電針對高血壓大鼠腦梗死頸髓Rho-A表達(dá)的影響*

譚 峰 陳 杰 梁艷桂 李雁萍 王學(xué)文 蒙 迪 程南方 徐麗紅

（廣州中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院佛山中醫(yī)院，廣東 佛山 528000）

電針是促進(jìn)急性腦梗死（ACI）神經(jīng)功能恢復(fù)的有效方法，但其機(jī)制尚未完全闡明。筆者在前期研究中發(fā)現(xiàn)電針對大鼠腦缺血區(qū)皮層損傷的保護(hù)作用，與其下調(diào)中樞神經(jīng)軸突再生抑制因子neurocan-mRNA和Nogo-A表達(dá)等機(jī)制密切相關(guān)［1-2］。本研究在前期基礎(chǔ)上，復(fù)制易卒中型腎血管性高血壓大鼠（RHRSP）一側(cè)大腦中動脈閉塞（MCAO）模型，觀察電針對腦缺血再灌注（I/R）第 1、7、14、28 日不同時間點(diǎn)腦梗死頸髓Rho-A表達(dá)的影響，探討電針對腦梗死遠(yuǎn)隔損害影響的可能機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 動物及分組 封閉群純種SPF級SD雄性大鼠480 只，體質(zhì)量（70±20）g，鼠齡 30 d 左右［合格證號：scxk（粵）2008-0020］，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心提供。統(tǒng)一用顆粒型普通大鼠飼料喂養(yǎng)，飲用涼開水，自由攝食條件下適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。行雙腎雙夾術(shù)復(fù)制RHRSP，采取尾動脈測壓術(shù)篩選造模成功大鼠370只，采用隨機(jī)數(shù)字表分為高血壓組60只、假手術(shù)組60只、擬造MCAO模型組250只，采用Longa的5分制法，在動物麻醉清醒后進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評分，分值在1~3分的大鼠納入，共有190只MCAO造模成功，從中隨機(jī)抽取10只大鼠行TTC染色確定梗死范圍，將剩余的180只MCAO大鼠隨機(jī)分為模型組60只、電針組60只、假電針組60只。

1.2 雙腎雙夾術(shù)復(fù)制RHRSP模型 體質(zhì)量70～90 g的雄性SD大鼠480只，按雙腎雙夾法復(fù)制成RHRSP模型［3-4］。使用SDP-1型大型大鼠血壓計進(jìn)行血壓監(jiān)測，術(shù)前測量1次作為基礎(chǔ)血壓，術(shù)后第1周、2周、4周、6周、8周、10周、12周各監(jiān)測血壓1次。測量前使用風(fēng)筒給大鼠尾巴預(yù)熱5 min，然后將大鼠歸于籠中，尾巴置入測壓橡膠圈，待大鼠安靜后測量清醒狀態(tài)下大鼠尾動脈的收縮壓，重復(fù)測量3次，取其平均值作為大鼠的血壓值。術(shù)后12周，將收縮壓高于180 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），且無自發(fā)卒中征象的大鼠行MCAO術(shù)。

1.3 MCAO術(shù)復(fù)制腦梗死模型 制作MCAO模型的RHRSP：（1）雙側(cè)腎動脈狹窄術(shù)后12周；（2）血壓≥180 mmHg；（3）未出現(xiàn)卒中的癥狀和體征。MCAO模型的復(fù)制：參照Zea Longa方法加以改進(jìn)［5-6］。神經(jīng)功能缺失體征評分參考Longa的5分制法在動物麻醉清醒后進(jìn)行評分。評分1~3分者納入研究。

1.4 分組與處理 （1）高血壓組：只復(fù)制 RHRSP模型，不予任何治療。（2）假手術(shù)組：RHRSP行頸部正中切口，僅作分離肌肉、筋膜與頸動脈處理。（3）腦梗死組：RHRSP基礎(chǔ)上的制作MCAO模型。（4）電針組：MCAO模型按文獻(xiàn)方法定位大鼠百會、大椎穴位。刺法：用30號1寸毫針，沿皮斜刺大椎、百會兩穴，進(jìn)針深度2～3 mm。針柄接至G68051 A型電針儀電極上，強(qiáng)度為3 V，頻率為3 Hz連續(xù)波，以肌肉輕微抽動、動物不掙扎嘶叫為度，時間持續(xù)15 min［7-8］。電針組于造模當(dāng)天動物清醒后開始治療，每日1次，共28 d。（5）假電針組：僅將針灸針貼于MCAO模型大鼠相應(yīng)穴位的皮膚上。

1.5 檢測指標(biāo)及方法 （1）大鼠神經(jīng)功能評分。①評分時間點(diǎn)：MCAO術(shù)后動物清醒時、MCAO術(shù)后第1、7、14、28日。②評分標(biāo)準(zhǔn)：參考Longa的5分制法進(jìn)行評分。（2）尼氏染色檢測神經(jīng)元數(shù)目。①脊髓組織取材。各組大鼠在MCAO術(shù)后第1、7、14和28日作神經(jīng)功能評分后，隨機(jī)抽取每個時間點(diǎn)大鼠6只，用10%水合氯醛腹腔注射深度麻醉后（0.4 mL/kg），快速開胸，經(jīng)左心室向主動脈插管，剪開右心耳，先快速灌注生理鹽水約200 mL，待右心房流出清亮液體后再換用10%福爾馬林灌注固定腦組織，約300 mL后斷頭取脊髓，將脊髓標(biāo)本置于10%福爾馬林中固定24 h，移入Leica自動脫水機(jī)脫水。取延髓錐體交叉上右側(cè)和左側(cè)脊髓組織，常規(guī)石蠟包埋，進(jìn)行冠狀連續(xù)切片，片厚4 μm，硅烷化防脫玻片撈片，60℃烤片30 min，4℃保存?zhèn)溆谩＂谀崾先旧?。選取每只大鼠的石蠟切片，每隔10片取1片，尼氏染色檢測大鼠神經(jīng)元數(shù)目，用BX51系統(tǒng)生物顯微鏡和AZ100型體視光學(xué)顯微鏡下觀察、計數(shù)與拍照。

1.6 Western blot檢測Rho-A表達(dá) 各組大鼠在MCAO術(shù)后第1、7、14和28日，隨機(jī)抽取每個時間點(diǎn)大鼠6只，用10%水合氯醛腹腔注射深度麻醉后（0.4 mL/kg），快速斷頭開顱取脊髓，然后迅速分離出右側(cè)延髓和左側(cè)脊髓，用生理鹽水洗滌后立即放入1.5 mL離心管中，-80℃保存。以β-Actin（43kD）蛋白條帶為參照，分別分析各組大鼠各蛋白分子量相對于β-Actin各蛋白條帶的相對密度。全部圖像采用計算機(jī)輔助軟件分析系統(tǒng)（ImageJ）專業(yè)圖像處理軟件進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組頸髓神經(jīng)元數(shù)目比較 見表1。MCAO術(shù)后第 1、7、14 日，各組間頸髓神經(jīng)元數(shù)目相近（P>0.05）。第28日，與高血壓組比較，假手術(shù)組脊髓神經(jīng)元數(shù)目相近（P＞0.05）；與腦梗死組比較，電針組脊髓神經(jīng)元數(shù)目減少明顯（P＜0.05），假針刺組脊髓神經(jīng)元數(shù)目減少不明顯（P＞0.05）。

表1 各組大鼠不同時間點(diǎn)頸髓神經(jīng)元數(shù)目（個

表1 各組大鼠不同時間點(diǎn)頸髓神經(jīng)元數(shù)目（個

與高血壓組同時間比較，△P＜0.05；與腦梗死組同時間比較，*P＜0.05。下同。

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2.2 各組頸髓Rho-A表達(dá)比較 見表2，圖1。與高血壓組比較，MCAO術(shù)后第1、7、14日，假手術(shù)組、腦梗死組、電針組、假電針組Rho-A的表達(dá)與其相當(dāng)（P＞0.05）；第28日，腦梗死組、電針組、假電針組Rho-A的表達(dá)升高 （P＜0.05）。 與腦梗死組比較， 第1、7、14日，電針組和假電針組Rho-A的表達(dá)與其相當(dāng) （P＞0.05）；第 28 日，電針組 Rho-A 的表達(dá)降低（P＜0.05），假電針組Rho-A的表達(dá)與其相當(dāng)（P＞0.05）。

表2 各組大鼠不同時間點(diǎn)脊髓Rho-A的表達(dá)

表2 各組大鼠不同時間點(diǎn)脊髓Rho-A的表達(dá)

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圖1 大鼠不同時間點(diǎn)頸髓Rho-A含量

3 討 論

越來越多的證據(jù)表明，局灶性腦梗死可導(dǎo)致遠(yuǎn)隔部位CNS神經(jīng)組織繼發(fā)性損害，并阻礙神經(jīng)功能的恢復(fù)。ACI遠(yuǎn)隔部位中樞神經(jīng)軸突丟失、變性、回縮、塌陷等都不同程度地與CNS神經(jīng)生長抑制因子密切相關(guān)。Rho-A是CNS軸突抑制重要的信號傳導(dǎo)物質(zhì)，在抑制成熟CNS神經(jīng)元軸突再生中發(fā)揮重要作用。CNS軸突再生抑制因子NogoA等通過與其受體NgR等結(jié)合，經(jīng)Rho-A介導(dǎo)將抑制信號從胞外跨膜傳遞至胞內(nèi)，啟動胞內(nèi)Rho/ROCK信號通路，激活下游的Rho激酶，直接引起肌球蛋白輕鏈（MLC）磷酸化，形成MLCP（myosinlig ht chain phosphatase），使肌球蛋白整體磷酸化下降，導(dǎo)致神經(jīng)生長錐胞體回縮，最終崩潰，從而使軸突再生、細(xì)胞擴(kuò)增受到抑制，阻礙神經(jīng)修復(fù)。在RhoA V14-轉(zhuǎn)染的神經(jīng)元細(xì)胞中，多數(shù)細(xì)胞只有光禿禿的樹突主干，樹突棘的密度明顯降低甚至是缺如，樹突棘的長度明顯縮短。而在使用Rho蛋白激酶的特異性抑制劑Y-27632后，神經(jīng)元異常的形態(tài)學(xué)變化有所逆轉(zhuǎn)，表明Rho-A信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在神經(jīng)元樹突分支方面發(fā)揮重要作用［9］。體內(nèi)外研究證實，Y-27632等RoCK的抑制因子，可以使Rho-A激酶特異性失活，從而促進(jìn)神經(jīng)軸突再生；大鼠脊髓損傷后鞘內(nèi)注射Y-27632，可以觀察到背側(cè)脊髓軸突生長，且大鼠后肢功能可以得到明顯改善［10-11］。體外研究證實阻斷Rho-A/ROCK的活性能夠抑制Nogo-A對軸突生長的抑制作用，促進(jìn)軸突再生［12］。Rho-A/ROCK通路抑制劑還能夠減少神經(jīng)元丟失，減輕神經(jīng)組織損傷程度，促進(jìn)軸突再生和功能恢復(fù)［13］。本實驗提示局灶性腦梗死后，遠(yuǎn)離梗死灶的頸髓發(fā)生了繼發(fā)損害，Rho-A抑制因子表達(dá)的增高是ACI遠(yuǎn)隔損害的一個重要原因，且漸進(jìn)性繼發(fā)遠(yuǎn)隔損害的持續(xù)時間較長。此為腦梗死遠(yuǎn)隔損害發(fā)生的時間窗研究提供了一定的參考資料。

電針是促進(jìn)ACI神經(jīng)功能恢復(fù)的有效方法。針刺百會穴可顯著提高腦中風(fēng)患者ADL量表評分，增強(qiáng)腦缺血大鼠 NGF 表達(dá)，阻止 Ca2+超載［14］，電針大椎、百會穴能顯著促進(jìn)大鼠腦梗死肢體神經(jīng)功能恢復(fù)，減少缺血缺氧新生大鼠病灶側(cè)海馬神經(jīng)元內(nèi)尼氏體脫失現(xiàn)象，減輕SD大鼠局灶性腦缺血再灌注大腦皮層超微結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)損傷［15］。盡管電針治療ACI的研究已取得長足進(jìn)展，但在CNS抑制信號傳導(dǎo)通路領(lǐng)域的報道甚少。前期實驗表明，電針對大鼠腦缺血區(qū)皮層損傷的保護(hù)作用，與其下調(diào)中樞神經(jīng)軸突再生抑制因子neurocanmRNA 與 Nogo-A 表達(dá)等機(jī)制密切相關(guān)［3-4，16］。 但電針對Rho-A有何作用尚不清楚，電針對梗死灶遠(yuǎn)隔損害部位Rho-A的影響如何，目前國內(nèi)外尚未見翔實的報道。本研究中，筆者選取與腦皮層有密切纖維聯(lián)系的遠(yuǎn)隔損害部位頸髓，通過觀察電針對Rho-A抑制信號表達(dá)的影響，探討腦梗死遠(yuǎn)隔損害的發(fā)生機(jī)理以及電針的干預(yù)作用。結(jié)果顯示，電針組頸髓神經(jīng)元數(shù)目明顯高于腦較梗死組，MCAO術(shù)后第28日，電針組頸髓Rho-A表達(dá)較腦梗死組明顯降低，提示電針對高血壓大鼠腦缺血損傷的保護(hù)作用還與減輕ACI遠(yuǎn)隔部位繼發(fā)性損害有關(guān)，電針促進(jìn)神經(jīng)功能修復(fù)的作用可能與阻遏中樞神經(jīng)抑制信號Rho-A蛋白表達(dá)等機(jī)制密切相關(guān)。此為電針減輕ACI遠(yuǎn)隔損害的機(jī)理研究和臨床應(yīng)用賦予了新內(nèi)涵。

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