三 種 色 譜 前 處 理 方 法 的 比 較

陳明星， 關(guān) 妍， 潘 偉， 章 斐， 鄒 洪

(1.北京大學(xué) 化學(xué)與分子工程學(xué)院，北京 100871; 2.首都師范大學(xué) 化學(xué)系，北京 100048)

0 引 言

儀器分析教學(xué)中，理論和實際操作相結(jié)合的教學(xué)方法對于學(xué)生掌握各種分析測試技術(shù)和方法是非常重要的，當前，很多高校儀器分析理論教學(xué)多采用CAI(多媒體計算機輔助教學(xué))的方式，將分析儀器的原理，構(gòu)造等生動的表現(xiàn)出來[1-3]。除了理論教學(xué)以外，儀器分析實驗在整個儀器分析教學(xué)過程中占有很重要的位置，起到很重要的作用，儀器分析實驗的過程，也就是理論聯(lián)系實際的過程[4-7]。

在具體實施過程中如何讓學(xué)生深入的理解和掌握課堂上的理論知識，答案是顯而易見的，那就是：設(shè)計出一種合適的實驗教學(xué)方法。

色譜技術(shù)是生命科學(xué)、材料科學(xué)、環(huán)境科學(xué)等必不可少的手段和工具。根據(jù)最近的統(tǒng)計在全世界各類分析儀器中氣相色譜儀和液相色譜儀的營銷總額占25%～30%[8],色譜分析的全過程主要包括三個步驟：樣品的采集處理、樣品中各組分的分離測定、樣品測定后數(shù)據(jù)的處理與結(jié)果的表達。其中樣品的采集處理步驟是一個非常重要的和復(fù)雜的過程。據(jù)統(tǒng)計，在大部分色譜分析實驗室中，樣品的前處理所占用的時間占分析測試過程總時間的60%～70%，而色譜儀器測定分析樣品的時間只約占10%，其余的時間是用于樣品測定結(jié)果的整理和分析等[9]。而且樣品前處理的好壞直接影響到后續(xù)的測試結(jié)果，因此，樣品前處理這一項在色譜的實驗教學(xué)過程中是絕對不能忽略的。

在工作中以及經(jīng)過調(diào)研后發(fā)現(xiàn)，受色譜教學(xué)實驗條件以及時間等因素的限制，目前本科生色譜實驗教學(xué)過程偏重于分離、儀器操作和數(shù)據(jù)處理方面的練習[10-14]，沒有涉及到前處理這一項，從而使得學(xué)生只有理論知識，缺乏實際操作經(jīng)驗。造成學(xué)生對色譜前處理概念淡薄，重視程度不夠，還有相當一部分學(xué)生不知道如何去進行樣品前處理。為了解決這個問題，有必要開發(fā)建立一種包含色譜前處理技術(shù)并適合教學(xué)的實驗方法。

常用的色譜前處理方法包括溶劑萃取(液液萃取、液固萃取、液氣萃取)、蒸餾、固相萃取、微萃取(固相微萃取、液相微萃取、毛細管固相微萃取)、超臨界流體萃取、衍生化技術(shù)、微波萃取等。其中，溶劑萃取和固相萃取方法重現(xiàn)性好，易于操作，被采用的最多，也最為普及。微萃取技術(shù)，尤其是固相微萃取以其操作簡單，樣品用量少、無需使用溶劑、萃取后可直接色譜進樣等諸多優(yōu)點，發(fā)展很快，但是由于重現(xiàn)性相對較差，設(shè)備裝置價格比較昂貴，成本較高，尚未普及。而超臨界流體萃取、衍生化技術(shù)和微波萃取等前處理方法主要針對于一些特殊樣品，不適合用于本科生教學(xué)實驗。

本實驗從本科生實驗教學(xué)角度出發(fā)，利用液液萃取、固相萃取、液相微萃取三種常見前處理方法，以水中的鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)為研究對象，結(jié)合氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，考察了影響萃取效果的主要因素，優(yōu)化了萃取條件，對三種常用的色譜前處理方法的處理效果以及特點進行了比較研究。

鄰苯二甲酸酯，又稱酞酸酯，縮寫PAEs，是鄰苯二甲酸形成的酯的統(tǒng)稱。常用作增塑劑和軟化劑，PAEs與塑料本身很難牢固結(jié)合，很容易從中溶解出來，從而進入環(huán)境。也是環(huán)境激素類物質(zhì)[15],含較弱的雌性荷爾蒙活性成分，在人和動物體內(nèi)起著類似雌性激素的作用，可導(dǎo)致內(nèi)分泌紊亂、生殖機能失常等，過多地暴露在PAEs 中可能會導(dǎo)致男性比例下降、女性早熟以及乳腺癌[16]。水中PAEs主要來源于生產(chǎn)和使用PAEs的工廠,農(nóng)用塑料薄膜、驅(qū)蟲劑及塑料垃圾等經(jīng)雨水淋洗、土壤浸潤等,也會導(dǎo)致PAEs進入水體[17]。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與裝置

Agilent 7890A/5975C氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(DB-5MS 30 m×0.32 mm i.d.×0.25 μm石英毛細管柱)，Agilent BondElut Plexa C18固相萃取小柱(3 mL，200 mg)，VORTEX-GENIE2震蕩混合器，Merk MILIPORE MILIQ-A超純水機，SUPELCO 12位固相萃取裝置，八方世紀BF-2000氮氣吹干儀。

1.2 主要試劑與材料

鄰苯二甲酸二甲酯(DMP) ，鄰苯二甲酸二乙酯(DEP) ，鄰苯二甲酸二丁酯(DBP) ，鄰苯二甲酸二異丁酯(DIBP) ，鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP) ，鄰苯二甲酸雙(2-乙基己基) 酯(DEHP) ，均購自百靈威公司；甲醇、二氯甲烷、正己烷、乙酸乙酯均為一級色譜純。

實驗中使用的所有玻璃器具，為了避免實驗室內(nèi)空氣中鄰苯二甲酸酯的污染，將器具在預(yù)先配置的鉻酸洗液中浸泡數(shù)小時，蒸餾水洗凈，再用色譜純甲醇淋洗3遍后在烘箱中以100 ℃烘烤5 h，實驗過程中不使用塑料制品。

1.3 實驗條件

1.3.1儀器條件

色譜條件：進樣口溫度280 ℃；傳輸線接口溫度：280 ℃；程序升溫：80 ℃(1 min)-10 ℃/min-320 ℃(5 min)；質(zhì)譜條件：選擇離子(SIM)掃描模式；質(zhì)量數(shù)掃描范圍：10～500 amu；離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度150 ℃。

1.3.2標準溶液的配置

準確稱取DMP，DEP，DIBP，DBP，BBP,DEHP,DNOP各5 mg，分別用甲醇溶液溶解在5 mL的容量瓶中，配成1 mg/mL的單標儲備液。

準確移取上述6種單標儲備液各1 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容，配制成0.1 mg/mL的混合標準儲備液，置于冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

將以上配好的混標稀釋成0.05、0.02、0.01、0.002、0.001,0.000 5、0.000 25、0.000 125、0.000 01 mg/mL，進行儀器分析，繪制標準曲線。

1.3.3空白添加

取配好的混標溶液1 mL，放入1 000 mL容量瓶中，用超純水稀釋至刻度，搖勻密封冷藏待用。

1.3.4液相微萃取

用氣相色譜專用微量注射器(Agilent 10 μL)吸取1 μL正己烷，插入裝有1 mL空白添加水樣并密封的樣品瓶中，然后將微量注射器活塞推壓至底部，使注射器內(nèi)的有機溶劑形成一個液滴懸浮在枕頭的頂部，進行萃取。萃取結(jié)束時，將針頭的液滴抽回到微量注射器中，再拔除微量注射器并直接進行氣相色譜質(zhì)譜測定。萃取時間分別為3、5、8、10、15、20、30、40 min考察不同萃取時間對萃取效果的影響。

1.3.5液液萃取

考察乙酸乙酯、正己烷和二氯甲烷三種有機溶劑提取效果，取配好的空白添加溶液，加入5 mL上述有機溶劑，分別震蕩提取5、10、15、30、45 min，靜置分層后，吸取有機相，用氮氣濃縮儀濃縮至1 mL進行氣質(zhì)聯(lián)用儀分析，每個樣品平行做三次。

1.3.6固相萃取

采用固相萃取技術(shù)對水樣品進行預(yù)處理，采用的固相萃取小柱是Agilent Bond Elut Plexa C18(3 mL，200 mg)。取C18固相萃取小柱，分別加入10 mL色譜純甲醇，自然緩慢通過萃取小柱，進行小柱的活化、去除雜質(zhì)。

對固相萃取柱活化后，加入10 mL空白添加水樣，上樣結(jié)束后用平穩(wěn)氣流通過萃取柱15 min，使萃取柱充分干燥。用甲醇作為洗脫溶劑，洗脫體積為5 mL，用氮吹儀濃縮至1 mL進行氣質(zhì)聯(lián)用分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 標準曲線與線性范圍

在選定的儀器條件下，7種物質(zhì)達到很好的分離，其選擇離子色譜圖如圖1所示，根據(jù)色譜圖可知各物質(zhì)出峰時間，7種物質(zhì)具體信息如表1所示。

圖1 七種鄰苯二甲酸酯總離子流圖

表2中列出了7種物質(zhì)的線性方程以及線性范圍，可以看出，對于DMP,DEP,DIBP和DBP四種物質(zhì)來說，有較寬的線性范圍，而BBP,DEHP和DNOP來說線性范圍相對較窄。

表2 七種鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)的線性方程

2.2 液相微萃取

實驗考察了正己烷、乙酸乙酯和二氯甲烷三種有機溶劑進行萃取，結(jié)果表明，乙酸乙酯雖然萃取率高，但是在水中形成的有機液滴非常容易從針尖脫落，而正己烷和二氯甲烷相對來說要容易的多，考慮到二氯甲烷萃取率相對較低，實驗選擇正己烷作為液相微萃取的萃取劑。以萃取時間和對各物質(zhì)峰面積作圖，如圖2，可以看出20 min的萃取時間是最佳萃取時間。

圖2 不同萃取時間的影響

2.3 液液萃取

考察正己烷、乙酸乙酯和二氯甲烷三種溶劑萃取效果得知，對于DMP、DEP、DIBP、DBP、DEHP五種物質(zhì)，15 min左右達到萃取平衡。對于BBP、DNOP兩種物質(zhì)，30 min左右達到萃取平衡。計算萃取效率，結(jié)果見圖3， 由圖3可知，三種溶劑萃取效率均在85%以上，乙酸乙酯和正己烷比二氯甲烷高。考慮到實驗的一致性，方法選用和液相微萃取一樣的溶劑正己烷。

圖3 不同萃取溶劑萃取效率比較

2.4 固相萃取

考察不同上樣和洗脫流速對于萃取效果的影響，上樣流速分別為5，10，20，30 mL/min；洗脫速率分別為5，10，20 mL/min，做正交實驗。結(jié)果表明上樣速率為10 mL/min，洗脫速率5 mL/min時萃取效果最佳。

2.5 三種提取方法的比較

三種提取方法提取效率如圖4所示，單就萃取效率來看，固相萃取是三種方法中最低的；綜合來說，三種不同的前處理方法各有特點，都是操作性比較強的前處理方式，液液提取操作簡單，萃取效率最高，最容易被采用，但是使用溶劑量比較大，而且在萃取過程中，容易發(fā)生乳化現(xiàn)象，影響萃取效果，干擾也較大。液液微萃取操作簡便，所用溶劑量小，成本最低，但是對人員操作技巧較高，需要反復(fù)練習才能達到比較好的效果。而固相萃取相比于液液萃取和液相微萃取來說，成本稍高，需要專門的萃取裝置才能進行，萃取率比以上兩種萃取方法稍低，但是固相萃取能有效地減少雜質(zhì)的干擾。

圖4 三種前處理方法萃取效率比較

3 結(jié) 語

本方法結(jié)合實驗教學(xué)，從前處理方法，儀器條件摸索到后續(xù)的分析，通過對氣相色譜、質(zhì)譜以及氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進行深入的訓(xùn)練，使學(xué)生系統(tǒng)的理解和掌握了這門分析測試技術(shù)，很好地體現(xiàn)了理論和實際相結(jié)合的教學(xué)方法。

所采用的三種前處理方式都是屬于比較容易操作的，沒有涉及很復(fù)雜的設(shè)備或者操作，成本較低，在教學(xué)允許范圍內(nèi)，時間安排上也比較合理，綜合來看可行性非常高。

從設(shè)計思路上來說，計劃開發(fā)出適合教學(xué)的一系列實驗方法，繼本實驗之后，會開發(fā)出檢測實際樣品的實驗方法，便于學(xué)生全面深入掌握此項技能。需要注意的是，用鄰苯二甲酸酯類的物質(zhì)作為檢測對象時，一定要避免使用塑料制品，避免污染。

本實驗所建立的方法對于實際的樣品檢測也具有非常實用的價值。還可作為本科生教學(xué)實驗和公共儀器平臺中對科研用戶進行儀器操作培訓(xùn)的方法。

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