蛇毒鑒定的研究進展

張經(jīng)碩，向 平，沈 敏

（1.司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室，上海200063；2.蘇州大學(xué)醫(yī)學(xué)部，江蘇蘇州215123）

1 概述

毒蛇咬傷常見于熱帶和亞熱帶地區(qū)。在非洲、亞洲、大洋洲和拉丁美洲的農(nóng)村地區(qū)，毒蛇咬傷是特別突出的公共衛(wèi)生問題[1-2]。最近的一項研究估計：全球范圍內(nèi)，每年遭受毒蛇咬傷超過50 000 000人，導(dǎo)致死亡25 000～125 000人[2]。我國蛇傷發(fā)病主要在南方各省[3]，以夏秋季多見。據(jù)報道我國每年被毒蛇咬傷超過100 000人，其中有將近10 000人會死亡[4]。近年來，由于環(huán)境改變、飼養(yǎng)蛇、野外作業(yè)等多種因素，蛇傷發(fā)病還呈現(xiàn)出逐年增多的趨勢。

在法醫(yī)工作中，懷疑是蛇毒中毒的案件經(jīng)常發(fā)生，確定是否是蛇毒中毒，是哪種蛇毒中毒，是解決該類案件的關(guān)鍵。目前，我國的蛇傷鑒定方法主要是依靠觀察牙痕、癥狀和生化常規(guī)檢查，其中牙痕是關(guān)鍵。但是，在實際工作中又經(jīng)常會碰到?jīng)]有明顯牙痕的案件，這時就得憑經(jīng)驗通過癥狀和生化指標(biāo)來判斷是否是蛇毒中毒、是哪種蛇毒中毒，錯誤判斷的可能性非常大，因此，我們亟需新的鑒定技術(shù)。為此，筆者收集了國內(nèi)外已報道的蛇毒鑒定技術(shù)和蛇毒中毒生物標(biāo)記物的研究方法，詳細(xì)分析了這些方法的優(yōu)缺點，以期找到更為準(zhǔn)確可靠的蛇毒中毒鑒定新方法?，F(xiàn)將國內(nèi)外的相關(guān)研究進展綜述如下。

2 蛇毒的種類

蛇毒是復(fù)雜的混合物，其毒性成分主要是具有酶活性的蛋白質(zhì)和多肽。蛇毒對機體的作用很復(fù)雜，按其有毒成分的毒理作用可分為神經(jīng)毒、血液毒和混合毒，按其作用性質(zhì)不同又可分為神經(jīng)毒素、心臟毒素、溶血毒素、凝血毒素和抗凝血毒素[5]。

蛇毒是蛇類用于捕食和消化的工具，不同種類的蛇毒其所含的蛋白質(zhì)和多肽是不同的[6]，這為鑒定是否為蛇毒中毒以及區(qū)分不同的蛇毒中毒提供了可能性。

3 蛇毒中毒的毒理機制

3.1 神經(jīng)毒素作用機制

蛇毒神經(jīng)毒素主要是β-神經(jīng)毒素和α-神經(jīng)毒素，分別作用于神經(jīng)突觸和終板。β-神經(jīng)毒素可以抑制乙酰膽堿釋放，而α-神經(jīng)毒素可以競爭結(jié)合乙酰膽堿受體，兩種毒素均可以通過阻滯神經(jīng)信號的正常傳導(dǎo)而引起肌肉麻痹的癥狀[7]。早期表現(xiàn)為眼瞼下垂、吞咽困難，進而呼吸肌麻痹導(dǎo)致呼吸衰竭，甚至呼吸停止。

3.2 心臟毒素作用機制

心臟毒素又稱為細(xì)胞毒素，其可以引起細(xì)胞膜通透性改變和組織壞死，輕者引起肢體腫脹和皮膚壞死，重者可導(dǎo)致局部組織大面積深度壞死，導(dǎo)致患肢殘廢，甚至還可以使心肌細(xì)胞壞死從而造成心肌損壞[8]。

3.3 溶血毒素作用機制

蛇毒中有溶血作用的毒素主要是磷脂酶A2，其作用底物為Sn-3-磷酸甘油酯第二位酯鍵，當(dāng)其作用于血清或卵磷脂時產(chǎn)生溶血卵磷脂，導(dǎo)致紅細(xì)胞溶血。磷脂酶A2也可直接作用于紅細(xì)胞膜上的磷脂，引起直接溶血[9]。

3.4 凝血毒素作用機制

凝血毒素是蛇毒中存在的一類能作用于血液凝固酶促級聯(lián)反應(yīng)過程中一個或多個環(huán)節(jié)的蛋白質(zhì)，可以激活凝血因子Ⅴ、凝血因子Ⅶ、凝血因子Ⅸ、凝血因子Ⅹ、凝血因子Ⅱ或直接使纖維蛋白原凝集[10]。

3.5 抗凝血毒素作用機制

蛇毒中的抗凝血毒素主要是類凝血酶和纖溶酶[11]。蛇毒類凝血酶在體內(nèi)可以消耗纖維蛋白原，造成纖維蛋白原缺乏而產(chǎn)生抗凝血作用。蛇毒纖溶酶在體內(nèi)可以降解纖維蛋白和纖維蛋白原，還可以水解和滅活凝血酶原、凝血因子Ⅴ、凝血因子Ⅶ、凝血因子Ⅷ、凝血因子Ⅻ，從而產(chǎn)生抗凝血作用。

4 鑒定方法

自20世紀(jì)70年代起，醫(yī)學(xué)界涌現(xiàn)了大量研究蛇毒和蛇傷鑒定的新技術(shù)。從早期的凝集測試法、免疫電泳法、放射免疫法和酶聯(lián)免疫吸附法，到近期的聚合酶鏈反應(yīng)、熒光免疫法、光學(xué)免疫法、生物傳感器、基質(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜和電噴霧離子化質(zhì)譜，眾多新技術(shù)的出現(xiàn)，使得通過傷者體內(nèi)蛇毒檢測進行蛇傷法醫(yī)鑒定具備了可行性。

蛇毒中的毒素蛋白質(zhì)進入傷者體內(nèi)后會迅速被體液稀釋，并擴散至全身多個組織，與傷者的內(nèi)源物質(zhì)混存，這一方面導(dǎo)致體內(nèi)毒素蛋白質(zhì)的濃度極低，另一方面也導(dǎo)致體內(nèi)蛇毒的鑒定極易被內(nèi)源物質(zhì)干擾，因此，鑒定方法的靈敏度和抗干擾能力至關(guān)重要。經(jīng)各國學(xué)者研究，一些新技術(shù)在體內(nèi)蛇毒鑒定方面表現(xiàn)出了優(yōu)異的性能，其檢測靈敏度和排除生物樣品中內(nèi)源物質(zhì)干擾的能力非常突出，已經(jīng)可以嘗試應(yīng)用于臨床蛇傷的鑒定；但是，也有一些方法經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)其檢測靈敏度和抗干擾能力不足，暫時還只能用于純蛇毒的鑒定。

4.1 聚合酶鏈反應(yīng)法（polymerasechain reaction，PCR）

PCR是一種用于體外放大和擴增特定DNA片段和RNA片段的技術(shù)，類似于DNA的體內(nèi)復(fù)制。首先將待擴增的DNA模板加熱變性解鏈，隨之將反應(yīng)混合物冷卻至某一溫度，這一溫度可使引物與它的靶序列發(fā)生退火，再將溫度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。這種熱變性-復(fù)性-延伸的過程就是一個PCR循環(huán)，PCR就是在合適條件下這種循環(huán)的不斷重復(fù)。

2001年，Suntrarachun等[12]首次采用PCR方法鑒定蛇傷，試圖區(qū)別孟加拉眼鏡蛇咬傷與當(dāng)?shù)氐钠渌哳愐ㄑ坨R王蛇、金環(huán)蛇、圓斑蝰蛇和紅口腹蛇）。他們選擇了眼鏡蛇毒素（Cobrotoxin）作為引物，將蛇傷小鼠傷口清洗液中的DNA和RNA擴增后用于對蛇種的鑒定。Suntrarachun確實檢測到了一段眼鏡蛇毒素編碼基因中的cDNA片段，并且該cDNA片段的特異性還不錯（在當(dāng)?shù)仄渌叨局袡z測不到），但是考慮到蛇咬的傷口通常比較小，并且也不會總是殘留足夠的毒腺上皮細(xì)胞（這將導(dǎo)致鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性較差），所以Suntrarachun并沒有將該方法應(yīng)用于人類傷者身上。

PCR技術(shù)是一種非常成熟的擴增基因的方法，Suntrarachun創(chuàng)造性的將其應(yīng)用于生物樣品中蛇毒的鑒定研究，這為蛇傷鑒定指出了一條新思路。雖然鑒于鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性問題，Suntrarachun并沒有將這一技術(shù)完善成可供實際蛇傷案件使用的方法，但是在個別案件中還是可以考慮嘗試一用。

4.2 凝集測試法（agglulinalion assay）

凝集試驗是一種免疫學(xué)檢測方法，需要將抗原與含有相應(yīng)抗體的血清混合，使二者發(fā)生特異性結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合物，在一定濃度的電解質(zhì)作用下，復(fù)合物表面的電荷大部分被消除而失去了互相排斥的作用，于是復(fù)合物之間互相吸引凝集成團，出現(xiàn)肉眼可見的凝集現(xiàn)象。

1991年，Chinonavanig等[13]以凝集測試技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)了一種反向乳膠凝集方法用于檢測蛇毒。Chinonavanig獲得的體外測試結(jié)果顯示，該方法檢測蛇毒的檢測限高達0.16～1.2μg/mL，而且由于該方法使用的抗體是兔抗蛇毒血清，所以在異源蛇毒間存在明顯的交叉反應(yīng)。在進一步的臨床測試中，Chinonavanig又檢測了59份血清樣本和26份傷口拭子，結(jié)果顯示該方法對血清蛇毒的檢出率很低，僅僅只有52.5%，而且還有1例假陽性結(jié)果；對傷口拭子上蛇毒的檢出率更低，只有38.5%。雖然Chinonavanig的嘗試沒有獲得理想的結(jié)果，但是他奠定了凝集測試技術(shù)鑒定蛇毒的基礎(chǔ)。1993年，Kittigul等[14]進一步完善了這種技術(shù)，Kittigul用兔抗蛇毒血清活化的羊、雞和人的紅細(xì)胞作為檢測試劑，使用反向被動血凝法對泰國6種毒蛇的蛇毒進行了檢測，結(jié)果顯示該方法的檢測濃度下降到了2～635ng/mL，但在不同蛇毒間還是存在明顯的交叉反應(yīng)。在檢測血清樣本時，Kittigul的檢測方法達到了81.3%的正確檢出率，但是在檢測傷口拭子樣本時，Kittigul的檢測方法卻只獲得了61.5%的正確檢出率。Kittigul的蛇毒鑒定方法在檢測濃度和正確檢測率這2項指標(biāo)上相比于Chinonavanig的方法有了很大的提高，但是卻仍然存在正確檢出率偏低（81.3%）和交叉反應(yīng)明顯的問題。1997年，哥斯達黎加的Amuy等[15]繼續(xù)對蛇毒凝集測試技術(shù)做出改進，他們嘗試用親和純化抗體來構(gòu)建黑紋珊瑚蛇（Micrurus nigrocinctus）蛇毒的乳膠反向凝集方法，希望能夠?qū)崿F(xiàn)蛇毒的種屬特異性鑒定，但是Amuy的方法在測試階段仍然對同屬的其他6種蛇毒顯示出了明顯的交叉反應(yīng)。

凝集測試法應(yīng)用于體內(nèi)蛇毒鑒定雖然具有檢測時間短和操作簡便等優(yōu)勢，但是Chinonavanig、Kittigul和Amuy課題組的研究卻都顯示出這種方法的正確檢出率低、檢測靈敏度不高，而且存在明顯的交叉反應(yīng)，因此，就目前來看這種方法暫時還不適合應(yīng)用于實際的蛇傷案件。雖然國外的研究一致顯示了凝集測試法的不足，但是在國內(nèi)，個別醫(yī)院卻已經(jīng)采用這種測試方法對臨床蛇傷進行鑒定[16]，并給出了相當(dāng)正面的評價（約300例陽性鑒定結(jié)果中無1例出現(xiàn)交叉凝集抑制現(xiàn)象）。遺憾的是該醫(yī)院并沒有公布其凝集測試法的詳細(xì)細(xì)節(jié)，所以我們無法了解到該方法的關(guān)鍵技術(shù)。就國內(nèi)外對凝集測試技術(shù)的研究和使用來看，該方法雖然存在種種有待解決的關(guān)鍵問題，但還是具有相當(dāng)強的應(yīng)用潛力的。

4.3 生物傳感器檢測法（biosensor assay）

生物傳感器是一種將生物學(xué)或仿生學(xué)信號感應(yīng)部件連接或整合到傳感系統(tǒng)內(nèi)的分析儀器，主要包括敏感元件和信號轉(zhuǎn)換元件兩部分。生物傳感器在使用過程中是通過固定在支持物上的敏感生物材料（即敏感元件）與分析物特異性結(jié)合，發(fā)生一種或多種物理化學(xué)特性的改變，然后由換能器轉(zhuǎn)換為次級可用信號（通常是電信號），這種信號的強弱或頻率的變化與敏感元件所結(jié)合的分析物或分析物化學(xué)基團相關(guān)，從而對待測物進行分析測定。

生物傳感器進入蛇毒鑒定領(lǐng)域是源于Rogers等[17]1991年的研究，他將煙堿型乙酰膽堿受體固定在光纖上制成生物傳感器，用以鑒定金環(huán)蛇蛇毒中的-銀環(huán)蛇毒素。Rogers的傳感器活性在最佳pH環(huán)境中可以保持3d，然后活性會逐漸降低，30d過后活性大致會損失50%。2005年，陶濤等[18]將生物傳感器鑒定蛇毒的技術(shù)做了改進，他將石英晶振的高靈敏度與免疫反應(yīng)的特異性相結(jié)合，研制出了檢測蝮蛇毒的壓電免疫傳感器方法。但是在用純蛇毒對其性能進行測試時，陶濤的鑒定裝置在檢測濃度和交叉反應(yīng)方面并沒有體現(xiàn)出特別的優(yōu)勢，檢測限是0.1μg/mL，交叉反應(yīng)也沒能避免，而且制備完成的鑒定裝置只能重復(fù)使用5次左右。繼Rogers和陶濤之后，生物傳感器鑒定蛇毒的研究鮮有報道。

生物傳感器鑒定蛇毒具有體積小和檢測時間短的優(yōu)點，但是現(xiàn)階段的產(chǎn)品卻非常不成熟（僅處于對純蛇毒進行鑒定的階段），存在活性保持困難、重復(fù)使用次數(shù)少和交叉反應(yīng)等問題，這嚴(yán)重限制了其在蛇毒鑒定領(lǐng)域的發(fā)展和應(yīng)用，所以迄今未見生物傳感器應(yīng)用于蛇傷實際鑒定工作的報道。但是生物傳感器畢竟具有便攜和檢測時間短的優(yōu)點，如果其產(chǎn)品質(zhì)量能夠獲得極大提升，那么還是具有應(yīng)用價值的。

4.4 免疫學(xué)方法

4.4.1 放射免疫測定法（radio immunoassay，RIA）

放射免疫測定法是利用放射性同位素標(biāo)記的抗原（標(biāo)記抗原）和相對應(yīng)的抗體來測定非標(biāo)記抗原（標(biāo)準(zhǔn)抗原或待測抗原）的一種免疫測定方法。需要將標(biāo)記抗原和非標(biāo)記抗原同時與數(shù)量有限的特異性抗體發(fā)生競爭性結(jié)合（抗原-抗體反應(yīng)）。由于標(biāo)記抗原與待測抗原的免疫活性完全相同，對特異性抗體具有同樣的親和力，所以當(dāng)標(biāo)記抗原和抗體數(shù)量恒定且待測抗原和標(biāo)記抗原的總量大于抗體上的有效結(jié)合點時，標(biāo)記抗原-抗體復(fù)合物的形成將隨著待測抗原量的增加而減少，而非結(jié)合的或游離的標(biāo)記抗原則隨著待測抗原數(shù)量的增加而增加（即競爭結(jié)合反應(yīng)），因此測定標(biāo)記抗原-抗體或游離的標(biāo)記抗原即可推測出待測抗原的數(shù)量。

早在20世紀(jì)70年代，Sutherland等[19-20]就嘗試將RIA用于蛇傷診斷，并從蛇傷患者的尿液和血清中成功檢測到了相關(guān)毒素（Tiger snake毒素）。這是一次重要的研究，意味著現(xiàn)代醫(yī)學(xué)有能力對生物樣品中的蛇毒做出來源判斷。繼Sutherland的研究之后，1987年，Pukrittayakamee等[21]對RIA法的靈敏度和專屬性做了改進。Pukrittayakamee運用魯塞爾（Russell）蝰蛇蛇毒X因子的單克隆抗體構(gòu)建用于檢測傷者體液中魯塞爾蝰蛇蛇毒的RIA方法。改進后的方法在靈敏度方面表現(xiàn)突出（檢測限在尿液中為4 ng/mL，在0.1%牛血清白蛋白-磷酸鹽緩沖液中為20 ng/mL，在血清中為5μg/mL），但是在交叉反應(yīng)方面卻并不理想，由于抗體的特異性不夠，用該方法檢測眼鏡蛇蛇毒時也顯示陽性。

RIA法需要用到放射性同位素，在檢測完畢后對廢棄物的處理是非常麻煩的事情。到了20世紀(jì)90年代，隨著其他免疫學(xué)檢測技術(shù)的興盛（如：酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)、熒光免疫技術(shù)等），RIA法用于蛇傷鑒定的研究日漸式微。直到1996年，英國的Sjostrom[22]等才開發(fā)出了另一種用于檢測血漿中極北蝰（Vipera berus berus）蛇毒的RIA方法，并且在測試過程中著重將這種方法與酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）進行了對比。在對比測試中，Sjostrom的RIA方法只表現(xiàn)出了與ELISA方法相似的檢測性能，并沒有獲得特別有吸引力的數(shù)據(jù)。這次的測試基本宣告了RIA退出蛇傷鑒定領(lǐng)域，在這之后的十幾年中，還未見有新文獻報道用RIA法來鑒定蛇傷。

4.4.2 免疫電泳檢測法（immunoelectrophoresis assay）

免疫電泳是將瓊脂電泳和雙向瓊脂擴散結(jié)合起來，用于分析抗原組成的一種定性方法。常規(guī)流程是先將抗原加到瓊脂板的小孔內(nèi)進行電泳，然后在瓊脂板中央挖一橫槽，加入已知相應(yīng)的免疫血清，兩者經(jīng)一定時間相互擴散后，就會在抗原、抗體比例最適處形成沉淀弧。根據(jù)沉淀弧的數(shù)量、位置和外形，參照已知抗原、抗體形成的電泳圖，即可分析樣品中所含成分。此方法樣品用量少、特異性高、分辨力強。但所分析的物質(zhì)必須有抗原性，而且抗血清必須含所有的抗體組分。

1990年，曹金鴻和李碧晴[23-24]用交叉免疫電泳法和逆流免疫電泳法對白眉蝮蛇毒、黑眉蝮蛇毒、五步蛇毒、竹葉青蛇毒和烙鐵頭蛇毒進行了鑒別研究，這是我國學(xué)者第一次用免疫電泳法對中國境內(nèi)常見蛇毒開展系統(tǒng)研究，研究結(jié)果也表明這2種免疫電泳方法確實能夠區(qū)分不同種類的純蛇毒。但遺憾的是曹金鴻和李碧晴并沒有測試這2種電泳方法對生物樣品中蛇毒的辨別能力，所以這2種方法對蛇傷的實際鑒定能力仍不清楚。

火箭免疫電泳（rocket immunoelectrophoresis，RIEP）是將單向免疫擴散和電泳相結(jié)合的一種定量檢測技術(shù)。電泳時，存在于瓊脂凝膠中的抗體不發(fā)生移動，但在電場的作用下抗原會向正極泳動。當(dāng)抗原與抗體分子達到適當(dāng)比例時，形成一個形狀如火箭的不溶性免疫復(fù)合物沉淀峰，峰的高度與樣品中的抗原濃度呈正相關(guān)。因此，當(dāng)瓊脂中抗體濃度固定時，根據(jù)樣品的沉淀峰長度即可計算出待測抗原的含量。1993年，廖共山等[25]用這種方法研究了商品眼鏡蛇毒抗血清與蛇毒成分產(chǎn)生的免疫沉淀線，發(fā)現(xiàn)眼鏡蛇的細(xì)胞毒與同科異種蛇毒的細(xì)胞毒之間不會發(fā)生交叉免疫反應(yīng)。然而，廖共山也沒有用蛇毒生物樣品對他的方法進行測試，這使得RIEP方法對蛇傷的實際鑒定能力仍是未知數(shù)。

曹金鴻、李碧晴和廖共山將免疫電泳法帶入了蛇毒（體外檢材）鑒定領(lǐng)域，為蛇毒鑒定提供了新的思路，但是考慮到當(dāng)前電泳技術(shù)的分離能力和生物樣品的復(fù)雜性，免疫電泳并不適合用于生物樣品中蛇毒的鑒定。

4.4.3 光學(xué)免疫檢測法（optical immunoassay，OIA）

光學(xué)免疫檢測法是使用光敏元件作為信號轉(zhuǎn)換器，利用光學(xué)原理工作的一種檢測方法。需要將生物識別物質(zhì)固化在傳感器上，通過與光學(xué)器件的光相互作用，產(chǎn)生變化的光學(xué)信號，通過檢測變化的光學(xué)信號來檢測免疫反應(yīng)。

2002年，新加坡國立大學(xué)的Dong等[26]將β-銀環(huán)蛇毒素單克隆抗體與硅晶片結(jié)合，并配備以親和素、生物素、辣根過氧化物酶顯色系統(tǒng)，開發(fā)了一種檢測蛇毒的光學(xué)免疫檢測方法（AB-OIA）。Dong等開發(fā)的蛇毒AB-OIA鑒定方法堪稱蛇傷鑒定技術(shù)的杰作，該方法完成一次蛇毒鑒定僅需25 min，檢測靈敏度達到了驚人的16pg/mL。交叉反應(yīng)的測試數(shù)據(jù)顯示，該方法對于鋸鱗蝰屬蛇毒、死亡蛇屬蛇毒和其它9種蛇毒成分在1～5μg/mL的毒素濃度水平上未發(fā)現(xiàn)交叉反應(yīng)。在用含毒生物樣品進行的測試中，Dong的ABOIA方法對正常組小鼠樣品全部呈現(xiàn)陰性，對注毒組小鼠樣品則全部呈現(xiàn)陽性。Dong的單克隆抗體ABOIA方法在檢測性能上表現(xiàn)搶眼，但是鑒于目前對蛇毒蛋白質(zhì)的研究還不充分，我們并不知道哪些毒蛋白是某種蛇類特有的，因此該方法具體推廣起來有一定難度，但這并不影響該方法的價值，它是蛇傷鑒定技術(shù)的一次飛躍，將蛇毒鑒定的檢測限帶到了pg級。2004年，Dong等[27]又在原方法的基礎(chǔ)上做了改進，這次他們放棄使用單克隆抗體，改用親和純化方法制備的蛇毒種屬特異性抗體。Dong等將竹葉青蛇毒、孟加拉眼鏡蛇毒、眼鏡王蛇毒和紅口腹蛇毒的抗血清分別用其它3種蛇毒處理以除去抗血清中能夠發(fā)生交叉反應(yīng)的抗體，然后用這4種抗血清建立了可用肉眼觀察鑒定結(jié)果的蛇毒光學(xué)免疫檢測方法（OIA）。該方法在毒素檢測濃度和交叉反應(yīng)方面的性能與2002年的方法非常相似，在用全血、血漿、尿液、傷口分泌物、皰液和組織勻漿樣品開展的性能測試中表現(xiàn)優(yōu)異。

蛇類的一次排毒量只有數(shù)毫克至一百多毫克，蛇毒進入人體后隨著人體體液的稀釋，濃度會急劇下降，因此鑒定方法的靈敏度對于鑒定能否成功至關(guān)重要。Dong等開發(fā)的光學(xué)免疫檢測方法在體內(nèi)蛇毒測試中，不但在交叉反應(yīng)方面表現(xiàn)優(yōu)秀，而且擁有極低的檢測限，在蛇傷案件鑒定中無疑是具有重大應(yīng)用價值的。4.4.4熒光免疫檢測法（fluorescence immunoassay）

熒光免疫檢測法是將熒光檢測與免疫檢測結(jié)合而成的一種免疫檢測方法，具有很高的檢測靈敏度。熒光免疫檢測法需要先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素，制成熒光抗體（或抗原），再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受外來激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光，從而確定抗原或抗體的含量。

1988年，Lomonte等[28]首次用鼠單克隆抗體建立了一種用于檢測粗鱗矛頭蝮（Bothrops asper）蛇毒的酶聯(lián)熒光免疫方法。這是非常重要的一次研究，它將熒光技術(shù)融入了蛇毒鑒定方法，還試圖用單克隆抗體消除免疫方法鑒定蛇毒長期存在的交叉反應(yīng)問題，但是由于選擇的單克隆抗體不夠理想，Lomonte的方法被發(fā)現(xiàn)可以與墨西哥跳蝮（B.nummifer）蛇毒產(chǎn)生明顯的交叉反應(yīng)。1993年，Bhatti等[29]也建立了用于檢測山蝰（Vipera russelli）蛇毒的酶聯(lián)熒光免疫法。相比于Lomonte的方法，Bhatti的方法在檢測靈敏度方面可謂進步巨大，由1.5 ng/mL下降到了0.1pg/mL。然而，Bhatti也沒能避免交叉反應(yīng)，他選擇的抗體與蝰科（Viperinae）和蝮亞科（Crotalinae）的蛇毒間存在明顯的交叉反應(yīng)。在Lomonte和Bhatti之后，新加坡的Gao[30]和美國的Gilliam[31]于2008年和2013年也分別建立了單珠熒光免疫法和熒光ELISA法用于蛇毒鑒定，但均未能克服交叉反應(yīng)的影響。

熒光免疫檢測是一種非常靈敏的檢測技術(shù)，借助抗原-抗體結(jié)合的高特異性，對生物樣品中的蛇毒進行專屬鑒定也完全可行。但是，由于目前對蛇毒蛋白和蛇毒抗體的研究還不夠全面，自Lomonte以來，該方法均因為缺乏特異性足夠強的抗體與之相配套，而無法用于蛇傷實際案件的鑒定。

4.4.5 酶聯(lián)免疫吸附檢測法（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）

ELISA方法的基本原理是利用酶分子與抗體或抗抗體分子共價結(jié)合形成酶標(biāo)抗體，酶標(biāo)抗體可與吸附在固相載體上的抗原或抗體發(fā)生特異性結(jié)合，滴加底物溶液后，底物可在酶作用下出現(xiàn)顏色反應(yīng)，可以通過顏色反應(yīng)是否出現(xiàn)來判定有無相應(yīng)的免疫反應(yīng)，而顏色的深淺是與標(biāo)本中相應(yīng)抗體或抗原的量呈正比的。在最近30年里，該方法在檢測性能方面獲得了長足進步。目前，ELISA方法已經(jīng)成為蛇毒檢測最常用的免疫學(xué)方法。

ELISA方法用于蛇毒檢測是源于1977年Theakston[32]的一項研究。當(dāng)時，Theakston和他的團隊嘗試將剛出現(xiàn)不久的ELISA新技術(shù)應(yīng)用于臨床蛇傷的鑒定，在隨后的測試過程中，這種新方法表現(xiàn)出了令人滿意的靈敏度，檢測限可以達到1～5 ng/mL。這一次的嘗試是ELISA法應(yīng)用于蛇傷鑒定的開始，圍繞ELISA方法的下一個重要發(fā)現(xiàn)來自于1981年Gopalakrishnakone[33]的研究。為了弄清蛇毒抗血清的特異性，Gopalakrishnakone等用南美響尾蛇（Crotalus durissus terrificus）的抗血清建立了ELISA流程來研究與多種蛇毒磷酸酯酶A2的反應(yīng)。這項研究第一次揭示了蛇毒蛋白質(zhì)成分的相似是免疫學(xué)方法鑒定蛇毒時交叉反應(yīng)產(chǎn)生的基礎(chǔ)，為交叉反應(yīng)的克服提供了理論基礎(chǔ)。

交叉反應(yīng)的存在對于蛇傷臨床治療是有利的，但是對于蛇傷的準(zhǔn)確鑒定卻是非常不利的[34]。為了克服免疫學(xué)方法鑒定蛇傷時存在的交叉反應(yīng)，以Barral-Netto為首的一些學(xué)者開始嘗試制備蛇毒中單一組分的多克隆抗體并將其用于蛇毒鑒定。Barral-Netto等[35]從南美響尾蛇（Crotalus durissus terrificus）蛇毒中純化出了單一毒素成分：響尾蛇毒素（crotoxin），并制備了這種毒素的多克隆抗體。利用這種抗體建立的ELISA方法其交叉反應(yīng)強度明顯降低，只是當(dāng)其它毒素的濃度達到1μg/mL時才出現(xiàn)交叉反應(yīng)，可以說是ELISA法鑒定蛇毒的一次重大突破。1994年，Li等[36]運用與Barral-Netto相似的方法建立了寬帶銅斑蛇（Agkistrodon contortrix laticintus）蛇毒的鑒定方法，同樣獲得了不錯的檢測性能。測試結(jié)果顯示，該方法對蝮蛇屬（Agkistrodon species）的其它蛇毒沒有明顯的交叉反應(yīng)，僅對矛頭蝮屬（Bothrops species）的2種蛇毒存在明顯的交叉反應(yīng)。

蛇毒單一毒素多克隆抗體的應(yīng)用大大降低了ELISA法鑒定蛇毒時的交叉反應(yīng)，但是交叉反應(yīng)在一定范圍內(nèi)仍然存在并繼續(xù)困擾著低濃度蛇毒樣品的鑒定。為了進一步克服交叉反應(yīng)，一些學(xué)者開始將單一毒素的單克隆抗體引入蛇毒ELISA鑒定方法。在這個方向上的第1次嘗試是由瑞典的Amuy團隊完成的。1997年，Amuy等[37]制備了中美珊瑚蛇（Micrurus nigrocinctus）蛇毒的單克隆抗體并將其與多克隆抗體進行了對比測試，使用單克隆抗體的ELISA方法表現(xiàn)出了更低的交叉反應(yīng)強度。在這之后，巴西的Fernandes[38]于 2010年再次用三色矛頭蝮（Bothrops asper）蛇毒金屬蛋白酶BaP1的單克隆抗體研究ELISA鑒定蛇毒的交叉反應(yīng)，同樣獲得了令人滿意的結(jié)果。Fernandes在研究中用了27種異種蛇毒做交叉反應(yīng)測試，這是迄今為止最為全面的一次測試，測試結(jié)果再次證明了蛇毒單克隆抗體可以有效降低交叉反應(yīng)的發(fā)生。

在Amuy和Fernandes做蛇毒單克隆抗體研究的同時，另一些學(xué)者卻在嘗試采用經(jīng)親和純化的多克隆抗體來鑒定蛇毒。其原理是將異種蛇毒包被在經(jīng)活化的色譜載體上，讓目標(biāo)蛇毒的抗血清流經(jīng)色譜柱，收集流出液即為蛇毒種屬特異性抗體，然后用這種抗體來構(gòu)建ELISA鑒定方法。在目前對蛇毒蛋白質(zhì)認(rèn)識不足、特異性單克隆抗體很少的情況下，這種方法具有很高的實用價值。自20世紀(jì)90年代以來，很多學(xué)者采用這種抗體開展的體內(nèi)外蛇毒研究結(jié)果也證實了蛇毒種屬特異性抗體擁有優(yōu)異的檢測特異性[39-44]。

在檢測靈敏度方面，隨著生物素-親和素（Biotin-Avidin，BA）放大系統(tǒng)被引入到 ELISA方法中[45-46]，目前的ELISA法鑒定蛇毒的靈敏度已經(jīng)達到了pg級。

就生物樣品中蛇毒鑒定的靈敏度、特異性以及鑒定方法實施的難易程度來看，ELISA法是目前蛇毒免疫學(xué)鑒定方法中的最佳選擇。

4.5 質(zhì)譜法（Mass Spectrometry，MS）

20世紀(jì)80年代，隨著電噴霧離子化（Electrospray Ionization，ESI）技術(shù)和基質(zhì)輔助激光解析離子化（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization，MALDI）技術(shù)的出現(xiàn)，用質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)成為了可能。質(zhì)譜法鑒定蛋白質(zhì)的原理是運用不同離子化方法將樣品中的組分解離為氣相離子后，根據(jù)不同離子質(zhì)荷比（m/z）的差異進行分離，從而鑒定蛋白質(zhì)。因為質(zhì)譜法具有高通量、高靈敏度、可自動化等優(yōu)點，所以在蛋白質(zhì)鑒定領(lǐng)域迅速擴展。近十年來，質(zhì)譜技術(shù)也頻頻出現(xiàn)在蛇毒蛋白的研究領(lǐng)域。

4.5.1 基質(zhì)輔助激光解析離子化質(zhì)譜法（MALDI-MS）

基質(zhì)輔助激光解析離子化是用基質(zhì)包裹樣品分子，在激光照射下，基質(zhì)氣化將樣品分子釋放到氣相中的技術(shù)。這是一項軟電離技術(shù)，非常適合生物大分子的電離。

2003年，英國的Creer等[47]用基質(zhì)輔助激光解析飛行時間質(zhì)譜法（MALDI-TOF-MS）研究了臺灣及周邊島嶼蝮蛇（pit viper）蛇毒的種間變異。他們從蛇毒中鑒定到了大量蛋白質(zhì)，從中尋找到了7種不同的磷酸酯酶A2（PLA2）及異構(gòu)體，邁出了MALDI-MS鑒定蛇毒蛋白質(zhì)精細(xì)差異的第一步，也證明了MALDI-MS有能力區(qū)分不同種類的蛇毒。同年，臺灣的Nawarak等[48]也用多維色譜技術(shù)結(jié)合MALDI-MS研究了眼鏡蛇科（Elapidae）和蝰科（Viperidae）共 10 種蛇毒在蛋白質(zhì)組成方面的差異（種內(nèi)差異、種間差異和科間差異）。在這項研究中，Nawarak共鑒定到了133種蛋白質(zhì)，從中篩選出了各種蛇毒特有的蛋白質(zhì)，這是第一次用MALDI-MS對蛇毒蛋白進行大規(guī)模的橫向比較。但是Nawarak的研究也暴露出了多維色譜技術(shù)結(jié)合MALDI-MS檢測蛋白質(zhì)的缺點：獲得的數(shù)據(jù)量偏小。

Creer和Nawarak的研究為MALDI-MS在蛇毒蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用打下了堅實的基礎(chǔ)，此后，很多研究人員陸續(xù)用類似的方法對各種蛇毒開展了與蛇毒進化、蛇種歸屬和蛇類發(fā)育等相關(guān)的研究[49-54]，獲得了豐富的數(shù)據(jù)，極大的推進了MALDI-MS在蛇毒蛋白質(zhì)組學(xué)中的應(yīng)用。

4.5.2 電噴霧離子化質(zhì)譜法（ESI-MS）

電噴霧離子化是一種在大氣壓下實現(xiàn)電離的技術(shù)，其原理是利用毛細(xì)管和質(zhì)譜儀進口間的電勢差生成離子，在電場作用下產(chǎn)生以噴霧形式存在的帶電液滴，當(dāng)使用干燥氣加熱時，溶劑蒸發(fā)，液體體積縮小，最終生成去溶劑化離子。電噴霧電離的特點是可以生成高度帶電的離子而不發(fā)生碎裂，可以極大的降低質(zhì)荷比，非常適合于檢測生物大分子。

2002年，澳大利亞的Fry等[55]用高效液相色譜（HPLC）結(jié)合ESI-MS技術(shù)研究了澳大利亞4種死蝰（death adder）的蛇毒蛋白，發(fā)現(xiàn)這4種蛇毒組分最明顯的特點是多樣化，研究結(jié)果對于確定死蝰的分類地位和系統(tǒng)學(xué)關(guān)系很有幫助。2003年，F(xiàn)ry等[56]繼續(xù)用HPLC結(jié)合ESI-MS技術(shù)研究蝰蛇（5種）、眼鏡蛇（15種）和有毒游蛇（22種）的毒液蛋白，這是迄今為止最大規(guī)模的蛇毒蛋白質(zhì)組學(xué)研究。在這項研究中，F(xiàn)ry等發(fā)現(xiàn)不同的蛇毒在蛋白質(zhì)組成上差異明顯，他們還在游蛇科蛇毒中發(fā)現(xiàn)了一些常見于眼鏡蛇科和蝰蛇科的毒素蛋白（3指毒素和富含半胱氨酸的分泌蛋白），這些發(fā)現(xiàn)對于蛇毒鑒定和蛇傷鑒定都有著重要意義。

Fry課題組的研究對于ESI-MS用于蛇毒蛋白質(zhì)檢測是具有里程碑意義的，在這之后，涌現(xiàn)出了大量用ESI-MS研究蛇毒蛋白質(zhì)的文獻[57-61]。為了進一步追求蛇毒蛋白質(zhì)鑒定的數(shù)量，也有一些課題組將ESI-MS和MALDI-MS方法結(jié)合起來研究蛇毒[62-67]，但是，遺憾的是這些研究普遍都只著眼于純蛇毒的蛋白質(zhì)鑒定，而沒有開展生物樣品中蛇毒蛋白質(zhì)的研究，也沒有關(guān)注蛇毒中毒生物體內(nèi)生物標(biāo)記物的發(fā)現(xiàn)。這一狀況直到2011年才由哥斯達黎加的Rucavado[68]打破。Rucavado給小鼠注射Bothrops asper蛇的蛇毒，然后收集傷口分泌物，用LC-MS對分泌物中的內(nèi)源蛋白質(zhì)進行鑒定，共鑒定到340個內(nèi)源蛋白質(zhì)，主要包括細(xì)胞內(nèi)蛋白、血漿蛋白、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白和細(xì)胞膜相關(guān)蛋白，這些蛋白質(zhì)的出現(xiàn)表明Bothrops asper蛇毒可以造成細(xì)胞破壞、胞漿滲出、細(xì)胞外基質(zhì)降解和膜蛋白脫落，其中一些蛋白質(zhì)甚至有可能成為Bothrops asper蛇毒導(dǎo)致的心肌壞死和微血管損傷的生物標(biāo)記物。Rucavado的研究對于蛇傷鑒定意義重大，該研究將目標(biāo)首次瞄向了生物標(biāo)記物，為蛇傷鑒定指出了新的方向。繼Rucavado之后，巴西的Paes Leme[69]也開展了重要的研究工作，他用LC-MS/MS研究了蛇毒基質(zhì)金屬蛋白酶（HF3，來自于Bothrops jararaca蛇毒）的出血活性，率先將蛇毒單一毒素與中毒動物內(nèi)源蛋白質(zhì)的變化聯(lián)系了起來。Paes Leme將HF3分別注入小鼠背部皮下和腿部肌肉，然后收集背部皮膚和血漿，與對照組相比分析其中的差異蛋白質(zhì)。在這項研究中，細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞溶質(zhì)、細(xì)胞骨架和胞漿蛋白被發(fā)現(xiàn)在中毒皮膚中降解明顯，而在血漿中降解最明顯的則是纖連蛋白。Rucavado和Paes Leme開辟了蛇傷研究的新領(lǐng)域，這對于蛇傷鑒定和蛇傷治療都具有重要意義。

質(zhì)譜法用于蛇毒研究在近十年來獲得了快速發(fā)展，積累了大量的蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)和研究經(jīng)驗，這為蛇毒中毒機理的深入研究提供了新的舞臺，也為蛇傷鑒定做了新的鋪墊。未來，這一領(lǐng)域?qū)⑹巧邆芯康闹攸c領(lǐng)域之一。

5 問題與展望

蛇毒蛋白是蛇毒的毒性成分，不同蛇類其毒素蛋白質(zhì)的組成是不同的，在某種意義上，蛇傷鑒定也就是鑒定生物樣品中的蛇毒蛋白質(zhì)，從而對肇事蛇種做出推斷。根據(jù)當(dāng)前的數(shù)據(jù)，全世界的毒蛇約650余種，分別屬于前溝牙類毒蛇、后溝牙類毒蛇和管牙類毒蛇，但已經(jīng)開展蛇毒蛋白質(zhì)組學(xué)研究的毒蛇僅有100多種，這表明我們對蛇毒蛋白所知甚少，將大大影響蛇毒鑒定的準(zhǔn)確性。因此，建立詳細(xì)而全面的蛇毒蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫，解決蛇毒蛋白質(zhì)研究中的生物信息學(xué)瓶頸，可能仍是未來很長一段時間內(nèi)的研究重點。

在目前階段，免疫學(xué)方法是鑒定蛋白質(zhì)的主要手段，因此其也順理成章成為生物樣品中蛇毒蛋白鑒定的主要研究方向，并獲得了很大進展。但縱觀早期的蛇傷免疫學(xué)鑒定方法，我們可以看到存在大量蛋白間的交叉反應(yīng)，以至于很多方法只是停留在實驗室研究階段，并沒有進入臨床應(yīng)用。近期的蛇傷免疫鑒定方法主要是應(yīng)用經(jīng)免疫親和柱純化的抗血清或經(jīng)嚴(yán)密篩選的單克隆抗體來實施的，這2種方法在原理上是可以避免鑒定中的交叉反應(yīng)，為蛇傷鑒定帶來準(zhǔn)確結(jié)果的，但是，這2種方法在蛇傷鑒定研究中起步較晚，至今也只有極少數(shù)商品化蛇毒鑒定試劑盒供應(yīng)。免疫法鑒定蛇傷雖然還存在一些需要解決的關(guān)鍵問題（主要是特異性抗體的篩選），但其發(fā)展前景無疑是非常光明的，其所具有的高靈敏度和快速響應(yīng)等優(yōu)點非常適合臨床應(yīng)用。未來，在解決了抗體特異性的問題以后，免疫法鑒定蛇傷可能被臨床廣泛接受。

另一個有發(fā)展前景的鑒定方法是質(zhì)譜法，但該方法起步較晚，相對于免疫方法其基礎(chǔ)薄弱、數(shù)據(jù)積累少，而且目前的質(zhì)譜法鑒定蛋白質(zhì)存在耗時過長和儀器操作過于復(fù)雜的缺點，還不適宜臨床大規(guī)模應(yīng)用。但值得注意的是，近10年來生物大分子質(zhì)譜鑒定技術(shù)的快速發(fā)展和儀器的快速改良向我們展示了它的潛力，而且質(zhì)譜技術(shù)一次可以鑒定上千個蛋白質(zhì)，讓我們可以用蛋白質(zhì)群來對蛇毒做出歸屬，這對于提高鑒定準(zhǔn)確性非常有利，無疑是非常有吸引力的。隨著質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)流程的快速化、儀器的簡單化，質(zhì)譜法也必將在蛇傷鑒定中發(fā)揮重要作用。

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