電針對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病大鼠坐骨神經(jīng)Nrg1和ErbB2表達(dá)的影響*

王曉莉，覃建陽(yáng)，尹昌浩，張忠敏△

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院，黑龍江牡丹江157011;2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，黑龍江牡丹江157000)

實(shí)驗(yàn)研究

電針對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病大鼠坐骨神經(jīng)Nrg1和ErbB2表達(dá)的影響*

王曉莉1，覃建陽(yáng)2，尹昌浩1，張忠敏1△

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院，黑龍江牡丹江157011;2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬第二醫(yī)院，黑龍江牡丹江157000)

目的:探討電針對(duì)鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的大鼠糖尿病周圍神經(jīng)病(DPN)模型坐骨神經(jīng)中神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(Nrg1)和表皮生長(zhǎng)因子受體2(ErbB2)表達(dá)的影響。方法:大鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、普通針刺組、電針組。鏈脲佐菌素腹腔注射制備實(shí)驗(yàn)DPN大鼠模型，造模后14天檢測(cè)各組血糖及坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度，實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)坐骨神經(jīng)Nrg1和ErbB2 mRNA表達(dá)。結(jié)果:與正常組比較，模型組、電針組和普通針刺組血糖顯著增高(P＜0.01)。與模型組比較，電針組和普通針刺組神經(jīng)傳導(dǎo)速度顯著增高(P＜0.01)，坐骨神經(jīng)Nrg1和ErbB2 mRNA表達(dá)顯著上調(diào)(P＜0.01)，其中電針組治療效果優(yōu)于普通針刺組(P＜0.05)。結(jié)論:電針可通過(guò)上調(diào)糖尿病周圍神經(jīng)病坐骨神經(jīng)Nrg1和ErbB2 mRNA表達(dá)，促進(jìn)施萬(wàn)細(xì)胞生存，改善糖尿病周圍神經(jīng)病坐骨神經(jīng)功能。

電針;糖尿病周圍神經(jīng)病;神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1;表皮生長(zhǎng)因子受體2

神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白1(Neuregulin 1，Nrg1)是施萬(wàn)細(xì)胞(Schwann cells，SCs)在神經(jīng)再生及髓鞘形成過(guò)程中的重要調(diào)節(jié)因子［1－2］，能夠結(jié)合表皮生長(zhǎng)因子受體2 (Epidermal growth factor receptor 2，ErbB2)，激活下游信號(hào)系統(tǒng)促進(jìn)SCs分化、增殖和遷移，是目前周圍神經(jīng)疾病基因治療中的研究熱點(diǎn)。電針療法［3－5］是針刺與電刺激相結(jié)合的一種治療方法，以往研究發(fā)現(xiàn)［6］電針可以有效改善鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病周圍神經(jīng)病(Diabetic peripheral neuropathy，DPN)的神經(jīng)功能，但具體作用機(jī)制還不清楚。本實(shí)驗(yàn)將通過(guò)觀察電針對(duì)DPN坐骨神經(jīng)Nrg1和ErbB2基因表達(dá)的作用，探討電針對(duì)DPN的治療機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物和藥品

SD雄性大鼠36只，清潔級(jí)，體重300～340 g，中國(guó)醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供［SYXK(遼) 20080005］;鏈脲佐菌素、RT－PCR試劑盒購(gòu)于美國(guó)Sigma公司;Nrg1、ErbB2和GAPDH引物由寶生物工程(大連)有限公司合成;BL－420F神經(jīng)電生理檢測(cè)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司);電針綜合治療儀HT－2型(常州經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)華音電子有限公司)。

1.2 動(dòng)物分組與模型制備

32只大鼠采用配對(duì)比較法隨機(jī)分為4組:正常組(n=8)、模型組(n=8)、普通針刺組(n=8)、電針組(n=8)，參照Z(yǔ)ou等［6］的方法大鼠左下腹注射STZ(60 mg/kg/d，5天)誘導(dǎo)DPN，以空腹血糖≥15 mmol/L、坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯降低作為DPN模型標(biāo)準(zhǔn)，正常組注射等劑量檸檬酸－檸檬酸鈉緩沖液對(duì)照。治療組針刺雙側(cè)足三里、腎俞、肝俞穴位，每日1次，共14次。普通針刺組［7］進(jìn)針后行平補(bǔ)平瀉手法，每5 min行針1次，留針30 min。電針組采用疏密波，頻率120次/ min，強(qiáng)度1 mA，持續(xù)30 min。正常組和模型組不做任何治療。

1.3 血糖

造模［6］14天后各組大鼠尾靜脈取血，血糖用美國(guó)諾和靈公司血糖儀測(cè)定。

1.4 神經(jīng)傳導(dǎo)速度測(cè)定

采用Kosacka等［8］報(bào)道的分離大鼠坐骨神經(jīng)，將引導(dǎo)和刺激電極放在坐骨神經(jīng)遠(yuǎn)、近端。應(yīng)用BL－420F神經(jīng)電生理檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定神經(jīng)傳導(dǎo)速度。

1.5 Nrg1和ErbB2基因檢測(cè)

神經(jīng)組織RNA提取，采用Takata［9］方法進(jìn)行Nrg1和ErbB2基因檢測(cè)。各引物的序列為:Nrg1，上游5'－TGGCACATCCATCCAAATAC－3'，下游5'－GTAGCATGCTGCTGGGTCTA－3';ErbB2，上游5'－AAGCTTCTCCTCGCCCTCTTGC－3'，下游5'－CTCGAGGCGGACTTCTGG－3';GAPDH，上游5'－CAACTCCCTCAAGATTGTCAGCAA－3'，下游5'－GGCATGGACTGTGGTCATGA－3'。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線將各樣品測(cè)得的Ct值換算成拷貝數(shù)，分析各檢測(cè)樣本中目的基因拷貝數(shù)相對(duì)于陽(yáng)性定量參考樣品的基因拷貝數(shù)，分析方法采用2－△△CT方法進(jìn)行分析。

通過(guò)相關(guān)基因表達(dá)定量的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和樣本列表。通過(guò)β－actin均一化處理，對(duì)目標(biāo)基因的表達(dá)變化進(jìn)行了監(jiān)測(cè)。在8 h的時(shí)間范圍內(nèi)，在每一時(shí)間點(diǎn)都取3個(gè)重復(fù)樣本，每一樣本在cDNA合成之后都做定量PCR，數(shù)據(jù)分析用到了:amount of target=2－△△CT。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 電針對(duì)血糖的影響

正常組大鼠血糖值維持在正常水平，模型組、普通針刺組、電針組血糖值較正常組顯著增高(P＜0.01)，其中普通針刺組、電針組血糖值低于模型組(P＜0.01)，兩治療組間無(wú)顯著差異(P＞0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 電針對(duì)神經(jīng)傳導(dǎo)速度的影響

模型組、普通針刺組和電針組神經(jīng)傳導(dǎo)速度低于正常組(P＜0.01)。與模型組比較，普通針刺組和電針組神經(jīng)傳導(dǎo)速度顯著增高(P＜0.01)，其中電針組優(yōu)于普通針刺組(P＜0.01)。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠空腹血糖(mmol/L)及神經(jīng)傳導(dǎo)速度測(cè)定

2.3 電針對(duì)坐骨神經(jīng)Nrg1和ErbB2的影響

與正常組比較，模型組、普通針刺組和電針組Nrg1和ErbB2 mRNA相對(duì)表達(dá)顯著增加(P＜0.01)，其中普通針刺組和電針組增加更為顯著(P＜0.01)，而電針組顯著高于普通針刺組(P＜0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組坐骨神經(jīng)中Nrg1和ErbB2 mRNA相對(duì)表達(dá)量

3 討論

DPN是糖尿病的最常見(jiàn)并發(fā)癥，有超過(guò)50%的糖尿病患者發(fā)展成為DPN［6－7］。DPN的疾病特點(diǎn)是漸進(jìn)性疼痛和感覺(jué)異常，甚至可以發(fā)展成為糖尿病足或壞疽，目前其治療結(jié)果并不理想。最近研究表明DPN的發(fā)生發(fā)展具有復(fù)雜的機(jī)制，主要包括［9］:①高血糖及代謝紊亂;②絲裂素活化蛋白激酶通路激活;③氧化應(yīng)激;④神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)障礙和血管病理性改變;⑤SCs凋亡。其中SCs在DPN神經(jīng)再生過(guò)程中的髓鞘形成、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)支持、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)、神經(jīng)損傷修復(fù)等方面發(fā)揮關(guān)鍵作用。

有研究者發(fā)現(xiàn)［1］ErbB2信號(hào)通路與施萬(wàn)細(xì)胞的生存密切相關(guān)，其中配體Nrg1作為膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)因子，主要由施萬(wàn)細(xì)胞產(chǎn)生，通過(guò)軸突運(yùn)輸，在施萬(wàn)細(xì)胞存活中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。Nrg1屬于調(diào)節(jié)蛋白基因家族，家族包含稱為 Nrg1、Nrg2、Nrg3、Nrg4的四個(gè)成員，而Nrg1是最有特征的基因，能夠顯著抑制施萬(wàn)細(xì)胞凋亡，被認(rèn)為是施萬(wàn)細(xì)胞發(fā)育過(guò)程中一個(gè)最重要的存活因子。Nrg1和ErbB2受體結(jié)合并激活下游信號(hào)通路，其對(duì)SCs生存信號(hào)傳導(dǎo)非常重要，促進(jìn)SCs分化、增殖和遷移。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)模型組Nrg1和ErbB2表達(dá)較正常組顯著增高，提示Nrg1和ErbB2在DPN神經(jīng)再生早期發(fā)揮重要作用。

電針是針刺與電刺激結(jié)合的針刺方法，作為臨床治療神經(jīng)再生的常用針刺方法，具有成本低、操作方便、低風(fēng)險(xiǎn)等優(yōu)點(diǎn)。有研究［6－7］證實(shí)電針能促進(jìn)DPN電生理傳導(dǎo)速度，但其具體機(jī)制還不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)電針能夠顯著促進(jìn)DPN大鼠模型坐骨神經(jīng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度，上調(diào)坐骨神經(jīng)中Nrg1和ErbB2的基因表達(dá)，其作用優(yōu)于普通針刺組，提示電針能夠通過(guò)上調(diào)坐骨神經(jīng)Nrg1和ErbB2的表達(dá)水平，激活Nrg1/ErbB2信號(hào)通路，增強(qiáng)SCs生存，促進(jìn)DPN神經(jīng)功能恢復(fù)。

綜上所述，本研究證實(shí)電針能夠促進(jìn)DPN神經(jīng)功能恢復(fù)，其機(jī)制與電針通過(guò)上調(diào)Nrg1和ErbB2的表達(dá)，促進(jìn)施萬(wàn)細(xì)胞存活有關(guān)。

［1］Sparrow N，Manetti ME，Bott M，et al.The actin－severing protein cofilin is downstream of neuregulin signaling and is essential for Schwann cell myelination［J］.J Neurosci，2012，32(15):5284－5297

［2］Zhao WJ.Expression and Localization of Neuregulin－1(Nrg1)and ErbB2/ErbB4 Receptors in Main Endocrine Organs of the Rhesus Monkey［J］.Int J Endocrinol Metab，2013，11(3):162－166

［3］Nori SL，Rocco ML，F(xiàn)lorenzano F，et al.Increased nerve growth factor signaling in sensory neurons of early diabetic rats is corrected by electroacupuncture［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2013，12(26):652735

［4］曲怡，張立德，才麗平，等.針刺對(duì)缺血/再灌注腦組織基因表達(dá)影響的研究進(jìn)展［J］.醫(yī)學(xué)綜述，2008，14(14):2159－2161

［5］王瑩，李文媛，李智剛，等.電針聯(lián)合脂肪源性干細(xì)胞對(duì)腦缺血再灌注大鼠BDNF及其受體trkB表達(dá)的影響［J］.中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2012，30(10):2273－2276

［6］Zou DW，Gao YB，Zhu ZY，et al.Traditional chinese medicine tang－luo－ning ameliorates sciatic nerve injuries in streptozotocininduced diabetic rats［J］.Evid Based Complement Alternat Med，2013，10(2):989670

［7］孫遠(yuǎn)征，吳迪，徐鶯鶯，等.電針對(duì)糖尿病周圍神經(jīng)病模型大鼠血清和坐骨神經(jīng)SOD、MDA影響的研究［J］.針灸臨床雜志，2009，25(7):52－54

［8］Kosacka J，Nowicki M，Blüher M，et al.Increased autophagy in peripheral nerves may protect Wistar Ottawa Karlsburg W rats against neuropathy［J］.Exp Neurol，2013，250(22):125－135

［9］Takata H，Takeda Y，Zhu A，et al.Protective effects of mineralocorticoid receptor blockade against neuropathy in experimental diabetic rats［J］.Diabetes Obes Metab，2012，14(2):155－162

Effects of Electroacupuncture on the Expression of Nrg1 and ErbB2 in the Sciatic Nerve in Rats with Diabetic Peripheral Neuropathy

WANG Xiao－li1，TAN Jian－yang2，YIN Chang－h(huán)ao1，ZHANG Zhong－min1△
(1.Hongqi Hospital of Mudanjiang Medical College，Mudanjiang157011，China; 2.The Second Affiliated Hospital of Mudanjiang Medical University，Mudanjiang157000，China)

Objective:To investigate the effects of electroacupuncture on the expression of Nrg1 and ErbB2 in the sciatic nerve of rats with diabetic peripheral neuropathy(DPN).Methods:The rats were randomly divided into a normal group，a model group，a common acupuncture group and an electroacupuncture group.The rat models with diabetic peripheral neuropathy were established by streptozotocin peritoneal injection method.14 days after modeling，the blood sugar and conduction velocity of sciatic nerve were measured，and the mRNA expres-sions of Nrg1 and ErbB2 in the sciatic nerve were detected by RT－PCR.Results:14 days after modeling，compared with the normal group，the blood sugar of model group，acupuncture group and electroacupuncture group was increased(P＜0.01).Compared with the model group，the conduction velocity of sciatic nerve was increased in common acupuncture group and electroacupuncture group(P＜0.01)，and mRNA expressions of Nrg1 and ErbB2 in sciatic nerve were increased(P＜0.01).While it was improved more obviously in the electroacupuncture group than that in the common acupuncture group(P＜0.05).Conclusion:Electroacupuncture could promote the nerve functional recovery of diabetic peripheral neuropathy by elevating Nrg1 and ErbB2 in sciatic nerve，and promote Schwann cells survival.

Electroacupuncture;Diabetic peripheral neuropathy;Nrg1;ErbB2

R245.97

A

1005－0779(2014)009－0052－03

黑龍江省衛(wèi)生廳科研課題，編號(hào):2011－304。

王曉莉(1982－)，女，主治醫(yī)師，從事糖尿病方向研究。

△通訊作者:張忠敏(1983－)，男，主治醫(yī)師，從事腦血管病、周圍神經(jīng)病研究。

2014－04－25