HPLC法同時(shí)測(cè)定大鼠CYP2B、2C、2E酶活性及其應(yīng)用

代 晶,呂紅霞,王麗聰,涂碎萍,吳 丹

（成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 成都 610081）

HPLC法同時(shí)測(cè)定大鼠CYP2B、2C、2E酶活性及其應(yīng)用

代 晶,呂紅霞,王麗聰,涂碎萍,吳 丹

（成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，四川 成都 610081）

建立同時(shí)測(cè)定大鼠肝微粒體中CYP2B、2C、2E酶活性的HPLC法，并用該方法評(píng)價(jià)氯胺酮對(duì)這3種酶的影響。以鹽酸安非他酮、甲苯磺丁脲、氯唑沙宗作為CYP2B、CYP2C、CYP2E的特異性底物。以非那西丁為內(nèi)標(biāo)，色譜柱為Welchrom C18，流動(dòng)相為甲醇：0.01mol/L乙酸銨（pH 5.0）=55∶45，流速為1mL/min，檢測(cè)波長為220，247，250，280nm，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為40μL。體外孵育反應(yīng)的蛋白濃度為3.75mg/mL，孵育時(shí)間為30min。采用上述方法測(cè)定3種底物在對(duì)照組和氯胺酮給藥組中的代謝速率，結(jié)果顯示，各底物在線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r＞0.9991；日內(nèi)RSD＜12.1%，日間RSD＜12.5%；方法回收率為84.4%～114.3%，提取回收率為93.65%～100.7%。本方法靈敏、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)單，可用于大鼠肝微粒體中CYP2B、2C、2E酶活性的測(cè)定。

CYP2B；CYP2C；CYP2E；高效液相色譜法；肝微粒體；氯胺酮

0 引 言

CYP2酶是CYP450家族中重要的超家族酶系之一，主要包括CYP2B、2C和2E酶等，在人肝臟中約占CYP450總含量35%，參與代謝活化及失活多種臨床藥物、前毒物和前致癌物[1-2]。研究表明CYP2酶?jìng)€(gè)體含量差異大，遺傳基因具有高度多態(tài)性，如CYP2B和CYP2E含量差異分別可達(dá)250倍[3]和50倍[4]，CYP2C有30多種等位基因的突變體[5]。這些特點(diǎn)導(dǎo)

致代謝酶活性存在差異，是藥物代謝的種族和個(gè)體差異的重要原因之一。因此，分析藥物與CYP2酶的關(guān)系對(duì)于臨床合理用藥有著重要意義。鹽酸安非他酮、甲苯磺丁脲和氯唑沙宗分別是CYP2B、2C和2E酶的特異性底物，被廣泛選作底物用于體內(nèi)外測(cè)定酶活性[6]。本試驗(yàn)通過篩選前處理和色譜方法，優(yōu)化樣品孵育條件，建立一種可以同時(shí)測(cè)定大鼠肝微粒體中CYP2B、2C和2E酶底物的HPLC法，為測(cè)定上述酶活性以及研究藥物對(duì)其活性的影響提供簡(jiǎn)單、可靠的方法學(xué)基礎(chǔ)。同時(shí)，應(yīng)用所建立的方法評(píng)價(jià)氯胺酮對(duì)CYP2B、2C和2E酶的影響。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

儀器：高效液相色譜儀（美國Dionex公司），包括P680泵、ASI-100自動(dòng)進(jìn)樣器、UV1700型檢測(cè)器，TC100柱溫箱，Chomeleon工作站。

試劑：甲苯磺丁脲（批號(hào)1001083283）購自美國Sigma-Aldrich公司；氯唑沙宗、非那西?。ㄅ?hào)100364-200301、100095-198904）購自中國藥品生物制品鑒定所；鹽酸安非他酮（批號(hào)1112001，純度＞98%）購自漢江萬全醫(yī)藥化工有限公司；氯胺酮注射液（批號(hào)100819，規(guī)格100mg∶2mL）購自福建古田藥業(yè)有限公司。還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）購自美國Los Angeles公司；甲醇（色譜純）購自美國Dikma公司，其余試劑均為分析純。

動(dòng)物：健康成年的SD大鼠16只，雄性，體重250～300g。購自四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)SYXK（川）2008-113。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

（1）溶液的配制。分別取鹽酸安非他酮、甲苯磺丁脲和氯唑沙宗對(duì)照品適量，用甲醇稀釋成系列濃度的對(duì)照品溶液，其中鹽酸安非他酮和甲苯磺丁脲的濃度分別為5，10，20，50，100，200，500，1 000 μmol/L；氯唑沙宗的濃度分別為4，10，20，40，100，200，400，800μmol/L。取非那西?。▋?nèi)標(biāo)）對(duì)照品適量，用甲醇稀釋成濃度為500μmol/L的溶液。上述溶液置4℃冰箱，備用。

（2）動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和肝微粒體的制備。參考文獻(xiàn)[7]的方法，將大鼠隨機(jī)分為氯胺酮給藥組和對(duì)照組，每組8只。給藥組大鼠按10mg/kg/d氯胺酮生理鹽水溶液灌胃給藥，連續(xù)10d。對(duì)照組大鼠按同等劑量生理鹽水灌胃給藥，連續(xù)10d。在第11d，處死大鼠。采用鈣離子沉淀法制備肝微粒，Bradford法測(cè)定蛋白濃度。

（3）色譜條件。流動(dòng)相為甲醇：0.01mol/L乙酸銨（pH 3.0、4.0、5.0、6.0）=55∶45；色譜柱為Welchrom C18柱（4.6mm×250mm×5μm）；非那西丁、鹽酸安非他酮、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲的檢測(cè)波長分別為247，250，280，220nm；柱溫為30℃；體積流量為1.0mL/min。

（4）前處理方法。方法一：取0.5mL樣品溶液，加入2.0mL甲醇和10μL內(nèi)標(biāo)溶液，渦旋混合3 min后，12000r/min離心10min，取出上清液于50℃氮?dú)饬飨麓蹈?，殘留物?00μL流動(dòng)相溶解，13500r/min離心10min，取出上清液，取40μL進(jìn)樣分析。

方法二：取0.5 mL樣品溶液，加入1.0 mol/L HCl 50μL，再加入2.0mL甲醇和10μL內(nèi)標(biāo)溶液，其余操作參照“方法一”進(jìn)行處理。

（5）分析方法的驗(yàn)證。本試驗(yàn)對(duì)HPLC法進(jìn)行了系統(tǒng)適用性、線性、定量下限、精密度、回收率、穩(wěn)定性的驗(yàn)證。

（6）孵育條件的優(yōu)化。測(cè)定不同反應(yīng)時(shí)間（10，20，30，45，60min）和不同蛋白濃度（1.0，1.5，2.0，2.5，3.75，5.0mg/mL）條件下底物的含量。取鹽酸安非他酮、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲對(duì)照品溶液，揮干溶劑，加入肝微粒體溶液和Tirs-HCl（0.1mol/L，pH 7.4）溶液適量，于37℃水浴預(yù)熱3min后，加入NADPH啟動(dòng)反應(yīng)。反應(yīng)終體積為0.5 mL，NADPH的終濃度為1 mmol/L，鹽酸安非他酮、氯唑沙宗、甲苯磺丁脲的終濃度為50，40，50μmoL/L，于不同時(shí)間和不同蛋白濃度下反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后，將樣品取出，置于冰浴中，參照（3）和（4）項(xiàng)下方法進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件

試驗(yàn)顯示在pH為3.0～6.0范圍內(nèi)，非那西丁、氯唑沙宗的保留時(shí)間幾乎不受影響，而鹽酸安非他酮的保留時(shí)間隨pH的增加而增大，甲苯磺丁脲隨pH的增大而減小。這主要是由于安非他和甲苯磺丁脲酮分別是堿性和酸性化合物，兩者在不同pH條件下解離情況不同，色譜行為不同。而當(dāng)pH達(dá)到5.0時(shí)，各待測(cè)物達(dá)基線分離，內(nèi)源性物質(zhì)不受干擾，整個(gè)分析周期小于15min，試驗(yàn)條件能夠滿足樣品測(cè)定的需要。故本試驗(yàn)選擇為甲醇-0.01 mol/L乙酸銨（55∶45，v/v，pH=5.0±0.02）作為流動(dòng)相。

2.2 前處理方法

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)樣品經(jīng)“方法一”處理后，甲苯磺丁脲、氯唑沙宗均具有較高提取回收率（＞95%），但鹽酸安非他酮的回收率不足30%。而經(jīng)過“方法二”處理后，3個(gè)底物的提取回收率均大于93%。故試驗(yàn)選擇“方法二”做為前處理方法。游離的安非他酮穩(wěn)定性較差，易揮發(fā)，而安非他酮的鹽酸鹽（pKa=7.9）較為穩(wěn)定[8]。本試驗(yàn)樣品溶液的pH為7.4，經(jīng)甲醇沉淀蛋

白后，上清液呈堿性（pH 8.0～8.5），揮干溶劑時(shí)會(huì)造成安非他酮的損失。因此方法二在沉淀蛋白前加入鹽酸，能使游離的安非他酮轉(zhuǎn)化為鹽酸鹽，增加其穩(wěn)定性，提高回收率。本試驗(yàn)曾用高氯酸直接沉淀蛋白，發(fā)現(xiàn)有雜質(zhì)干擾測(cè)定，而且甲苯磺丁脲為磺酰脲類化合物，能夠在強(qiáng)酸條件下水解[9]，故不適合用該法處理樣品。

2.3 分析方法驗(yàn)證

2.3.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

取大鼠的空白肝微粒體溶液、空白肝微粒體加各探針底物和內(nèi)標(biāo)溶液，探針底物肝微粒體孵育30min后的樣品溶液，進(jìn)行處理和測(cè)定，結(jié)果（見圖1）顯示，在此條件下，各探針?biāo)幬镞_(dá)基線分離，內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測(cè)定。

2.3.2 線性關(guān)系及定量限

精密量取底物對(duì)照品溶液各50 μL，制備系列濃度的質(zhì)控樣品溶液（n=3），按建立的方法進(jìn)行處理和測(cè)定，以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)，待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，同時(shí)以信噪比≥10計(jì)算定量下限（LLOQ）。結(jié)果顯示：鹽酸安非他酮、甲苯磺丁脲和氯唑沙宗分別在0.5～100，0.5～100，0.4～80 μmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，對(duì)應(yīng)的回歸方程分別為Y=0.0979X+0.0030（r=0.9999），Y=0.0622X-0.000 5（r=0.999 8），Y=0.0342X-0.011 1（r=0.9991）。定量下限依次為0.5，0.5，0.4μmol/L。

2.3.3 精密度試驗(yàn)和回收率試驗(yàn)

制備低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品溶液（n=6）。按建立的方法在1d內(nèi)進(jìn)樣分析，計(jì)算日內(nèi)精密度，連續(xù)測(cè)定3d，計(jì)算日間精密度。將測(cè)得的待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)峰面積之比代入回歸方程，計(jì)算方法回收率。取同等濃度的各待測(cè)物和內(nèi)標(biāo)的對(duì)照品溶液，直接揮干溶劑，流動(dòng)相溶解后進(jìn)樣分析，將樣品中各待測(cè)物的峰面積與對(duì)照品峰面積進(jìn)行比較，計(jì)算提取回收率，結(jié)果見表1。

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

參照“2.3.3”項(xiàng)下方法，制備低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品溶液，分別置于室溫和-20℃冰箱中。置于室溫的樣品分別于24h和48h后進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果

RSD%＜7.9%。置于-20℃冰箱中的樣品分別于3d和7d后測(cè)定，結(jié)果RSD%＜12.9%。表明各探針底物在室溫48h內(nèi)穩(wěn)定，在-20℃冰箱7d內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 孵育條件優(yōu)化

試驗(yàn)顯示，隨著時(shí)間的延長和蛋白濃度的增大，底物消耗增加，反應(yīng)30min后不再變化。由于在進(jìn)行酶動(dòng)力學(xué)研究時(shí)，要求底物減少速率與微粒體蛋白濃度和孵育時(shí)間呈線性關(guān)系。蛋白濃度過高時(shí)，非特異性結(jié)合將影響底物的反應(yīng)，進(jìn)而影響酶動(dòng)力學(xué)的評(píng)價(jià)[10]。同時(shí)考慮底物減少盡可能的多，因此，本試驗(yàn)選擇蛋白濃度為3.75 mg/mL、反應(yīng)時(shí)間為30 min作為最佳反應(yīng)條件。

2.5 氯胺酮對(duì)CYP2B、2C、2E酶的影響

在上述條件下，比較各底物在氯胺酮給藥組和對(duì)照組的代謝速率（（底物的初始量-底物的剩余量）/孵育時(shí)間/肝微粒體蛋白質(zhì)質(zhì)量，單位為pmol/min/mg）。結(jié)果鹽酸安非他酮、甲苯磺丁脲和氯唑沙宗在給藥組的代謝速率分別為 41.0±10.1、32.3±12.5、78.1± 12.1 pmol/min/mg；在對(duì)照組的代謝速率為 25.7± 5.3，23.7±9.6，70.5±23.3pmol/min/mg。數(shù)據(jù)經(jīng)T檢驗(yàn)顯示，鹽酸安非他酮的代謝速率有顯著性差異（P＜0.05），而甲苯磺丁脲和氯唑沙宗無顯著性差異，表明氯胺酮對(duì)CYP2B有誘導(dǎo)作用，而對(duì)CYP2C和2E無顯著影響。

前期研究發(fā)現(xiàn)，在CYP2系列酶中，只有CYP2B參與了氯胺酮在大鼠肝微粒體中N-去甲基的代謝反應(yīng)，而CYP2C、2E等未參與代謝[11]。該結(jié)果與本試驗(yàn)結(jié)果一致，也進(jìn)一步印證了氯胺酮在體內(nèi)主要與CYP2B存在相互作用，而與CYP2C和2E無相互影響。

3 結(jié)束語

目前，針對(duì)CYP2B、2C和2E酶活性測(cè)定方法主要有熒光法[7，12]、LC/MS法[13-14]等。熒光法底物昂貴，每個(gè)分析周期只能測(cè)定一種酶活性；而LC/MS方法雖然靈敏、準(zhǔn)確，可以同時(shí)測(cè)定多種酶活性，但其檢測(cè)費(fèi)用較貴，儀器普及性不高，對(duì)樣品處理和流動(dòng)相等要求較嚴(yán)格。相較于上述方法，本試驗(yàn)選擇的探針底物較為常見，前處理方法簡(jiǎn)單，檢測(cè)儀器普及性高，可以同時(shí)測(cè)定3種酶的活性，故本方法具有一定優(yōu)勢(shì)。應(yīng)用該方法研究氯胺酮對(duì)CYP2酶活性的影響時(shí)，其結(jié)果與前期研究結(jié)果一致[7，11]。綜上表明，本研究建立的方法準(zhǔn)確、可靠，可用于CYP2系列酶活性的評(píng)價(jià)，也可為一些經(jīng)CYP2系列酶代謝藥物的代謝及與其他藥物的相互作用的研究提供參考方法。

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Determination of CYP2B,2C,2E activities by high performance liquid chromatography and its application

DAI Jing，Lü Hong-xia，WANG Li-cong，TU Sui-ping，WU Dan
（School of Pharmacy，Chengdu Medical College，Chengdu 610081，China）

The HPLC method was established to determine CYP2B，2C，2E activities in rat liver microsome.And the effect of ketamine on CYP2B，2C，2E was evaluated.Bupropion，tolbutamide and chlorzoxazone were employed asthe substratesofCYP2B，2C，2E，respectively.The determination was performed on Welchrome C18 column with phenacetin as an internal standard. The mobile phase was methanol：0.01mol/L ammonium acetate（pH 5.0）=55∶45.The detection wavelengths were set at 220，247，250，280 nm，the column temperature was 30℃ and the injection volume was 40 μL.The substrates’metabolic velocities after incubating with 3.75 mg/mL of liver microsomes for 30min were determined from the control group and the ketamine group.The results showed that the substrates were linearity within their linearity ranges with the correlation coefficients greater than 0.9991.The intra-and inter-assay precisions of CYPs substrates were less than 12.1% and 12.5%，the assay recoveries were between 84.4%and 114.3%，and the extract recoveries were 93.65%-100.7%.This method is simple，sensitive，accurate and suitable for determining CYP2B，2C，2E activities in rat liver microsome in vitro.

CYP2B；CYP2C；CYP2E；HPLC；liver microsome；ketamine

O657.7+2；Q554；R965.2；R971+.2

：A

：1674-5124（2014）04-0063-04

10.11857/j.issn.1674-5124.2014.04.016

2014-03-04；

：2014-04-21

四川省教育廳理科重點(diǎn)項(xiàng)目（12ZA026）

代 晶（1979-），女，吉林省吉林市人，講師，博士，主要從事藥物分析與藥代動(dòng)力學(xué)研究。