壯醫(yī)針挑療法對(duì)哮喘模型小鼠TSLP mRNA及 IL-4、IL-5、IL-13 的影響*

唐漢慶 竇錫彬 李克明 李曉華 朱曉瑩 鄭建宇

（右江民族醫(yī)學(xué)院，廣西 百色 533000）

研究認(rèn)為T細(xì)胞的激活及其釋放的細(xì)胞因子是哮喘炎癥過(guò)程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1］。在炎癥過(guò)程中，Th2細(xì)胞起著重要的介導(dǎo)作用，其釋放的白介素（IL）-4、IL-5、IL-13等細(xì)胞因子與哮喘的炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，胸腺基質(zhì)淋巴細(xì)胞生成素（TSLP)對(duì)Th2細(xì)胞優(yōu)勢(shì)分化有調(diào)控作用。本實(shí)驗(yàn)建立哮喘小鼠模型，觀察壯醫(yī)針挑療法對(duì)哮喘模型小鼠 TSLP mRNA及IL-4、IL-5、IL-13的影響，討論其可能的止咳平喘機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠40只，6～8周齡，體質(zhì)量（26.13±3.14）g，由右江民族醫(yī)學(xué)院科學(xué)實(shí)驗(yàn)中心購(gòu)買并提供，合格證編號(hào)SCXK（京)2013-0001。小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分4組，即對(duì)照組、模型組、針挑組、假針挑組，每組10只。

1.2 試劑和儀器

烏拉坦（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20080610）；卵清蛋白（OVA）（Sigma，USA，批號(hào) s4881）；氯仿（北京化學(xué)試劑公司，批號(hào)20110322）；異丙醇（北京化學(xué)試劑公司， 批號(hào) 20100811）；IL-4、IL-5、IL-13 ELISA 試劑盒（R&B 公司，U.S.A）；Trizol（Gibcobrl公司)；M-MLV（Piomegan 公司)；Tag 酶、DNAmark （北京博奧公司)；TSLP基因引物 （Invitrogen公司）。電子天平（AE160型，瑞士Mettler公司）；電動(dòng)玻璃勻漿機(jī)（DY-89型，寧波新芝公司）；超聲波細(xì)胞破碎機(jī)（SONICS型，U.S.A）；高速低溫離心機(jī)（PK121R型，ALC公司)；超低溫冰箱（MDF-U72V型，日本三洋公司）；酶標(biāo)儀 （MK3型，Thermo Labsystem公司）；凝膠成像系統(tǒng)（chemidoc XRS型，美國(guó)伯樂(lè))；PCR 儀（7900HT 型，ABI公司）；紫外分光光度儀（DU530型，Beckman公司）；大號(hào)縫衣針（長(zhǎng)約 5 cm）；消毒陶瓷片（6 cm×2.5 cm）。

1.3 哮喘小鼠模型制備

參考Perrier等［2］造模方法，加以改良。模型組、針挑組、假針挑組于第1日、4日、7日、10日、13日每日1次，每次1 mL（50 μg/L)分別腹腔內(nèi)注射OVA混懸液進(jìn)行基礎(chǔ)致敏，第14日將小鼠置于有機(jī)玻璃盒中，給予霧化吸入OVA（0.1 mol/LPBS稀釋OVA 1 mg），每日30 min，連續(xù)1周激發(fā)。

1.4 干預(yù)方法

針挑組在激發(fā)階段，激發(fā)后1 h以消毒大號(hào)縫衣針在小鼠頸1、2棘突或胸1、2棘突下及旁開約4 mm（雙側(cè)）取穴位，每次取穴位3～4個(gè)作為挑刺點(diǎn)，將針尖快速刺入穴位表皮并挑起，挑出皮內(nèi)少許纖維組織，然后以消毒陶瓷片割裂表皮，以皮膚不出血為宜，之后用針在該針孔垂直快速點(diǎn)刺，刺入皮下1 mm，出針后以酒精涂抹針口。每日1次，7 d為1個(gè)療程。假針挑組用針及陶瓷片按壓挑刺點(diǎn)但不挑刺；模型組和對(duì)照組不作特殊處理。治療1個(gè)療程。

1.5 檢測(cè)項(xiàng)目

1.5.1 肺組織 TSLP mRNA表達(dá)水平檢測(cè)療程結(jié)束后第1日，按5 mL/kg以20%烏拉坦溶液麻醉并固定。眼球取血1.0 mL，3000 r/min離心10 min后收集血清于-70℃保存。用靜脈穿刺針插入氣管內(nèi)，結(jié)扎左主支氣管，將1.0 mL 0.9%氯化鈉注射液經(jīng)留置針氣道內(nèi)注入，來(lái)回抽吸支氣管肺泡灌洗液，重復(fù)3次。取灌洗后的右肺濾紙吸干，-70℃保存，用于檢測(cè)肺組織TSLP mRNA表達(dá)水平。取100 μL肺組織勻漿，用Trizol試劑提取總RNA，氯仿和異丙醇抽提。紫外分光光度儀和瓊脂糖電泳鑒定RNA的濃度和純度，取10μL根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，-70℃凍存?zhèn)溆谩Ｈ? μL逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，并以βactin為內(nèi)對(duì)照。TSLP基因引物由Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min→95℃變性35 s→62℃退火45 s→70℃延伸45 s。共35個(gè)循環(huán)，最后70℃延伸10 min。具體序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度見表1。

表1 引物序列及擴(kuò)增長(zhǎng)度

PCR擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖電泳，溴化乙啶染色，通過(guò)凝膠電泳分析系統(tǒng)讀取目的基因灰度值，將目的基因灰度值與β-actin基因灰度值的比值作為目的基因mRNA的表達(dá)量，目的基因mRNA的表達(dá)量=目的基因灰度值/β-actin基因灰度值。

1.5.2 IL-4、IL-5和IL-13檢測(cè) ELISA法檢測(cè)，按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

各組 TSLP mRNA相對(duì)表達(dá)量及 IL-4、IL-5、IL-13水平比較見表2。與對(duì)照組比較，模型組的TSLP mRNA相對(duì)表達(dá)量及IL-4水平均顯著升高（P＜0.01）；模型組的IL-5、IL-13水平升高 （P＜0.05）。 和模型組比較，針挑組的IL-4水平顯著降低（P＜0.01）；針挑組的TSLP mRNA相對(duì)表達(dá)量、IL-5及IL-13水平均降低（P＜0.05）。

表2 各組TSLP mRNA相對(duì)表達(dá)量及IL-4、IL-5、IL-13 水平比較（pg/mL

表2 各組TSLP mRNA相對(duì)表達(dá)量及IL-4、IL-5、IL-13 水平比較（pg/mL

與對(duì)照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

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3 討 論

哮喘的呼吸道炎癥是以Th2細(xì)胞活化、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、氣道高反應(yīng)性（AHR）和血清IgE升高為特征的［3］，Th2細(xì)胞活化可釋放細(xì)胞因子 IL-4、IL-5、IL-13等，通過(guò)生物學(xué)效應(yīng)使小氣道發(fā)生炎癥、水腫、痙攣、黏液分泌增多、氣管纖維化，使小氣道狹窄和變形，氣體交換功能發(fā)生異常，表現(xiàn)為哮喘患者肺功能不同程度的障礙。

TSLP在不同的組織中著重表達(dá)于上皮細(xì)胞，在抗原呈體細(xì)胞觸發(fā)Th2在外周變態(tài)反應(yīng)性疾病中起著關(guān)鍵作用［4］，TSLP通過(guò)樹突狀細(xì)胞引起Th2優(yōu)勢(shì)分化，Th2細(xì)胞分化后釋放細(xì)胞因子IL-4、IL-5、IL-13引起肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及系列變態(tài)炎性反應(yīng)，使氣道發(fā)生病理改變導(dǎo)致哮喘發(fā)作。TSLP的表達(dá)可以調(diào)控Th2細(xì)胞分化進(jìn)而影響哮喘的發(fā)作，TSLP主要是通過(guò)上調(diào)Th2細(xì)胞的表達(dá)使得Th2與Th1的平衡機(jī)制向Th2方向傾斜而誘發(fā)哮喘等過(guò)敏性炎癥，同時(shí)可檢測(cè)出 IL-4、IL-5、IL-13 等細(xì)胞因子水平的升高［5］，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果和上述報(bào)道結(jié)果一致，但TSLP和IL-4、IL-5、IL-13水平是否存在正相關(guān)，需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)觀察。

針挑療法作為壯醫(yī)的特色治療技法，是在壯醫(yī)學(xué)理論指導(dǎo)下應(yīng)用的，壯醫(yī)專家黃漢儒認(rèn)為針挑療法的作用機(jī)理是挑刺可以激發(fā)人體正氣，將郁滯體內(nèi)的有形或無(wú)形之毒從體表針挑點(diǎn)刺點(diǎn)驅(qū)出，疏通 “龍路”、“火路”，使“水道”、“氣道”、“谷道”暢通，天地人三氣同步［6］；林辰教授認(rèn)為壯醫(yī)針刺療法在臨床應(yīng)用較廣，對(duì)哮喘、頭痛、失眠等一些慢性病、疑難癥有良好的療效［7］。本實(shí)驗(yàn)觀察到，和模型組比較，針挑組的IL-4水平顯著降低；針挑組的TSLP mRNA相對(duì)表達(dá)量、IL-5及IL-13水平均降低，說(shuō)明針挑療法可以降低TSLP mRNA表達(dá)、IL-4、IL-5、IL-13水平，推測(cè)這可能是其起效的機(jī)制之一。TSLP對(duì)Th2細(xì)胞優(yōu)勢(shì)分化及相關(guān)細(xì)胞因子的調(diào)控作用對(duì)于哮喘的治療具有指導(dǎo)意義，使靶向TSLP治療哮喘成為新思維。

［1］ Lees Y，Kim SJ，Kwon SS，et al.Distribution and cytokine production of CD4and CD8T-lymphocyte subsets in patients with acute asthma attacks［J］.Ann Allery Asthma Immuno，2001，86（6)：659-661.

［2］ Perrier C，Thierry AC，Mercenier A，et al.Allergen-specific antibody and cytokine responses，mast cell reactivity and intestinal permeability upon oral challenge of sensitized and tolerized mice［J］.Clin Exp Allergy，2010，40（1)：153-162.

［3］ Rautajoki KJ，Kylaniemi MK，Raghav SK，et al.An insight into molecular mechanisms of human T helper cell differentiation ［J］.Ann Med，2008，40（5)：322-335.

［4］ Zhou B，Comeau MR，De Smedt T，et al.Thymic stromal lymphopoietin as a key initiator of allergic airway inflammation in mice［J］.Nat Immunol，2005，6（10)： 1047-1053.

［5］ AL-Shami A，Spolski R，Kelly J，et al.A role for TSLP in the development of inflammation in an asthma medel［J］.J Exp Med，2005，202（6）：829-839.

［6］ 黃漢儒.壯醫(yī)理論體系概述［J］.中國(guó)中醫(yī)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)雜志，1996，2（6)：3-7.

［7］ 林辰，蔣桂江，陳攀，等.壯醫(yī)針刺研究的新進(jìn)展［J］.中國(guó)民族醫(yī)藥雜志，2011，17（5）：65-67.