牙周慢性炎癥對牙周膜干細胞生物學(xué)特性的影響

劉亞麗，劉文佳，胡成虎，丁 寅，金 巖

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650031;2.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710032)

牙周慢性炎癥對牙周膜干細胞生物學(xué)特性的影響

劉亞麗1，劉文佳2，胡成虎2，丁 寅2，金 巖2

(1.昆明醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，云南昆明 650031;2.第四軍醫(yī)大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，陜西西安 710032)

目的:探討牙周慢性炎癥對牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells，PDLSCs)生物學(xué)特性的影響。方法:體外有限稀釋法克隆化培養(yǎng)健康個體和慢性牙周炎患者牙周膜干細胞(H-PDLSCs和P-PDLSCs)，免疫熒光染色法分析細胞表面分子;克隆形成和Edu染色檢測細胞增殖能力;并通過體外成骨、成脂、成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)，比較兩組PDLSCs多向分化能力。結(jié)果:慢性牙周炎患者牙周膜組織中可分離培養(yǎng)出PDLSCs，與分離自牙周健康者的H-PDLSCs相比，其增殖能力升高，但分化能力減弱(P＜0.05)。結(jié)論:牙周慢性炎癥微環(huán)境可降低PDLSCs的分化潛能。

牙周膜干細胞;慢性牙周炎;微環(huán)境

［牙體牙髓牙周病學(xué)雜志，2014，24(1):21］

［Chinese Journal of Conservativedentistry，2014，24(1):21］

牙周病是一種慢性炎癥性骨吸收疾病，影響全世界高達90% 以上的人口，是導(dǎo)致成人牙齒喪失最主要的原因［1］。牙周病治療的關(guān)鍵是消除局部刺激因素、控制感染并誘導(dǎo)牙周支持組織的修復(fù)和再生［2］。近年來，組織工程學(xué)利用牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cell，PDLSCs)修復(fù)和再生病變牙周組織已成為牙周病治療的新手段［3-4］。組織工程學(xué)再生理論認為:引起組織再生失敗的主要原因是由于種子細胞的數(shù)量及其生物學(xué)特性的缺陷，同時局部的微環(huán)境也影響種子細胞功能的發(fā)揮。所以深入了解 PDLSCs在不同微環(huán)境中生物學(xué)特性的差異，對牙周膜干細胞所介導(dǎo)的炎性骨破壞性疾病的治療具有重要的意義。患慢性牙周炎時，其組織的形成和再生均受到抑制，這可能與炎癥微環(huán)境影響了干細胞的分化功能有關(guān)。因此，本實驗分別從牙周健康和牙周炎癥個體的牙周膜組織中分離、培養(yǎng)牙周膜干細胞(H-PDLSCs和P-PDLSCs)，通過比較兩者在增殖和分化能力方面的差異，探討炎癥微環(huán)境對 PDLSCs生物學(xué)特性的影響。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

α-MEM培養(yǎng)基、谷氨酰胺、青鏈霉素(Gibco，美國);胎牛血清(杭州四季青公司);I型膠原酶、2.5g/L胰蛋白酶、甲苯胺藍、抗壞血酸、地塞米松、β-甘油磷酸鈉、TGF-β1、茜素紅、油紅 O(Sigma，美國);鼠抗人STRO-1、CD 146/MUC 18單克隆抗體(R＆D Systems，美國);羅丹明山羊抗小鼠 IgG(中杉金橋);倒置相差顯微鏡以及照相系統(tǒng)(O-lympus，日本)。

1.2 人牙周膜干細胞的培養(yǎng)和分離

1.2.1 取材和原代培養(yǎng)

收集29～38歲志愿者因正畸需要拔除的牙體牙周組織健康前磨牙或第三磨牙8個，同時收集31～42歲因慢性牙周病(X線示牙槽骨吸收＞牙根2/3，牙周袋深度＞5 mm)而拔除的牙周病患牙7個。牙齒拔除后立即用含雙抗(青鏈霉素)的PBS液和α-MEM培養(yǎng)液反復(fù)交替沖洗，體視顯微鏡下修剪去除上皮組織和炎性肉芽組織后，用銳利的刀片剝離牙根表面的牙周膜組織并剪成1 mm×1 mm×1 mm的小塊，分別接種于6孔培養(yǎng)板內(nèi);組織塊上輕置無菌蓋玻片并加入少量 α-MEM培養(yǎng)液，37℃，50 mL/L二氧化碳孵箱中培養(yǎng)。每3d換液 1次，待細胞從組織塊邊緣爬出并生長達80% 匯合時，胰酶消化傳代。

1.2.2 有限稀釋法克隆化培養(yǎng)人牙周膜干細胞

取對數(shù)生長期的第1代牙周膜細胞，用α-MEM培養(yǎng)液重懸并調(diào)整細胞密度至10～15/mL后，接種于96孔培養(yǎng)板(每孔100 μL)，37℃ CO2孵箱中培養(yǎng)過夜，標(biāo)記單個細胞孔后繼續(xù)培養(yǎng);待克隆達孔底面積的1/3～1/2時，胰酶消化單克隆細胞，將多個單克隆來源的細胞懸液混合，形成多克隆PDLSCs，繼續(xù)擴大培養(yǎng)。取第2～4代牙周健康組和慢性牙周病組的牙周膜干細胞(H-PDLSCs和P-PDLSCs)用于以下實驗。

1.3 兩種PDLSCs生物學(xué)特性的比較觀察

1.3.1 克隆形成能力觀察

分別取第 3代 H-PDLSCs和 P-PDLSCs，以1×106/mL密度接種于9 cm培養(yǎng)皿中常規(guī)培養(yǎng)。第14天時終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)液，PBS浸洗2次，用40g/L多聚甲醛液固定15 min;PBS浸洗2次，顯微鏡下觀察兩種細胞的克隆形成情況。以＞50個細胞的集落記為一個克隆，并按以下公式計算克隆形成率:

1.3.2 免疫熒光法檢測細胞表面分子CD146和STRO-1

分別取第3代 H-PDLSCs和 P-PDLSCs，以3×103/mL的密度接種于24孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)過夜后，用40g/L多聚甲醛液固定20 min，PBS洗3遍，加羊血清封閉30 min;直接加鼠抗人CD146和STRO-1單克隆抗體，4℃孵育過夜;PBS洗3次，加山羊抗小鼠IgG二抗，37℃孵育40 min;PBS洗3遍，Hochest胞核襯染，洗凈后熒光顯微鏡下避光觀察并拍照。

1.3.3 Edu染色檢測細胞的增殖能力

分別 取第3代 H-PDLSCs和 P-PDLSCs，以3×103/mL的密度接種于 24孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)過夜后，更換無血清的培養(yǎng)液饑餓培養(yǎng)12 h;更換含100 mL/L FBS的新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)過夜;40g/L多聚甲醛液固定 20 min，PBS洗3遍，按照Edu染色試劑盒操作指南進行 Edu染色，鏡下觀察染色陽性細胞數(shù)并拍照。

1.3.4 兩種PDLSCs分化能力的比較觀察

1.3.4.1 成骨分化能力的觀察

分別取第 3代 H-PDLSCs和 P-PDLSCs，以1×106/mL的密度接種于6孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)至細胞生長達60%以上融合時，更換礦化誘導(dǎo)液(含10 mol/L 地 塞 米 松、50 μg/mL 維 生 素 C、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉的α-MDM)進行成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)。21d后，棄培養(yǎng)液，40g/L多聚甲醛液固定;茜素紅染色，鏡下觀察、拍照;并用圖像分析軟件 Image-Pro Plus 5.0(Media Cybernetics，美國)計算礦化結(jié)節(jié)面積。

1.3.4.2 成脂分化能力的觀察

分別取上述兩種第3代細胞，以1×106/mL的密度接種于6孔培養(yǎng)板，常規(guī)培養(yǎng)至細胞擴增達90%以上時，更換成脂誘導(dǎo)液(含0.25 μmol/L地塞米松、100 mmol/L吲哚美辛、0.5 mmol/L IBMX、10 mg/L胰島素的α-MEM)進行成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)14d后，棄培養(yǎng)液，40g/L多聚甲醛液固定;油紅O染色，鏡下觀察、拍照;并用圖像分析軟件計算脂滴面積。

1.3.4.3 成軟骨分化能力的觀察

分別取上述兩種第3代細胞，制成密度為6×106/mL的細胞懸液，經(jīng)高速離心成細胞團后，加入成軟骨誘導(dǎo)液(含上述兩種10 nmol/L地塞米松、10 ng/mL TGF β1、10 μg/mL 胰 島 素 的α-MEM)進行成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)。21d后取細胞團包埋并制作切片，HE和甲苯胺藍染色，鏡下觀察、拍照;并用圖像分析軟件計算軟骨面積。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計分析，兩獨立樣本均數(shù)比較用t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 兩種PDLSCs形態(tài)和克隆形成率比較

組織塊法原代培養(yǎng)3～7d，組織塊周圍即有細胞爬出。傳代培養(yǎng)的兩種PDLSCs均為典型的紡錘形，成簇螺旋生長，培養(yǎng)3d后細胞可達到90%匯合。有限稀釋單克隆挑選培養(yǎng)14d后，P-PDLSCs的克隆形成率約為40%(圖1a～c)，高于H-PDLSCs的28%(圖1d～f)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

2.2 兩種PDLSCs細胞表面分子的比較

純化后的H-PDLSCs和 P-PDLSCs，均表達間充質(zhì)干細胞特有的表面標(biāo)志物STRO-1和 CD-146(圖2)，兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 兩種PDLSCs細胞增殖能力的比較

Edu染色顯示核紅染的細胞為陽性細胞，即為正在增殖的細胞。經(jīng)計數(shù)，P-PDLSCs的陽性率為35%，H-PDLSCs的陽性率為20%，兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)(圖3)。

2.4 兩種PDLSCs成骨分化能力的比較

兩種細胞經(jīng)成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)7d后，復(fù)層生長的PDLSCs基質(zhì)中可見褐色結(jié)節(jié)，隨著誘導(dǎo)時間的延長，褐色結(jié)節(jié)的數(shù)量逐漸增多。于培養(yǎng)21d時，茜素紅染色定量分析顯示，P-PDLSCs所形成礦化結(jié)節(jié)的數(shù)目明顯少于H-PDLSCs(圖4)，兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.5 兩種PDLSCs成脂分化能力的比較

兩種細胞經(jīng)成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)7d后，即可見細胞中有黃色小脂滴出現(xiàn)，主要集中于細胞核周圍。誘導(dǎo)14d時，油紅 O染色可見脂滴呈橘紅色;其中P-PDLSCs形成的脂滴顆粒小且分散，而H-PDLSCs形成的脂滴較大且多(圖5);成脂量化分析顯示，兩組差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.6 兩種PDLSCs成軟骨分化能力的比較

兩種細胞經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)21d時HE和甲苯胺藍染色顯示，細胞體積變大，形態(tài)由長梭形變?yōu)轭悎A形，即為軟骨樣細胞(圖6);成軟骨量化分析顯示，H-PDLSCs軟骨形成的面積多于P-PDLSCs，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05)。

圖1 兩種PDLSCs形態(tài)及克隆形成情況(×20)

圖2 兩種PDLSCs STRO-1和CD146的表達情況比較(細胞免疫熒光，×40)

圖3 兩種PDLSCs增殖能力的比較(Edu染色，×40)

圖4 兩種PDLSCs成骨能力比較(茜素紅染色，×100)

圖5 兩種PDLSCs成脂能力比較(油紅O染色，×100)

圖6 兩種PDLSCs成軟骨能力的比較(HE、甲苯胺藍染色，×40)

3 討論

PDLSCs是存在于牙周組織中的成體干細胞，具有自我更新和多向分化的潛能。當(dāng)牙周組織受到損傷時，PDLSCs能大量增殖并分化使牙周組織得以再生和修復(fù)。然而，慢性牙周炎患者的牙周組織受炎性破壞后，PDLSCs則不完全具備足夠的對抗病變的增殖和再生能力。研究證實，干細胞周圍局部微環(huán)境(即干細胞巢)對干細胞的定位、數(shù)目和生物學(xué)功能都具有重要的調(diào)控作用［5］。Schneider等［6］研究發(fā)現(xiàn)，分離自老年個體的骨髓基質(zhì)干細胞(BMMSCs)的增殖和分化能力均低于分離自年輕個體的干細胞。另有研究表明，微環(huán)境異常會導(dǎo)致干細胞的功能缺陷，從而引起疾病的發(fā)生［7］。慢性炎癥微環(huán)境中存在的各種炎性因子均會影響內(nèi)源性干細胞的生物學(xué)特性。有研究顯示，外傷引起的炎癥能降低神經(jīng)干細胞的分化能力，如通過控制炎癥的發(fā)展則能恢復(fù)神經(jīng)干細胞的再生潛能［8-9］。另有研究表明，持續(xù)性的慢性炎癥環(huán)境可使干細胞的增殖和遷移能力下降，并通過改變干細胞內(nèi)在分子通路抑制其組織再生修復(fù)的潛能［10-11］。

本實驗結(jié)果顯示:慢性牙周病患者的牙周膜中亦存在PDLSCs，并具有與H-PDLSCs相同的細胞形態(tài);而且也表達間充質(zhì)干細胞特有的表面標(biāo)志物STRO-1和CD-146。通過對兩種細胞增殖能力的比較發(fā)現(xiàn)，P-PDLSCs的增殖能力明顯高于H-PDLSCs，但其多向分化潛能則低于H-PDLSCs。該結(jié)果提示PDLSCs生物學(xué)特性的變化可能與牙周炎癥微環(huán)境中炎癥因子的改變密切相關(guān)。Kastrinaki MC等［12］報道，從風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者分離出的BMMSCs，其多向分化能力低于從正常個體分離出的BMMSCs，與本實驗結(jié)果一致。但本研究只是從現(xiàn)象上觀察了慢性牙周炎癥微環(huán)境對其PDLSCs增殖和分化能力的影響，其具體影響機制尚不清楚，有待更深入的研究。

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The effects of chronic inflammation in periodontal microenvironment on the characteristics of human periodontal ligament stem cells

LIU Ya-li*，LIU Wen-jia，HU Cheng-hu，DIN Yin，JIN Yan
(*School of Stomatology，Kunming Medical University，Kunming 650031，China)

AIM:To investigate the effects of chronic periodontal inflammatory microenvironment on the biological characteristics of periodontal ligament stem cells(PDLSCs).METHODS:PDLSCs were isolated by the limiteddilution technique from the periodontal ligament tissue of healthy individuals and the patients with periodontitits respectively(H-PDLSCs and P-PDLSCs).The proliferation and clone formation of the cells were studied by Edu staining and clone formation assay，the osteogenic，adipogenic and chondrogenicdifferentiation wasdetermined by multi-directionaldifferentiation assay.RESULTS:PDLSCs were successfully obtained from the periodontal ligament tissue of both healthy individuals and the patients with periodontitis.P-PDLSCs exhibiteddecreased multipotentdifferentiation potential and increased proliferation ability compared with H-PDLSCs(P ＜0.05).CONCLUSION:The chronic inflammatory microenvironment may inhibite thedifferentiation potential of PDLSCs.

periodontal ligament stem cells(PDLSCs);chronic periodontal inflammation;microenvironment

R781.4

A

1005-2593(2014)01-0021-05

2013-02-17

國家自然科學(xué)基金資助項目(31030033)

劉亞麗(1978-)，女，漢族，云南人。博士，副教授

丁 寅，E-mail:dingyin@fmuu.edu.cn

金 巖，E-mail:yanjin@fmmu.edu.cn