血管發(fā)生在慢性牙周炎發(fā)展中的形態(tài)學(xué)初探

李 晶，褚云娟，葉 菁，王 萌，陳 芳，王 欣，劉玲俠，王新文，王勤濤

(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院，陜西西安 710032)

血管發(fā)生在慢性牙周炎發(fā)展中的形態(tài)學(xué)初探

李 晶，褚云娟，葉 菁，王 萌，陳 芳，王 欣，劉玲俠，王新文，王勤濤

(第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)院，陜西西安 710032)

目的:探討血管發(fā)生在牙周炎癥發(fā)展中的可能作用。方法:納入慢性牙周炎患者及牙周組織健康者各15例，分別于翻瓣術(shù)和冠延長(zhǎng)術(shù)中切取牙齦組織，采用SP免疫組化染色觀察血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)、CD31 及基質(zhì)細(xì)胞衍生因子 －1(Stromal cellderived factor－1，SDF－1)在慢性牙周炎牙齦組織中的表達(dá)情況;在×200鏡下選10個(gè)視野計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)CD31的管腔數(shù)目作為血管密度(Microvesslesdensity，MVD);×400鏡下選5個(gè)視野分別計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)SDF－1、VEGF的細(xì)胞數(shù);組間比較用兩樣本均數(shù)(±s)t檢驗(yàn)。結(jié)果:慢性牙周炎組牙齦組織中SDF－1、VEGF和MVD的表達(dá)量分別為135.42±15.58、83.53 ±7.00 和20.80 ±1.74，健康對(duì)照組分別為64.67 ±10.26、41.87 ±5.97 和12.26 ±2.51(組間比較P＜0.05)。結(jié)論:慢性牙周炎牙齦組織中SDF－1、VEGF和MVD的表達(dá)升高，血管發(fā)生在牙周炎的進(jìn)展中可能有促進(jìn)作用。

慢性牙周炎;基質(zhì)細(xì)胞衍生因子－1;血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子;血管密度

［牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2014，24(1):13］

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2014，24(1):13］

慢性牙周炎是由厭氧菌感染造成的，以牙周袋形成、進(jìn)行性附著喪失及牙槽骨破壞為特點(diǎn)的牙周組織慢性炎癥性疾?。?］。炎癥反應(yīng)會(huì)使炎癥牙周組織中的血管數(shù)量增多，而增多的血管又可以為炎癥因子、粘附分子等的產(chǎn)生提供更多的底物，與牙周炎的進(jìn)展密切相關(guān)［2］。炎癥中以血管發(fā)生(angiogenesis)的方式形成新的血管［3］，是指由已存在的血管通過(guò)血管內(nèi)皮細(xì)胞出芽的方式形成新的血管，在創(chuàng)傷愈合、炎癥性疾病及腫瘤的發(fā)展中均具有促進(jìn)性作用［4］。炎癥組織通過(guò)使炎癥生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子表達(dá)升高，參與調(diào)節(jié)血管發(fā)生反應(yīng)［5］;在這些因子中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelialgrowth factor，VEGF)是作用于血管內(nèi)皮的最有力的因子［5］。研究顯示［6］，VEGF 可促進(jìn)組織中血管網(wǎng)的擴(kuò)張，并且在牙周炎的起始及進(jìn)展階段發(fā)揮重要作用。但血管發(fā)生是多種分子信號(hào)相互作用的復(fù)雜過(guò)程，如何客觀評(píng)價(jià)不同狀態(tài)下組織中血管發(fā)生的變化就顯得至關(guān)重要。

另外一種在炎癥發(fā)展中具有重要作用的因子是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子－1(stromal cellderived factor－1，SDF－1)，它是一類(lèi)新近發(fā)現(xiàn)的具有趨化活性的細(xì)胞因子，在介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、造血干細(xì)胞遷移及歸巢、惡性腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移以及HIV感染等方面均發(fā)揮著重要的作用。SDF－1不僅可以誘導(dǎo)單核/巨噬細(xì)胞的募集反應(yīng)［7］;還可與VEGF相互作用，進(jìn)而影響炎癥組織的血管發(fā)生過(guò)程［8］。目前，關(guān)于SDF－1在牙周炎發(fā)展過(guò)程中的作用及其與血管發(fā)生的關(guān)系尚不明確。

本實(shí)驗(yàn)擬通過(guò)免疫組化方法對(duì)比檢測(cè)MVD、VEGF及SDF－1在健康和炎癥牙周組織中的表達(dá)變化，探討牙周炎癥狀況下血管發(fā)生的變化及SDF－1在其中的作用。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

SDF－1鼠抗人單克隆抗體(R＆D公司，美國(guó));VEGF兔抗人單克隆抗體、CD31兔抗人單克隆抗體(Epitomics公司，美國(guó));SP免疫組化試劑盒(中杉公司);DAB顯色劑(武漢博士德公司)。

1.2 受試對(duì)象的選擇

1.2.1 受試對(duì)象

2012－11—2013－07 在我院牙周黏膜病科確診的慢性牙周炎患者(美國(guó)牙周病學(xué)會(huì)1999年及Armitage［9］診斷標(biāo)準(zhǔn))，選取符合納入、排除標(biāo)準(zhǔn)的患者15例(男12例，女3例，年齡35～76歲)作為實(shí)驗(yàn)組;同時(shí)選取需行冠延長(zhǎng)術(shù)，且牙周組織健康者15例(男4例，女11例，年齡23～60歲)作為對(duì)照組。所有參試者均知情同意。

1.2.2 納入標(biāo)準(zhǔn)

慢性牙周炎組:全口剩余牙≥20個(gè)(每個(gè)象限≥2個(gè));擬取材牙臨床探診深度(PD)≥6 mm、臨床附著喪失(CAL)≥5 mm、牙槽骨吸收＞Ⅰ度。

健康對(duì)照組:無(wú)牙周病史及缺牙;擬取材牙無(wú)牙齦自發(fā)性出血、無(wú)BOP、所有位點(diǎn)的PD均＜3 mm。

1.2.3 排除標(biāo)準(zhǔn)

患全身性疾病(如糖尿病和免疫功能異常等);就診前3個(gè)月服用抗炎藥物和抗腫瘤藥物;口腔局部放射治療者;吸煙和過(guò)度飲酒者;女性妊娠、哺乳期。

1.3 牙齦組織樣本的采集和常規(guī)組織學(xué)觀察

所有受試者均于齦上、下潔治術(shù)后兩周進(jìn)行組織樣本采集。慢性牙周炎組于翻瓣術(shù)中，健康對(duì)照組于冠延長(zhǎng)術(shù)中分別切取各受試者取材牙的頰(唇)或舌(腭)側(cè)全層牙齦組織。所有組織樣本經(jīng)40g/L多聚甲醛固定后，常規(guī)脫水、石蠟包埋，制作厚3 μm的組織切片。然后每組各取3張切片，HE染色，常規(guī)組織學(xué)觀察。

1.4 免疫組織化學(xué)染色觀察

取各組組織切片(每個(gè)樣本3張)用SP免疫組化試劑盒以SP法進(jìn)行免疫組化染色:切片經(jīng)二甲苯、梯度乙醇脫水后，高壓抗原修復(fù);分別滴加SDF－1、VEGF及CD31一抗;4℃過(guò)夜后滴加二抗，DAB顯色，蘇木精襯染。以PBS代替一抗作為陰性對(duì)照，毛細(xì)血管瘤組織作為陽(yáng)性對(duì)照，光學(xué)顯微鏡下分別觀察SDF－1、VEGF、CD31的表達(dá)情況。

血管密度(Microvesslesdensity，MVD)計(jì)數(shù):先在低倍鏡下選取CD31高表達(dá)部位，×200鏡下從該部位隨機(jī)選取不重復(fù)的10個(gè)視野，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野陽(yáng)性表達(dá)CD31的血管數(shù)，取平均值作為該樣本的MVD數(shù)值。

SDF－1及VEGF計(jì)數(shù):低倍鏡下選取 SDF－1、VEGF高表達(dá)部位，再在×400鏡下從該部位隨機(jī)選取不重復(fù)的5個(gè)視野，以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)黃色或棕黃色為陽(yáng)性表達(dá)，分別計(jì)數(shù)每個(gè)視野中陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞數(shù)，取平均值作為該樣本的SDF－1或VEGF陽(yáng)性表達(dá)數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較用兩樣本均數(shù)±s)t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05(雙側(cè))。

2 結(jié)果

2.1 常規(guī)組織學(xué)觀察結(jié)果

HE染色結(jié)果顯示，在健康牙齦組織中僅固有層有少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1a);而在慢性牙周炎牙齦組織中，可見(jiàn)上皮釘突向結(jié)締組織內(nèi)增生并伸長(zhǎng)，上皮下有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(圖1b)。

2.2 免疫組化染色結(jié)果

CD31主要表達(dá)于固有層(圖2a、b);VEGF主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞及炎癥細(xì)胞(圖2c、d);SDF－1主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞、炎癥細(xì)胞及溝內(nèi)上皮細(xì)胞(圖2e、f、g);3種指標(biāo)均顯示在炎癥浸潤(rùn)廣泛部位表達(dá)明顯增強(qiáng)，且牙周炎組表達(dá)明顯多于健康對(duì)照組。

圖1 不同來(lái)源牙齦組織HE染色(×100)

圖2 不同來(lái)源牙齦組織免疫組化染色觀察

2.3 兩組 MVD、VEGF、SDF－1 表達(dá)水平比較

陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，慢性牙周炎牙齦組織中MVD、VEGF、SDF－1各因子的表達(dá)水平均明顯高于健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)(表1)。

表1 兩組VEGF、SDF－1和MVD的表達(dá)水平比較(±s)

表1 兩組VEGF、SDF－1和MVD的表達(dá)水平比較(±s)

*與對(duì)照組相比P＜0.05

標(biāo)記物 健康對(duì)照組 慢性牙周炎組MVD 12.26 ±2.51 20.80 ±1.74*VEGF 41.87 ±5.97 83.53 ±7.00*SDF－1 64.67 ±10.26 135.42 ±15.58*

3 討論

慢性牙周炎主要是由齦下菌斑中的致病菌引起的慢性炎癥性疾病，使牙齦組織常同時(shí)處于損傷與修復(fù)狀態(tài)，并有多種炎癥反應(yīng)及趨化因子產(chǎn)物參與其中［10］。血管發(fā)生作為一種重要的病理變化，參與炎癥狀況下牙周組織的反應(yīng)過(guò)程。血管發(fā)生，即在已存在的微血管上形成新生血管，其過(guò)程對(duì)組織再生及炎癥性病理反應(yīng)均具有重要的意義［11］。Bullon P等研究顯示［12］，在炎癥牙周結(jié)締組織中血管有量及質(zhì)上的變化，主要表現(xiàn)為血管密度的升高和血管直徑的增大，使炎癥的反應(yīng)和嚴(yán)重程度增加;另有研究顯示，炎癥狀態(tài)下血管基底膜顯著增厚，尤其表現(xiàn)于毛細(xì)血管和小靜脈［13］。本研究以MVD計(jì)數(shù)方法評(píng)價(jià)牙齦組織中血管發(fā)生的狀態(tài)，結(jié)果也顯示慢性牙周炎中牙齦組織中的MVD數(shù)明顯高于健康對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。綜合以上研究提示，血管發(fā)生可作為牙周炎癥程度的評(píng)估指標(biāo)之一。

Chapple等［14］報(bào)道，牙周炎時(shí)其牙周袋底上皮血管發(fā)生的平衡狀況發(fā)生紊亂，并證明該現(xiàn)象是由VEGF的表達(dá)改變?cè)斐?。正常組織中VEGF的表達(dá)水平較低，其作用主要是維持血管的正常功能、血管密度以及血管運(yùn)送營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)所必需的通透性;但在一些病理情況下，如在炎癥和腫瘤時(shí)，則可出現(xiàn)VEGF的過(guò)量表達(dá)。有研究顯示，VEGF可能是牙周炎早期階段的重要病因因子，并參與牙齦炎向牙周炎的發(fā)展過(guò)程［2］。本結(jié)果顯示，牙周炎牙齦組織中的VEGF表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P＜0.05)，且主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞和炎癥細(xì)胞，提示VEGF可能同時(shí)影響血管發(fā)生和炎癥的聚集，從而促進(jìn)牙周炎癥的發(fā)展。牙周炎中VEGF表達(dá)的上升可以提高新血管的形成和血管的通透性，可作為牙周炎嚴(yán)重程度的一個(gè)標(biāo)志分子。

SDF－1(又名 CXCL12)是CXC趨化因子家族成員之一，可與CXC趨化因子受體－4(CXCR4)相結(jié)合而在調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)、調(diào)控造血、惡性腫瘤細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、血管生成等方面發(fā)揮著重要作用。研究表明，SDF－1在運(yùn)輸淋巴細(xì)胞、造血干細(xì)胞及內(nèi)皮祖細(xì)胞的過(guò)程中均起著關(guān)鍵性作用［15］。Hosokawa 等［16］報(bào)道，SDF－1 和 CXCR4 在正常的牙齦組織中均有表達(dá)，且主要表達(dá)于成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞及單核細(xì)胞。Havens等［17］發(fā)現(xiàn)，SDF－1α的水平與牙周組織炎癥狀況相關(guān)，其在牙周炎牙齦組織及其齦溝液中的表達(dá)水平明顯高于正常組織。Herna'ndez M等［18］報(bào)道，接種Pg小鼠的牙周組織中SDF－1α的表達(dá)明顯升高，表明SDF－1的過(guò)表達(dá)可能與牙周炎的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。本結(jié)果顯示，SDF－1在炎癥牙齦組織中的表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照組(P＜0.05)，且主要表達(dá)于所有內(nèi)皮細(xì)胞以及固有層炎癥浸潤(rùn)處的淋巴細(xì)胞，表明SDF－1可能在促進(jìn)牙周炎時(shí)炎癥細(xì)胞聚集及血管發(fā)生中具有重要作用。

內(nèi)皮細(xì)胞不僅可合成并分泌 SDF－1，又是SDF－1/CXCR4軸實(shí)現(xiàn)其特有功能的平臺(tái)，因此SDF－1在內(nèi)皮細(xì)胞形成血管的過(guò)程中起著重要作用。有研究表明，血管異常增殖及缺氧缺血是誘導(dǎo)VEGF高表達(dá)的重要因素，缺氧因子既能誘導(dǎo)VEGF高表達(dá)，也能促使 SDF－1的表達(dá)增高［19］。Salvucci［20］在對(duì)微血管的發(fā)生及形成的研究中也證實(shí)了這種相關(guān)性:VEGF以及堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(bFGF)能夠促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)SDF－1;當(dāng)阻斷SDF－1/CXCR4的功能時(shí)，則可抑制血管生長(zhǎng)因子依賴的血管形成作用。另有研究也發(fā)現(xiàn)，SDF－1反之能誘導(dǎo) VEGF高表達(dá)，并促進(jìn) VEGF分泌［21］?？梢?jiàn)，SDF－1與VEGF之間能夠相互影響，從而對(duì)各自生物學(xué)功能起促進(jìn)作用。本結(jié)果也表明，SDF－1和VEGF可能是介導(dǎo)慢性牙周炎發(fā)生及進(jìn)展中的重要因子，并通過(guò)影響炎癥反應(yīng)中的血管發(fā)生而發(fā)揮作用，但其具體機(jī)制尚需進(jìn)一步的探討。

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Angiogenesis in Chronic Periodontitis

LI Jing，CHU Yun－juan，YE Jing，WANG Meng，CHEN Fang，WANG Xin，LIU Ling－xia，WANG Xin－wen，WANG Qin－tao
(School of Stomatology，The Fourth Military Medical University，Xi'an 710032，China)

AIM:To investigate the expression of stromal cellderived factor－1(SDF－1)，vascular endothelialgrowth factor(VEGF)and CD31 in periodontal tissues with chronic periodontitis.METHODS:15 patients with chronic periodontitis and 15 periodontally healthy individuals were included.Thegingival tissues of the subjects were resected and immunohistochemically stained.The CD31 positive lumen was counted as microvesslesdensity(MVD)under 200 magnification in 10 fields.The SDF－1and VEGF positive cells were counted under 400 magnification in 5 fields.T － test was used to analyze thedata.RESULTS:The SDF－1，VEGF and MVD positive counts in chronic periodontal tissues were 135.42 ±15.58，83.53 ±7.00 and 20.80 ±1.74，in healthy periodontal tissues 64.67 ±10.26，41.87 ±5.97 and 12.26 ±2.51，respectively(P ＜0.01 betweengroups).CONCLUSION:Angiogenesis may play a positive role in thedevelopment of periodontitis.

chronic periodontitis;stromal cellderived factor－1(SDF－1);vascular endothelialgrowth factor(VEGF);microvesslesdensity(MVD)

R780.2

A

1005－2593(2014)01－0013－05

2013－08－31

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目資助(81271137)

李晶(1988－)，女，漢族，河北邯鄲人。碩士生(導(dǎo)師:王勤濤)

王勤濤，E －mail:yznmbk@fmmu.edu.cn