灰葡萄孢對殺菌劑抗性研究進展

韓之琪 賁海燕 謝學文 石延霞李寶聚

（中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

灰葡萄孢對殺菌劑抗性研究進展

韓之琪 賁海燕 謝學文 石延霞*李寶聚*

（中國農業(yè)科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

灰葡萄孢寄主范圍廣泛，可引起多種蔬菜、果樹及觀賞作物發(fā)生灰霉病。近年來，灰葡萄孢對殺菌劑產生越來越嚴重的抗藥性，本文綜述了國內外多種寄主植物上的灰葡萄孢對不同殺菌劑產生的抗藥性、抗性機制、抗性菌株檢測方法等方面的研究進展，并對未來研究方向進行了展望。

灰葡萄孢；抗藥性；檢測方法；綜述

灰霉病由灰葡萄孢（Botrytis cinerea）感染寄主引起，其有性世代為富克爾核盤菌（Botrytinia fuckeliana），可以為害番茄、黃瓜、西葫蘆、草霉、葡萄、菜豆以及一些花卉作物，造成嚴重的經濟損失。一直以來，防治灰霉病主要依靠化學藥劑，但由于灰葡萄孢的產孢量大，寄主范圍廣，存在準性生殖和異核現(xiàn)象，遺傳變異量大（Hansen & Smith，1932），導致其在過去的幾十年中由于大量施用化學藥劑而產生嚴重的抗藥性。

1 灰葡萄孢的抗藥類型及抗性機制

1.1苯并咪唑類殺菌劑（Benzimidazol，Ben）

Ben類殺菌劑包括苯菌靈、多菌靈、甲基托布津等。研究表明，該類藥劑主要是通過與病原菌的β-微管蛋白結合從而影響微管發(fā)揮功能，進而對菌株產生藥效。而抗性菌株表現(xiàn)出β-微管蛋白與殺菌劑的親和力下降（Davides，1986）。分子學研究認為，菌株對Ben類殺菌劑的抗性與病原菌β-微管蛋白基因上個別堿基發(fā)生突變有關，突變位點主要集中在氨基酸第198位和第200位，高抗菌株的β-微管蛋白基因第198位密碼子由GAG（Glu）突變成GCG（Ala）或AAG（Lys）；中抗菌株的第200位密碼子由TTC（Phe）突變成TAC（Tyr）（Banno et al.，2008）。當抗性種群產生并上升到一定比例后，該類殺菌劑的防效會顯著降低，甚至失效；而且對該類殺菌劑的抗性不會因為Ben類殺菌劑停用而下降。

1.2二甲酰亞胺類（Dicarboximides，DCFs）

DCFs類殺菌劑包括腐霉利、異菌脲、乙烯菌核利等。20世紀70年代后，由于灰葡萄孢對Ben類殺菌劑產生了廣泛的抗藥性，新開發(fā)出的DCFs類殺菌劑開始應用于灰霉病的防治。在其廣泛應用的同時，灰葡萄孢對該類藥劑的抗性也開始有所表現(xiàn)。

關于DCFs類殺菌劑對灰葡萄孢的殺菌機制已有研究報道。在形態(tài)學上，病原菌表現(xiàn)出明顯的分枝增加、局部腫脹等，藥劑濃度高時可導致其脹裂（Sisler，1988）。然而此類藥劑殺菌的分子生物學機制的研究還處于初始階段。最近有關研究表明，DCFs類殺菌劑可能通過干擾滲透壓傳導途徑發(fā)揮抑菌作用（Oshima et al.，2006）。Lerous等（2002）研究發(fā)現(xiàn)，灰葡萄孢對DCFs類殺菌劑的抗性可能與編碼組氨酸激酶基因的突變有關，對灰葡萄孢野生抗性菌株的雙組分組氨酸激酶基因BcOs1進行克隆測序，該基因編碼的蛋白N端以92個氨基酸為單位的6個串連重復區(qū)是DCFs類殺菌劑的結合位點，其中第2個重復區(qū)的氨基酸突變與抗藥性的產生有關。Oshima等（2002）研究發(fā)現(xiàn)位于第2個重復區(qū)的第365位的異亮氨酸突變?yōu)榻z氨酸，這一突變與抗性產生相關。此后，Banno等（2008）利用雜交探針技術檢測出該區(qū)域的位點突變可能有I365S、V368F、Q369H和Q369P。因此決定灰葡萄孢的抗性突變位點尚無定論，有待更進一步的研究證實。

1.3 N-苯基氨基甲酸酯類（N-phenylanilines，NPC）

NPC類殺菌劑的代表藥劑為乙霉威，其作用機理與Ben類殺菌劑相同，都是作用于病原菌的β-微管蛋白，阻礙有絲分裂（Yarden & Katan，1993）。在灰霉病的防治中，Ben類殺菌劑是應用最早的一類殺菌劑，也是目前產生抗性最嚴重的一類。由于NPC類與Ben類呈負交互抗性，因此將二者制成混劑使用，防治蔬菜灰霉病效果顯著，可以解決灰葡萄孢對Ben類殺菌劑的抗性問題。

但隨著這類殺菌劑的廣泛使用，對NPC類和Ben類殺菌劑的雙抗菌株在田間出現(xiàn)，并快速擴增。而且已經出現(xiàn)對Ben類、DCFs類和NPC類殺菌劑的多抗菌株，北京地區(qū)已檢測到了對這3類殺菌劑都產生抗性的抗藥類型：BenRDicSNPCS、BenSDicSNPCR、BenRDicRNPCS和BenRDicRNPCR（喬廣行 等，2011）。

1.4苯胺基嘧啶類（Anilinopyrimidines）

苯胺基嘧啶類殺菌劑是在灰葡萄孢對NPC類殺菌劑產生抗性后研制而成的，目前主要有5種：嘧菌胺（mepanipyrim）、嘧菌環(huán)胺（cyprodinil）、嘧霉胺（pyrimethanil）、氟嘧菌胺（diflumetorim）和andoprim（劉長令 等，2000）。關于此類殺菌劑的作用機制目前有2種假說，一是通過抑制胱硫醚β-裂解酶來抑制菌體內甲硫氨酸的生物合成，從而抑制菌絲的生長；另一種可能是通過抑制病菌胞外蛋白酶（包括水解酶）的分泌阻礙病菌發(fā)揮致病性（Miura et al.，1994；Milling & Richardson，1995）。然而灰葡萄孢對嘧霉胺的抗藥性也已經產生，瑞士（Hilber & Schüepp，1996）、法國（Chapeland et al.，1999）、智利（Latorre et al.，2002）等地相繼報道灰葡萄孢對這類藥劑產生了抗性。雖然嘧霉胺在我國的使用年份不長，但已有報道稱在遼寧、江蘇、浙江等地發(fā)現(xiàn)了抗嘧霉胺菌株（紀明山 等，2003）。

1.5對苯二酚氧化抑制劑類（Quinol oxidation inhibitors，QoIs）

QoIs類殺菌劑的代表藥劑為醚菌酯和嘧菌酯。該類殺菌劑的作用機制是通過束縛致病菌的細胞色素bc1復合體外的對苯二酚氧化位點，達到阻滯電子傳遞的效果，導致ATP合成量大幅降低，從而達到殺菌的效果（Fernández-Ortu?o et al.，2008）。但是目前也已經發(fā)現(xiàn)有多種病原菌對QoIs類殺菌劑產生了抗藥性，其中包括灰葡萄孢（Wedge et al.，2007）。

研究表明，病原菌對QoIs類殺菌劑產生抗性的分子機制與靶標位點選擇和編碼線粒體中細胞色素b的基因突變有關（Sierotzki et al.，2007）。在已經產生抗藥性的致病菌中發(fā)現(xiàn)3種類型的氨基酸替換，分別是第143位密碼子由甘氨酸突變成丙氨酸，第137位密碼子由甘氨酸突變成丙氨酸，第129位密碼子由苯丙氨酸突變成亮氨酸，其中發(fā)生第143位密碼子突變的菌株抗藥性最強（Gisi et al.，2002；Kim et al.，2003）。

1.6其他新型殺菌劑

除以上幾類常用藥劑之外，一些新型藥劑也被用來防治灰霉病，如DMI類殺菌劑（戊唑醇）、酰胺類殺菌劑（環(huán)酰菌胺）以及苯基吡咯類（咯菌腈）等。近期在一些國家報道了有關此類新型藥劑的抗性菌株，如德國發(fā)現(xiàn)了對環(huán)酰菌胺和咯菌腈的抗性菌株（Weber & Hahn，2011）；2007～2009年、2011年，在智利葡萄園中發(fā)現(xiàn)了對戊唑醇、環(huán)酰菌胺和咯菌腈的單抗及多抗菌株（Latorre & Torres，2012）。但目前還沒有關于此類殺菌劑抗性機制研究的報道。

2 抗藥性的生物化學檢測方法

隨著灰葡萄孢抗藥性的逐年增高，在推廣某一類型的殺菌劑后開展抗藥性監(jiān)控（包括抗性頻率、抗性水平和抗性亞群體的分布）是病害綜合防治中不可缺少的內容。目前，國內外對灰葡萄孢抗藥性的檢測方法仍以生物化學方法為主，包括傳統(tǒng)的殺菌劑室內生測方法：孢子萌發(fā)法、菌絲生長速率法以及微孔板法。前兩者都是以含藥培養(yǎng)基為介質，觀察菌絲或者孢子的生長狀況，并以此作為判定是否產生抗藥性的依據；微孔板法是一種新的檢測方法，是利用酶標儀的比色功能快速檢測微孔板（96孔板）中懸浮液的吸光度值（OD值），以OD增加值作為評價指標。與前兩種傳統(tǒng)方法相比，微孔板法綜合了孢子萌發(fā)法和菌絲生長速率法的優(yōu)勢，測試速度快、結果準確、重現(xiàn)性好，具有良好的實用性（楊曉楠 等，2012）。

3 抗藥性的分子生物學測定技術

目前，對于已明確抗性突變位點的菌株，以PCR反應為基礎的分子檢測技術方便快捷，并且發(fā)展迅速。本文主要介紹以下3種：PCR-RFLP技術、ARMS-PCR技術和雜交探針測定技術。

3.1限制性片段長度多態(tài)性聚合酶鏈式反應（PCR-RFLP）技術

該技術的基本原理是利用設計的特異性引物對目標核酸片段進行PCR擴增，PCR產物用特異性內切酶消化切成大小不同的片段，檢測其多態(tài)性，從而檢測目標片段中的突變或缺失。例如對于二甲酰亞胺類的抗性菌株，組氨酸激酶BcOS1基因中的第365位突變可以通過該方法檢測（Oshima et al.，2006）。

3.2等位基因特異PCR（ARMS-PCR）技術

該技術的關鍵是根據已知的突變設計適當的引物，PCR反應中含突變位點的模板因3′末端錯配導致產物減少，以此來檢測基因突變。該方法準確、簡單，與生物化學法的測定結果一致，是一種以傳統(tǒng)PCR技術為基礎的單核苷酸變異鑒定手段，不需要PCR-RFLP以及嵌套式PCR反應，只需一步簡單的PCR就可完成。可以通過該技術確定灰葡萄孢的β-微管蛋白上的單基因突變，有效地鑒定對Ben類殺菌劑具有抗性的菌株（Mu?oz et al.，2009）。

ARMS-PCR技術與PCR-RFLP技術相結合可用來快速鑒定對QoIs類殺菌劑產生抗藥性的灰葡萄孢菌株（Banno et al.，2009）。具體方法：提取抗性菌株的基因組DNA，設計PCR引物cytb-BcF和cytb-BcR，PCR擴增細胞色素b（cytb）的基因序列，接著利用等位基因特異性PCR技術檢測cytb基因中發(fā)生的G-C突變，引物對為BcAR-F和BcAR-R（Jiang et al.，2009），該引物可以擴增出抗性菌株中線粒體基因組的特異片段，大小為260 bp左右，擴增產物在PCR-RFLP體系中經限制性內切酶Ita I的剪切作用產生多態(tài)性片段，通過凝膠電泳分辨，達到鑒定抗性菌株的目的（Sierotzki et al.，2000；Furuya et al.，2009）。

劉德榮 等（2001）利用該技術建立了一種專門用來檢測灰葡萄孢對Ben類和NPC類雙抗菌株的方法，作用原理是根據灰葡萄孢對這兩種殺菌劑的抗性與其β-微管蛋白的第198位和第200位密碼子的單堿基突變有緊密的關系（Yarden & Katan，1993）。具體方法：將突變的單堿基作為正向引物的3′末端，未突變的單堿基作為反向引物的3′末端，自行設計LP4～LP8等5個等位點特異性引物，應用包括這5條引物在內的7組引物對抗性表型為BenSNPCR、BenHRNPCS和BenHRNPCR的菌株進行ASP擴增（劉德榮 等，2001）。

該方法靈敏度高，能夠檢測出相應抗性表型的菌株并能有效地檢測出田間灰霉病的抗藥性，克服了生物檢測方法的費時和準確性差等缺點，可應用于灰葡萄孢抗藥性分子生態(tài)學機理研究和田間抗性菌株的快速鑒定。

3.3雜交探針測定技術

這是一種在實時定量PCR反應基礎上的雜交探針熒光共振能量轉移技術。兩個臨近的寡聚核苷酸探針上的熒光標簽通過熒光共振能量轉移互相識別，從而檢測出模板DNA序列中的堿基變化，通過實時定量PCR的溶解曲線體現(xiàn)。該方法可以用來檢測對Ben類和DCFs類藥劑的抗性突變位點。檢測出的抗Ben殺菌劑類的突變位點有β-微管蛋白BenA基因上的E198A、F200Y和E198K；抗DCFs殺菌劑類的突變位點有組氨酸激酶BcOS1基因上的I365S、V368F、Q369H和Q369P。與PCRRFLP技術和ARMS-PCR技術相比，熒光探針雜交技術操作更簡單，更方便快捷。例如DNA模板的擴增和突變的檢測可以在單管中進行，PCR反應之后不需要進行酶切和電泳。此外，該方法可以檢測出一些還未確定突變的存在，而且可以以溶解曲線分析為依據確定混合DNA模板中的突變個體，并且可以在峰值溫度相差大于5 ℃時，大概估算出此類個體在群體中所占比例。例如，二甲基亞胺敏感菌株（野生型）與抗二甲基亞胺菌株（I365S）的混合DNA的溶解曲線呈現(xiàn)出兩個峰值，峰值溫度差與種群原產地的地理位置有關，即溫差越大相距越遠（Banno et al.，2008）。

4 展望

灰霉病是一類危害嚴重的傳統(tǒng)真菌病害，隨著化學防治的普及，盡管不斷有新型藥劑開發(fā)應用于該病的防治，但灰葡萄孢對不同殺菌劑的抗藥性還是在全球范圍內迅速發(fā)展。從灰葡萄孢的抗藥性的相關研究文獻來看，總體研究雖有進展，但不成熟。由于一些殺菌劑對灰霉病的防治機理以及抗性產生的分子機制的研究還不透徹，無法為檢測方法的建立提供充分理論依據，從而不能實現(xiàn)對抗藥性準確、快速的檢測。所以通過明確不同類型殺菌劑對灰葡萄孢的作用機理以及病菌對其產生抗藥性的分子機制，建立有效的田間抗藥性的分子檢測方法是未來關于灰霉病防治的必然發(fā)展趨勢。

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Research Progress on Botrytis cinerea Resistance to Different Fungicides

HAN Zhi-qi，BEN Hai-yan，XIE Xue-wen，SHI Yan-xia*，LI Bao-ju*

（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

Botrytis cinerea is a phytopathogenic fungi responsible for grey mould，which is an important disease in many species of fruit trees，vegetables and ornamental crops. Recently，B. cinerea has developed increasing severe resistance to a broad range of fungicides. This paper summarizes the research progress about B. cinerea at various host plant’s resistance to drugs，their resistance mechanism and methods for detecting tolerant bacteria reported at home and abroad. It also predicts the future orientation of this study.

Botrytis cinerea；Resistance to fungicides；Detection method；Review

韓之琪，女，碩士研究生，專業(yè)方向：植物病害防治，E-mail：zhiqihan@126.com

*通訊作者（Corresponding authors）：李寶聚，研究員，博士生導師，專業(yè)方向：蔬菜病害診斷與防治，E-mail：libaoju@caas.cn；石延霞，副研究員，碩士生導師，專業(yè)方向：植物病理、蔬菜病害診斷與防治，E-mail：shiyanxia813@163.com

2013-11-11；接收日期：2014-01-09

公益性行業(yè)（農業(yè)）科研專項（201303025），現(xiàn)代農業(yè)產業(yè)技術體系北京市葉類蔬菜創(chuàng)新團隊建設專項（blvt-12）