,原球莖的分化激素配比為1.0 mg·L-1NAA +0.1 mg·L-16-BA；壯苗培養(yǎng)基為1.0 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-16-BA+10%馬鈴薯汁。生根培養(yǎng)基為1.0～2.0 mg·L-1NAA+0.1～0.2 mg·L-16-BA,并添加10%馬鈴薯汁。只要及時(shí)轉(zhuǎn)接,原球莖和幼苗生長(zhǎng)健壯,成苗周期相對(duì)較短,基本上從播種到瓶苗移出,可以控制在8個(gè)月左右,且苗的移栽成活率在95%以上。

4.2 基本培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛快繁的影響

在組織培養(yǎng)中,各種營(yíng)養(yǎng)元素主要從培養(yǎng)基中獲得,氧、氫元素從水中得到。礦物元素主要靠加入適量的無(wú)機(jī)鹽類(lèi)提供。常用的氮素有硝態(tài)氮和氨態(tài)氮,大多數(shù)培養(yǎng)基都以硝態(tài)氮為主。植物組織從培養(yǎng)基中吸收硝態(tài)氮以后,經(jīng)過(guò)一系列的反應(yīng)轉(zhuǎn)化成氨基酸,進(jìn)一步合成蛋白質(zhì)。不同配方所采用的鹽類(lèi)及其數(shù)量有所差異,甚至出入很大,常根據(jù)培養(yǎng)基中含鹽量的不同將培養(yǎng)基分為4大類(lèi)［8］：第1類(lèi)富集元素平衡培養(yǎng)基即高鹽培養(yǎng)基,如 MS, LS,BL,ER等；第2類(lèi)為高硝酸鉀類(lèi)培養(yǎng)基,如B5,N6等；第3類(lèi)中無(wú)機(jī)鹽含量的培養(yǎng)基,如H, Nitch；第4類(lèi)為低無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基如White,WS, HE。目前使用最廣泛的培養(yǎng)基為MS,其特點(diǎn)是高含量的氮、鉀,尤其是硝酸鹽的用量大,且含有一定數(shù)量的銨鹽,因此營(yíng)養(yǎng)豐富,能支持培養(yǎng)材料快速生長(zhǎng)。

本試驗(yàn)采用1/2MS,3/4MS,MS,B5,N6等5種基本培養(yǎng)基,附加1.0 mg·L-1NAA+0.5 mg· L-16-BA進(jìn)行不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛不同外植體的原球莖 （擬原球莖）誘導(dǎo)和增殖的影響,發(fā)現(xiàn)3/4MS為種子及莖段誘導(dǎo)最合適的基本培養(yǎng)基,1/ 2MS培養(yǎng)基鹽分較低,原球莖顏色為淡綠色,3/ 4MS和MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率較高,其中3/4MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)率最高,為85%,可見(jiàn)種子萌發(fā)及發(fā)育需要鹽分較高的培養(yǎng)基,但過(guò)高的鹽分也會(huì)使種子萌發(fā)率稍微下降,原球莖顏色偏黃。

在原球莖增殖分化階段用3/4MS基本培養(yǎng)基,配合適當(dāng)濃度的激素,效果較好,原球莖簇生、健壯、致密、綠色；壯苗生根階段用3/4MS培養(yǎng)基,配合1.0 mg·L-1NAA+0.1 mg·L-16-BA+10%馬鈴薯汁,苗的健壯度最好。

4.3 生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑與原球莖誘導(dǎo)增殖和分化成苗

在培養(yǎng)基的各種成分中,植物激素的作用是獨(dú)特的。一般來(lái)說(shuō),大多數(shù)植物在任何一種基本培養(yǎng)基上的生長(zhǎng)狀況是相似的,基本培養(yǎng)基可保證植物材料的生存與最低的生理活動(dòng)。但是若要植物進(jìn)行細(xì)胞分裂、愈傷組織的誘導(dǎo)、分化和再生,根、芽的分化以及胚狀體的發(fā)育等一系列生理活動(dòng),則必須用植物激素來(lái)調(diào)節(jié)。本試驗(yàn)在不同濃度的2,4-D,NAA,IBA和不同濃度的6-BA進(jìn)行生長(zhǎng)素和細(xì)胞分裂素交互作用對(duì)擬原球莖誘導(dǎo)和增殖試驗(yàn)得出：莖段的誘導(dǎo)培養(yǎng)基1.0 mg·L-16-BA+0.2 mg· L-1NAA組合下,誘導(dǎo)率最高可達(dá)60.00%,誘導(dǎo)時(shí)間最短,僅為17 d。原球莖增殖激素濃度為1.0～2.0 mg·L-16-BA+0.1～0.2 mg·L-1NAA時(shí)效果最好。

本試驗(yàn)在原球莖分化與幼苗生長(zhǎng)階段,使用較高濃度的生長(zhǎng)素,配合較低濃度的細(xì)胞分裂素,即壯苗階段培養(yǎng)基為1.0 mg·L-1NAA+ 0.1 mg·L-16-BA+10%馬鈴薯汁。生根培養(yǎng)基為1.0～2.0 mg·L-1NAA+0.1～0.2 mg·L-16-BA,并添加10%馬鈴薯汁,鐵皮石斛苗長(zhǎng)勢(shì)最好,生根速度較快,這一結(jié)論說(shuō)明了較高濃度的NAA與較低濃度的6-BA的配合有利于幼苗生長(zhǎng)和生根,且效果較好。單獨(dú)使用NAA或2,4-D,對(duì)幼苗生長(zhǎng)效果并不好,說(shuō)明同一類(lèi)激素不同種類(lèi)間的效應(yīng)差異和植物物種或品種對(duì)激素反應(yīng)的特異性,反映了激素作用的復(fù)雜性,因此植物組培的不同階段激素配比試驗(yàn)是組培能否成功的關(guān)鍵。

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（責(zé)任編輯：張瑞麟）

S 567

：A

：0528-9017（2014）04-0492-06

文獻(xiàn)著錄格式：吳菊,嚴(yán)中琪,楊飛,等.鐵皮石斛組培快繁關(guān)鍵技術(shù)研究 ［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2014（4）：492-497.

2013-12-09

舟山市科技計(jì)劃項(xiàng)目 （10123）

吳 菊 （1979-）,江蘇睢寧人,農(nóng)藝師,本科,從事植株組培快繁、蔬菜無(wú)土栽培技術(shù)研究工作。E-mail：wuju-79-2000 @tom.com。