大花羅布麻不同部位酚類物質(zhì)含量及其抗氧化活性比較研究

韓愛芝，黃軍海，孟慶艷，劉 文，白紅進(jìn),*

（1.新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木盆地生物資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300；2.上海醫(yī)藥工業(yè)研究院張江研發(fā)中心，上海 200040）

大花白麻為夾竹桃科（Apocynaceae）白麻屬大花羅布麻（Poacynum hendersonii（Hook.F.）Woodson），新疆維吾爾族稱其為“野務(wù)其干”“陶格其干”等[1]。它在我國北方部分省區(qū)都有分布，如新疆、青海和甘肅等，新疆有豐富的野生羅布麻資源，主要分布在羅布泊、塔里木河、孔雀河畔及阿克蘇地區(qū)。羅布麻為多年生宿根草本植物，是荒漠綠化與防風(fēng)沙的優(yōu)良種植物[2]。《本草綱目》中記載，羅布麻的藥用價(jià)值極高，其根、莖、葉、花、全草入藥，能平肝安神、清熱利水，用于治療肝陽眩暈、心悸失眠、浮腫尿少、高血壓、神經(jīng)衰弱、腎炎浮腫，1977年羅布麻被正式錄入《中華人民共和國藥典》[3-4]?，F(xiàn)代文獻(xiàn)研究證明，羅布麻含有多糖、酚類與鞣質(zhì)、黃酮、有機(jī)酸、生物堿、蒽醌、氨基酸和人體所需的微量元素等多種藥物成分，進(jìn)一步研究黃酮類物質(zhì)的化學(xué)結(jié)構(gòu)，為槲皮素和異槲皮素苷、蘆丁、山萘酚等，對(duì)頭暈癥狀、改善睡眠質(zhì)量有明顯效果，尤其對(duì)高血壓、高血脂、有較好的療效，同時(shí)具有增強(qiáng)免疫、預(yù)防感冒、平喘止咳、消除抑郁、活血養(yǎng)顏、解酒護(hù)肝、降解煙毒、軟化血管、通便利尿等生理保健功效[5-7]。

多酚在植物體中的存在形式有3種：游離態(tài)、酯化態(tài)和結(jié)合態(tài)，有的文獻(xiàn)也將游離態(tài)和可溶性的酯化態(tài)合稱為游離態(tài)[8]。據(jù)Bonolim[9]、Holtekjolen[10]等報(bào)道，植物中游離酚多以原花青素、類黃酮類為主，酯化酚、結(jié)合酚多為酚酸類為主，結(jié)合酚與葡萄糖、纖維素、木質(zhì)素、類黃酮、蛋白質(zhì)、酒石酸等結(jié)合的形式存在于植物組織的初生壁和次生壁中。各植物組織中，酚的存在形式和含量都不盡相同，而且在不同的發(fā)育階段，各植物組織中酚的存在形式和含量也會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。

目前人們對(duì)羅布麻的有效成分及生理功能研究較多[11-12]，但對(duì)其各部位中的多酚存在形式、組分含量及抗氧化活性的研究較少。本實(shí)驗(yàn)以塔里木盆地大花白麻全株為試材，分別對(duì)其根、莖、葉、花中多酚存在形式及其抗氧化活性進(jìn)行對(duì)比研究，揭示不同部位大花白麻多酚物質(zhì)的分布、存在特點(diǎn)，以期為該植物的品種選育、人工栽培與產(chǎn)品加工質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆羅布麻全株，于2012年7月上旬采自新疆阿拉爾，由塔里木大學(xué)植物科學(xué)學(xué)院邱愛軍副教授鑒定為白麻屬大花羅布麻（Poacynum hendersonii（Hook.F.）Woodson），按照根、莖、葉、花分開后陰干，粉碎置于4℃貯藏備用。

蘆丁對(duì)照品（批號(hào)：60922） 德國Dr.Ehrdnstorfer公司；Trolox 美國Sigma公司；福林酚 北京九州天瑞科技有限公司；沒食子酸 上海山浦化工有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-50B旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海申生科技有限公司；LXT-ⅡB大容量離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠；KQ-400KDE臺(tái)式通用超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司； BS124S電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；水浴鍋 上海申生科技有限公司；CARY-100紫外-可見分光光度計(jì) 澳大利亞Varian公司；FW-100高速萬能粉碎機(jī) 北京市永光明醫(yī)療儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 游離態(tài)酚類物質(zhì)提取

參照徐元元等[13]的方法提取游離態(tài)酚類物質(zhì)，得游離態(tài)酚類提取液（簡稱游離酚），于－18℃保存?zhèn)溆?，每個(gè)樣品平行提取3次。

1.3.2 結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)提取

參照徐元元等[13]的方法提取結(jié)合態(tài)酚類物質(zhì)，得結(jié)合態(tài)酚類提取液（簡稱結(jié)合酚），在－18℃保存?zhèn)溆茫總€(gè)樣品平行提取3次。

1.3.3 多酚的定性實(shí)驗(yàn)

三氯化鐵-鐵氰化鉀反應(yīng)、三氯化鐵反應(yīng)、香草醛-鹽酸反應(yīng)。

1.3.4 黃酮的定性實(shí)驗(yàn)

鹽酸-鎂粉反應(yīng)、三氯化鋁反應(yīng)、氨熏實(shí)驗(yàn)。

1.3.5 總酚含量的測定

1.3.5.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

參照Chiremba等[14]的方法，采用Folin-Ciocalteu比色法測定吸光度。擬合的回歸方程為：y=0.011 5x－0.005 6（R2=0.999 1），式中：y為吸光度，x為沒食子酸質(zhì)量濃度/（μg/mL），樣品檢測質(zhì)量濃度在10～100 μg/mL范圍內(nèi)與吸光度線性關(guān)系良好。

1.3.5.2 樣品總多酚含量測定

各取大花羅布麻根、莖、葉與花的提取液1 mL，按照1.3.5.1節(jié)的方法測其相應(yīng)吸光度，計(jì)算總多酚含量，結(jié)果以100 g干樣品中所含沒食子酸當(dāng)量（gallic acid equivalent，GAE）表示，簡寫為mg GAE/100 g干質(zhì)量。重復(fù)3次測定。

1.3.6 總黃酮含量的測定

1.3.6.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

1.3.6.2 樣品總黃酮含量測定

各取大花羅布麻根、莖、葉與花的提取液1 mL，按照1.3.6.1節(jié)的方法測其吸光度，計(jì)算總黃酮含量，結(jié)果以100 g干樣品中所含蘆丁當(dāng)量（rutin equivalent，RE）表示，簡寫為mg RE/100 g。重復(fù)3次測定。

1.3.7 DPPH自由基清除能力

各樣品對(duì)DPPH自由基清除能力參照Li Wu等[15]的方法，略有改動(dòng)。將1 mL 提取液與3 mL 0.052 mg/mL DPPH自由基的甲醇溶液反應(yīng)，用力振搖混勻后置暗室中靜置30 min，測定反應(yīng)液在517 nm波長處的吸光度。以甲醇代替樣品作為空白對(duì)照，實(shí)驗(yàn)以Trolox作為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=－0.001 7x+0.856 5（R2=0.999 7），式中：y為吸光度，x為Trolox質(zhì)量濃度/（μg/mL）。樣品清除DPPH自由基能力以100 g干樣中所含Trolox的當(dāng)量微摩爾數(shù)表示（μmol Trolox/100 g）。重復(fù)3次測定。

1.3.8 ABTS+?清除能力

參照Shahwar等[16]方法，制備ABTS+?儲(chǔ)備液，測定樣品對(duì)ABTS+?清除能力。于734 nm波長處測其吸光度，以甲醇作為空白。實(shí)驗(yàn)以Trolox作為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y=－0.002 5x+0.683 4 （R2=0.999 6），式中：y為吸光度，x為Trolox質(zhì)量濃度/（μg/mL）。樣品清除ABTS+?的能力結(jié)果以100 g干樣中所含Trolox的當(dāng)量微摩爾數(shù)表示（μmol Trolox/100 g）。重復(fù)3次測定。

1.3.9 總還原力測定

本研究涉及體院排球隊(duì)5名最高水平男運(yùn)動(dòng)員(接應(yīng)、副攻、2名主攻、二傳)，運(yùn)動(dòng)員在比賽中的場上位置及需要采集分析的相關(guān)參數(shù)見表1。自由人不在其中，因?yàn)槠湓诒荣愔胁粎⑴c發(fā)球、進(jìn)攻與攔網(wǎng)。

參照Kumarl等[17]的方法，略有改動(dòng)。取樣品稀釋液1 mL與pH 6.6、0.2 mol/L的磷酸緩沖溶液2.5 mL和1 g/100 mL鐵氰化鉀溶液2.5 mL混勻，50℃水浴保溫20 min，加入10 g/100 mL的三氯乙酸2 mL終止反應(yīng)。搖勻，5 000 r/min離心5 min。吸取上清液2.5 mL，加入2.5 mL蒸餾水和0.1 g/100 mL三氯化鐵溶液0.5 mL避光反應(yīng)30 min后在700 nm波長處測定吸光度，以蒸餾水代替樣品作為空白。實(shí)驗(yàn)以L-抗壞血酸作為標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程：y= 0.004 7x+0.177 5（R2=0.999 5），式中：y為吸光度，x為VC質(zhì)量濃度/（μg/mL）。樣品結(jié)果以100 g干物質(zhì)中所含VC的當(dāng)量微摩爾數(shù)表示（μmol VC/100 g）。重復(fù)3次測定。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 大花羅布麻不同部位總多酚與總黃酮的定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 總多酚定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)植物化學(xué)成分系統(tǒng)預(yù)試，由表1可知，大花羅布麻葉、根、花、莖含有多酚類化合物。

表1 總多酚類定性實(shí)驗(yàn)Table1 Qualitative tests of phenolics

2.1.2 總黃酮定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果根據(jù)植物化學(xué)成分系統(tǒng)預(yù)試，由表2可知，大花羅布麻葉、根、花、莖含有黃酮類化合物。

表2 總黃酮類定性實(shí)驗(yàn)Table2 Qualitative tests of flavonoids

2.2 大花羅布麻不同部位總多酚含量的測定結(jié)果

表3 不同部位游離態(tài)多酚、結(jié)合態(tài)多酚和總酚的含量（±s，n==33）Table3 Cntennts of free, bound and total phenolics in different parts(±s,, n == 33))

表3 不同部位游離態(tài)多酚、結(jié)合態(tài)多酚和總酚的含量（±s，n==33）Table3 Cntennts of free, bound and total phenolics in different parts(±s,, n == 33))

注：以干質(zhì)量計(jì)；同列字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。下同。

含量/（mg GAE/100 g） 游離態(tài)多酚占總多酚比例/%游離態(tài)多酚 結(jié)合態(tài)多酚 總多酚葉 6 273.23±123.02a 13.45±6.14b 6 286.68±129.16a 99.79根 5 028.79±47.21b 19.56±0.17ab 5 048.35±47.38b 99.61花 4 279.03±60.34c 16.14±1.54ab 4 295.17±61.88c 99.62莖 3 560.19±109.58d 22.01±2.99a 3 582.2±112.57d 99.39不同部位

由表3可知，羅布麻不同部位的游離態(tài)多酚和總酚含量有顯著差異。樣品中游離態(tài)多酚含量遠(yuǎn)大于結(jié)合態(tài)多酚含量，且游離態(tài)多酚含量介于（3 560.19±109.58）～（6 273.23±123.02）mg GAE/100 g之間。游離態(tài)多酚占總酚比例為99.39%～99.79%。其中游離態(tài)多酚含量最高的是羅布麻葉，高達(dá)（6 273.23±123.02）mg GAE/100 g，結(jié)合態(tài)多酚含量最高的是羅布麻莖，達(dá)（22.01±2.99）mg GAE/100 g?？偡雍繌拇蟮叫〉捻樞蛞来螢椋喝~＞根＞花＞莖，可見葉中總酚含量顯著高于其他部位?？偡雍康慕档挖厔菖c游離態(tài)多酚的一致，這是由于游離態(tài)多酚占總酚含量的99%以上，即羅布麻不同部位多酚主要以游離態(tài)多酚為主。

2.3 大花羅布麻不同部位總黃酮含量的測定結(jié)果

由表4可知，羅布麻不同部位的游離態(tài)黃酮、結(jié)合態(tài)黃酮和總黃酮含量有顯著差異，提取的酚類化合物中總黃酮含量在（1 106.81±5.54）～（2 516.80±296.02）mg RE/100 g，不同部位的游離態(tài)黃酮、結(jié)合態(tài)黃酮和總黃酮含量有顯著差異。樣品中游離態(tài)黃酮含量遠(yuǎn)大于結(jié)合態(tài)黃酮含量，并且游離態(tài)黃酮含量介于（1 080.30±4.94）～（2 488.21±295.56）mg RE/100 g之間。游離態(tài)黃酮占總黃酮比例為97.61%～99.52%。其中游離態(tài)黃酮含量最高的是羅布麻根，高達(dá)（2 488.21±295.56）mg RE/100 g，結(jié)合態(tài)黃酮含量最高的是根，達(dá)（28.59±0.46）mg RE/100 g?？傸S酮含量從大到小的順序依次為：根＞葉＞花＞莖，且提取物中的黃酮類物質(zhì)以游離態(tài)為主要存在形式。

表4 不同部位的游離態(tài)黃酮、結(jié)合態(tài)黃酮和總黃酮的含量（±s，n==33）Table4 Contents of free, bound and total flavonoids in different parts(±s,, n == 33))

表4 不同部位的游離態(tài)黃酮、結(jié)合態(tài)黃酮和總黃酮的含量（±s，n==33）Table4 Contents of free, bound and total flavonoids in different parts(±s,, n == 33))

不同部位含量/（mg RE/100 g） 游離態(tài)黃酮占總黃酮比例/%游離態(tài)黃酮 結(jié)合態(tài)黃酮 總黃酮葉 1 995.47±217.73b 9.69±0.47d 2 005.16±218.20b 99.52根 2 488.21±295.56a 28.59±0.46a 2 516.80±296.02a 98.86花 1 662.56±177.87b 24.16±0.55c 1 686.72±178.42b 98.57莖 1 080.30±4.94c 26.51±0.6b 1 106.81±5.54c 97.61

2.4 大花羅布麻各部位清除DPPH自由基的能力

圖1 各部位對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig.1 DPPH free radical scavenging activities of different parts

由圖1可知，大花羅布麻葉的游離態(tài)多酚提取物清除DPPH自由基能力最強(qiáng)，達(dá)3 004.24 μmol Trolox/100 g，花與莖的總清除能力較低，在1 730.47～2 270.48 μmol Trolox/100 g范圍之間。不同部位游離態(tài)多酚對(duì)DPPH自由基清除能力存在顯著差異（P＜0.05）。游離態(tài)多酚的清除能力占總酚的86.79%～94.13%，結(jié)合態(tài)多酚占總酚的5.87%～13.21%?？傊鞑课磺宄鼶PPH自由基的能力是以游離態(tài)多酚起主要作用，且與其相應(yīng)含量呈正相關(guān)關(guān)系。

2.5 大花羅布麻各部位清除ABTS+?的能力

由圖2可知，大花羅布麻不同部位游離態(tài)多酚對(duì)ABTS+?清除能力存在顯著差異（P＜0.05），其中葉中游離態(tài)多酚提取物清除能力最強(qiáng)，高達(dá)1 876.01 μmol Trolox/100 g，葉的清除能力顯著高于其他部位。在結(jié)合態(tài)多酚提取物中，根的結(jié)合態(tài)多酚提取物清除能力最強(qiáng)，為308.18 μmol Trolox/100 g，是莖的4倍多。其中莖的總清除能力最低，為 1 688.25 μmol Trolox/100 g。此外，游離態(tài)多酚的清除能力占總多酚的86.57%～95.60%，結(jié)合態(tài)多酚占總酚的4.40%～13.43%。因此，各部位清除ABTS+?的能力都是以游離態(tài)多酚起主要作用。

圖2 各部位對(duì)ABBTTSS+?的清除能力Fig.2 ABTS free radical scavenging activities of different parts

2.6 大花羅布麻各部位的總還原能力

圖3 各部位的總還原力比較Fig.3 Comparison of total reducing power of different parts

由圖3可知，大花羅布麻各部位提取物的還原能力存在顯著性差異（P＜0.05），其中葉的游離態(tài)多酚還原能力最強(qiáng)，高達(dá)2 320.58 μmol VC/100 g，葉的總還原力顯著高于其他部位。在結(jié)合態(tài)多酚提取物中，葉的結(jié)合態(tài)多酚提取物清除能力最強(qiáng)，為476.16 μmol VC/100 g，是花的2倍多?；ê颓o的總還原能力相當(dāng)。游離態(tài)多酚的還原能力占總多酚的82.17%以上。因此各部位的還原能力都是以游離態(tài)多酚起主要作用。

2.7 大花羅布麻各部位提取液中總多酚、總黃酮含量與抗氧化能力之間的相關(guān)性

將大花羅布麻各個(gè)部位提取物對(duì)DPPH自由基、ABTS+?清除能力和總還原力分別與相應(yīng)部位總酚含量、總黃酮含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)回歸分析，得到各相關(guān)系數(shù)見表5。

表5 總多酚、總黃酮含量與抗氧化能力之間的相關(guān)性Table5 Linear corelations between antioxidant properties and total phenolics or flavonoid contents

由表5可知，大花羅布麻各部位提取物總多酚含量與抗氧化能力之間具有良好的線性關(guān)系，在0.05水平上，各提取液對(duì)DPPH自由基、ABTS+?清除能力和還原能力與總酚含量的相關(guān)系數(shù)分別為0.955 2、0.959 8與0.952 8，都大于0.950 0，為顯著性相關(guān)。但各提取物總黃酮含量與抗氧化能力之間的相關(guān)系數(shù)均小于0.950 0（P＜0.05），為相關(guān)性不顯著[18]。

3 討 論

游離態(tài)和結(jié)合態(tài)是植物體中酚類化合物的兩種主要存在形式，本實(shí)驗(yàn)針對(duì)這兩種存在形式進(jìn)行研究，以往研究主要集中對(duì)游離態(tài)酚類化合物的探討，因此其測定結(jié)果未包括結(jié)合態(tài)的部分。實(shí)驗(yàn)樣品中酚類化合物的存在狀態(tài)研究表明：大花羅布麻不同部位中多酚和黃酮的存在形式主要以游離態(tài)存在（所占比例均大于90%），即在此大花羅布麻中，游離態(tài)多酚和游離態(tài)黃酮含量大致可表示其總多酚和總黃酮的含量。

大花羅布麻多酚含量的研究結(jié)果表明，植株不同部位之間多酚含量存在顯著差異。其葉中總多酚含量（（6286.68±129.16）mg GAE/100 g）比Liang Taigang等[19]報(bào)道的總多酚含量（（50.61±1.19）mg GAE/g）高；葉中總黃酮含量測定結(jié)果（（2 005.16±218.20）mg RE/100 g）與薛華茂等[20]研究的結(jié)果相一致，比Liang Taigang等[19]測定的總黃酮含量（（18.16±1.04）mg RE/g）高，但比石秋梅等[21]測定的總黃酮含量（3.54%）低些。不同部位總黃酮的含量順序：根（2.52%）＞葉（2.01%）＞花（1.69%）＞莖（1.11%）與石秋梅等[22]報(bào)道的大花羅布麻葉（3.54%）＞莖（0.56%）＞花（0.44%）＞根（0.33%）略有差異，主要原因可能是樣品采集時(shí)間、地點(diǎn)及栽培環(huán)境等因素不同所致。Adom等[22]研究發(fā)現(xiàn)小麥、大米、燕麥及玉米中多酚主要以結(jié)合態(tài)多酚形式存在，Sun Jie等[23]發(fā)現(xiàn)水果中多酚以游離多酚為主。本實(shí)驗(yàn)中大花羅布麻游離態(tài)多酚占總酚的99%以上，表明該植物中多酚的存在形式與小麥、玉米等谷物不同，而與水果中的多酚存在形式相似，主要以游離態(tài)多酚形式存在。

抗氧化活性研究表明，供試樣品均具有較強(qiáng)的清除DPPH自由基、ABTS+?的能力和總還原能力。多酚提取物的總多酚含量與對(duì)DPPH自由基、ABTS+?清除能力和總還原能力之間有顯著的正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05）。在清除DPPH自由基、ABTS+?和還原力模型中，游離態(tài)多酚的清除能力分別占總多酚的86.79%～94.13%、86.57%～95.60%和82.97%～91.02%。相關(guān)性分析也顯示其多酚含量與抗氧化能力呈良好的線性關(guān)系，說明在抗氧化體系中發(fā)揮清除能力的主要化合物可能是游離態(tài)多酚類物質(zhì)。葉中多酚含量與抗氧化活性明顯高于其他部位，說明商品化的羅布麻茶的降血壓功效可能與其多酚與黃酮含量高密切相關(guān)[24]。因此，大花羅布麻葉可以作為一種保健食品和藥品的天然抗氧化劑資源進(jìn)行深層次的開發(fā)與利用。

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