蜂膠中多酚類成分分析及其抗氧化活性

張紅城，趙亮亮，胡 浩，董 捷*

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，國家農(nóng)產(chǎn)品加工中心蜂產(chǎn)品加工分中心，北京 100093）

蜂膠是蜜蜂從膠原植物的嫩芽處采集的樹脂，并混入蜜蜂上顎腺的分泌物及蜂蠟、少量花粉等加工而成的，一種具有芳香氣味和黏性的膠狀固體物質(zhì)[1]。蜂膠具有很多功能活性[2]，一群蜂一年內(nèi)只能生產(chǎn)100～150 g蜂膠，因而蜂膠被譽(yù)為“紫色黃金”[3]。

蜂膠中主要活性成分是多酚類物質(zhì)[4]，不同蜂膠因采集植物、蜜蜂種群、時(shí)間、地點(diǎn)等的不同[5-7]，其化學(xué)成分也不盡相同，導(dǎo)致其功能活性也會(huì)有一定的差異。許多研究表明蜂膠具有很好的抗氧化作用，與一些疾病（如高血脂、糖尿病、老年癡呆癥等）的預(yù)防也有一定關(guān)系。近10 年來，氧化自由基吸收能力（oxygen radical absorbance capacity，ORAC）法被美國農(nóng)業(yè)部、美國國立衛(wèi)生院、美國宇航局等眾多科研機(jī)構(gòu)認(rèn)定為衡量食品抗氧化能力的標(biāo)準(zhǔn)分析方法。目前ORAC法已廣泛使用在評估食品的抗氧化能力上，但使用ORAC方法評估蜂膠體外抗氧化能力的研究卻很少。細(xì)胞模型能夠闡明細(xì)胞吸收、運(yùn)輸和代謝中的一些問題[7]，因此為研究細(xì)胞水平抗氧化能力提供了一種經(jīng)濟(jì)、快速的方法。

本實(shí)驗(yàn)以9個(gè)蜂膠樣品為原料，采用超聲波輔助75%乙醇水溶液法進(jìn)行提取。利用高效液相色譜-二極管陣列檢測器（high performance liquid chromatography-diode array detector，HPLC-DAD）檢測蜂膠中的多酚類成分，通過ORAC法和Hep G2細(xì)胞模型法評估不同地區(qū)蜂膠的抗氧化能力并研究蜂膠成分和抗氧化能力之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

9個(gè)蜂膠樣品由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所提供，分別來自河南新野（1號(hào)樣品）、河南拓城（2號(hào)樣品）、河北故城（3號(hào)樣品）、河北方城（4號(hào)樣品）、北京蜜蜂所（5號(hào)樣品）、北京延慶（6號(hào)樣品）、山西靈石（7號(hào)樣品）、黑龍江寶清（8號(hào)樣品）和甘肅天水（9號(hào)樣品），均由農(nóng)業(yè)部蜂產(chǎn)業(yè)體系綜合試驗(yàn)站的當(dāng)?shù)胤鋱鲈?012年7—8月分別采集。將所有的蜂膠樣品置于－20℃條件下冷凍，待其變硬變脆后，快速轉(zhuǎn)移到中草藥粉碎機(jī)粉碎，粉碎后置于封口袋，－70℃冷凍貯存，待用。

3,4-二羥基苯甲醛、咖啡酸、香蘭素、p-香豆酸、阿魏酸、異阿魏酸、苯甲酸、蘆丁、3,4-二甲氧基肉桂酸、楊梅酮、肉桂酸、桑色素、短葉松素、槲皮素、山姜素、山奈酚、亞桂皮乙酸、芹菜素、異鼠李素、松屬素、柯因、咖啡酸苯乙酯、高良姜素、山奈素、球松素、柚木柯因、肉桂酸肉桂酯、香草酸、4-甲氧基肉桂酸、水楊苷、水楊醇、水楊酸等，均為色譜純；磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、無水乙醇，均為分析純；Trolox、熒光素（fluorescein，F(xiàn)L）、偶氮二異丁脒鹽酸鹽（2,2’-azobis（2-methylpropionamide）dihydrochloride，ABAP）、封板膜、噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）、細(xì)胞培養(yǎng)級二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）、2’,7’-二氯熒光素二乙酸酯（2’,7’-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA） 美國Sigma公司；5-甲氧基短葉松素、短葉松素-3-乙酸酯 實(shí)驗(yàn)室自制；甲醇（色譜純） 美國Fisher公司；甲基化-β-環(huán)糊精 比利時(shí)Acros公司；DMEM高糖培養(yǎng)基、磷酸鹽緩沖液Hanks洗液 北京索萊寶科技有限公司；0.25 g/100 mL胰酶-EDTA消化液 美國Gibco公司；6孔、96孔細(xì)胞培養(yǎng)板 美國Corning-Costar公司；Hep G2（人肝癌細(xì)胞株） 中國科學(xué)院細(xì)胞庫。

1.2 儀器與設(shè)備

WK-600A高速粉碎機(jī) 青州市精誠醫(yī)藥裝備制造有限公司；AL204型分析天平 瑞士梅特勒-托利多（上海）儀器有限公司；Milli-Q Intergral純水/超純水一體化系統(tǒng) 美國Merk Millipore公司；KQ-50DB型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；微量移液器、5417R型冷凍離心機(jī) 德國Eppendorf公司；HZS-H型水浴搖床 哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠；SY21-K型電熱恒溫水浴鍋 北京長風(fēng)儀器儀表公司；LGJ-12真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；LC-6AD高效液相色譜儀（配有二極管陣列紫外檢測器，CTO-10A柱溫箱，SIL-自動(dòng)進(jìn)樣器，LCsolution數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)）日本島津公司；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠；Synergy TM HT型多功能酶標(biāo)儀 美國Biotek公司；HERA-Cell 150CO2培養(yǎng)箱 美國Thermo公司；IX71型熒光倒置顯微鏡 日本Olympus公司；Cell QuantaTM流式細(xì)胞儀（488 nm激光） 美國Beckman公司。

1.3 方法

1.3.1 蜂膠75%乙醇提取物的制備

準(zhǔn)確稱取500 mg已粉碎的蜂膠樣品，置于50 mL已稱重的具塞錐形瓶中，分別加入10 mL 75%乙醇。40℃、100 r/min水浴搖床中提取24 h。每6 h取出錐形瓶并于超聲波清洗器中，超聲1 h，共超聲4次。提取結(jié)束后，離心收集不同蜂膠提取液。之后取500 μL置用甲醇稀釋7.5倍，經(jīng)0.22 μm微孔膜過濾，待用。

1.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

準(zhǔn)確稱取一定質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)品，用色譜甲醇將其超聲溶解，將其配制成一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。根據(jù)各種標(biāo)準(zhǔn)品的出峰時(shí)間及強(qiáng)度，進(jìn)行相應(yīng)的混合。利用混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液進(jìn)行下面的色譜定性和定量分析。

1.3.3 HPLC的分析條件

Shim-Pack PREP-ODS（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；柱溫：35℃；檢測波長：280 nm；流速：0.65 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；流動(dòng)相：B相，甲醇（含0.1%乙酸）；A相，0.1%乙酸水溶液。所用的梯度洗脫程序如下：0～10 min，25%～27% B；10～45 min，27%～37% B；45～58 min，37%～49% B；58～80 min，49% B；80～125 min，49%～72% B；125～150 min，72%～85% B[8-10]。

1.3.4 樣品中各組分的定量

取上述配制的混合標(biāo)準(zhǔn)品工作液，按1.3.3節(jié)色譜條件，分別以1、5、10、15、20、25 μL進(jìn)樣量，依次進(jìn)樣分析。以對照品的進(jìn)樣量（X，μg/L）對峰面積Y進(jìn)行線性回歸分析，得出各個(gè)組分的標(biāo)準(zhǔn)曲線。由標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算出各個(gè)產(chǎn)地蜂膠中各組分的含量。總黃酮含量是指已定量的黃酮類成分的含量總和；總酚酸含量是指已定量的醛類、酚酸及其酯類成分的含量總和；總多酚含量是指已定量所有成分的含量總和。

1.3.5 ORAC值測定

吸取20 μL的稀釋后的樣品液或空白液（緩沖液）或者Trolox標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液（6.25、12.5、25、50、100 μmol/L）加入至96 孔板（熒光測定專用）中，于每個(gè)加樣孔中加入150 μL濃度為8.16×10-2μmol/L熒光素（FL）溶液，覆膜，然后在37℃酶標(biāo)儀中孵育10 min。最后加入30 μL 153 mmol/L ABAP（自由基產(chǎn)生劑）啟動(dòng)反應(yīng)，迅速覆膜，使用熒光酶標(biāo)儀進(jìn)行測定。酶標(biāo)儀測定條件為：激發(fā)波長485 nm，發(fā)射波長528 nm，首先振蕩5 s，然后測定，每分鐘測定1次，總測定時(shí)間為50 min[11]。

ORAC值采用美國農(nóng)業(yè)部的單位，即μmol Trolox當(dāng)量/100 g樣品。ORAC值越高，代表其抗氧化能力越強(qiáng)。

抗氧化能力= AUC抗氧化劑－AUC空白

熒光衰退曲線下面積（area under the curve，AUC）可以通過采用近似積分法計(jì)算，根據(jù)Wu等[11]實(shí)驗(yàn)中采用的公式得出。

1.3.6 MTT法檢測蜂膠對Hep G2細(xì)胞的毒性

收集對數(shù)期Hep G2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度，每孔加入200 μL，鋪板使待測細(xì)胞調(diào)密度1 000～10 000/孔，（邊緣孔用無菌PBS填充）。每組設(shè)5個(gè)平行樣，于體積分?jǐn)?shù)為5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)使其貼壁；除去培養(yǎng)液，加入新的培養(yǎng)液與不同濃度的蜂膠提取液，于5%CO2，37℃孵育20 h；棄去培養(yǎng)液，小心用PBS沖2～3 遍后，再加入含MTT的培養(yǎng)液，每孔加入20 μL MTT溶液（即0.5% MTT），繼續(xù)培養(yǎng)3 h；終止培養(yǎng)，小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。使用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測量各孔的吸光度。

1.3.7 通過細(xì)胞模型測定蜂膠的抗氧化活性

取對數(shù)生長期的Hep G2細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞懸液濃度接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每個(gè)孔加入1 mL細(xì)胞懸液。于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后去掉原培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS清洗1次；加入10 mg/mL蜂膠溶液誘導(dǎo)30 min，之后去掉培養(yǎng)基用預(yù)冷的PBS清洗一次；加入5 mmol/L H2O2刺激30 min，去掉培養(yǎng)基后用預(yù)冷的PBS清洗1次；加入20 μmol/L DCFH-DA溶液，5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)30 min，棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS溶液清洗3次，以充分洗去未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的探針。最后收集v細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液，用流式細(xì)胞儀檢測熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。

2 結(jié)果與分析

2.1 9個(gè)蜂膠樣品中多酚類化合物組成和含量比較

圖1 不同地區(qū)蜂膠的HPLC色譜圖Fig.1 Comparative HPLC chromatogram fingerprints of propolis extracts from different geographic origins

由圖1可知，保留時(shí)間70 min之前，蜂膠提取物中主要成分是酚酸類物質(zhì)，包括咖啡酸、p-香豆酸、異阿魏酸和3,4-二甲氧基肉桂酸等；在70～100 min之間主要成分是黃酮類物質(zhì)，包括松鼠素、短葉松素-3-乙酸酯、柯因等；而100 min之后主要是球松素、高良姜素等黃酮和咖啡酸苯乙酯和肉桂酸肉桂酯等酚酸酯類物質(zhì)。

表1 蜂膠提取物中多酚類成分含量Fig.1 Contents of polyphenols in propolis extracts

通過與標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間、紫外光譜進(jìn)行對比鑒定，對蜂膠樣品中的24種多酚類成分進(jìn)行了定性定量分析，結(jié)果如表1所示。蜂膠75%乙醇提取物中主要是一些多酚類成分，包括黃酮、酚酸及酯類物質(zhì)，其中河南新野（1號(hào)）和黑龍江寶清（8號(hào)）的蜂膠樣品中總多酚含量比較高，分別是230.078 mg/g和228.18 mg/g；河南拓城（2號(hào)）蜂膠樣品中的總多酚含量最低只有81.91 mg/g。此外，總酚酸含量最高的是黑龍江寶清的蜂膠，其次是河北方城（4號(hào)），分別是54.87 mg/g和42.53 mg/g；總黃酮含量最高的是來自河南新野的樣品，達(dá)到了194.52 mg/g。

在9個(gè)樣品中，含量較高的黃酮成分包括短葉松素-3-乙酸酯、松屬素、柯因、短葉松素、高良姜素、5-甲氧基短葉松素。含量較高的酚酸及酯類成分有咖啡酸苯乙酯、p-香豆酸、咖啡酸、異阿魏酸。 Claudio等[12]檢測來自于亞洲地區(qū)的各蜂膠樣品，其中含量較高的黃酮有柯因、松屬素、短葉松素-3-乙酸酯和高良姜素，這與本研究結(jié)果相近。此外，不同產(chǎn)地的蜂膠的成分存在一定的差異，如p-香豆酸在來自河南拓城和河北故城（3號(hào)）的蜂膠中的含量較其他產(chǎn)地的蜂膠中的要高；3,4-二甲氧基肉桂酸在來自河北方城、北京延慶（6號(hào)）和黑龍江寶清（8號(hào)）的蜂膠樣品中的含量較其他蜂膠樣品中的多。

表2 蜂膠提取物的ORAC評估Fig.2 ORAC values of propolis extracts

2.2 9個(gè)蜂膠樣品的ORAC值比較

由表2可知，各蜂膠提取物的ORAC值都很高，高于美國農(nóng)業(yè)部公布的所有樣品的ORAC值[13]，說明蜂膠提取物的抗氧化能力非常強(qiáng)。由表還可看出這9種蜂膠樣品的ORAC值范圍為261 021～842 096 μmol Trolox/100 g。Daugsch等[14]也測定了烏拉圭蜂膠的ORAC值，其范圍約為180 000～900 000 μmol Trolox/100 g，其結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近。結(jié)合表1和表2可知，抗氧化能力最強(qiáng)的是來自黑龍江寶清的樣品，其對應(yīng)的總酚酸的含量也是最高的，達(dá)到54.87 mg/g；而山西靈石的ORAC值最低，其總酚酸的含量為21.06 mg/g，也是所有樣品中總酚酸最低的。此外河北方城和北京延慶蜂膠的抗氧化能力在所有樣品中分別為第二和第三，其總酚酸的含量也是對應(yīng)的相同的位置。因此可知總酚酸含量較高的蜂膠，其ORAC值也普遍較高。蜂膠的ORAC抗氧化能力可能與酚酸類物質(zhì)的含量存在一定關(guān)系。

2.3 Hep G2細(xì)胞模型法研究蜂膠的抗氧化活性

2.3.1 MTT實(shí)驗(yàn)檢測不同質(zhì)量濃度蜂膠的細(xì)胞毒性

圖2 不同質(zhì)量濃度蜂膠的細(xì)胞毒性Fig.2 Cytotoxicity of different concentrations of propolis on Hep G2 assayed by MTT test

活細(xì)胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性MTT還原為水不溶性的藍(lán)紫色結(jié)晶甲瓚并沉積在細(xì)胞中，而死細(xì)胞無此功能。在一定細(xì)胞數(shù)范圍內(nèi)，MTT結(jié)晶形成的量與活細(xì)胞數(shù)成正比。二甲基亞砜能溶解細(xì)胞中的甲瓚，用酶標(biāo)儀在570 nm波長處測定其吸光度，可間接反映活細(xì)胞數(shù)量。圖2反映的是經(jīng)不同質(zhì)量濃度（0、6.25、12.5、25、50、100 μg/mL）的蜂膠處理后的細(xì)胞存活情況，吸光度越大表示活細(xì)胞數(shù)量越多。經(jīng)空白、6.25、12.5、25 μg/mL蜂膠處理后，其吸光度差異不大，即細(xì)胞存活數(shù)基本一致，說明當(dāng)蜂膠質(zhì)量濃度低于25 μg/mL，并不能致死細(xì)胞；當(dāng)蜂膠質(zhì)量濃度達(dá)到50 μg/mL時(shí)，吸光度開始明顯下降，活細(xì)胞數(shù)降低，說明蜂膠在該質(zhì)量濃度下可致死細(xì)胞。因此在之后的實(shí)驗(yàn)中，為了能更好地反映蜂膠在細(xì)胞中的作用，實(shí)驗(yàn)中蜂膠提取物質(zhì)量濃度應(yīng)低于25 μg/mL。

2.3.2 流式細(xì)胞儀檢測蜂膠的細(xì)胞內(nèi)抗氧化活性

圖3 9個(gè)蜂膠樣品對Hep G2細(xì)胞內(nèi)活性氧的影響Fig.3 Effect of propolis extracts on reactive oxygen species (ROS) in Hep G2 cells

圖3表示的是9個(gè)蜂膠樣品處理Hep G2細(xì)胞后，通過流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧變化情況。當(dāng)Hep G2細(xì)胞用過氧化氫處理后，過氧化氫與細(xì)胞內(nèi)部的DCFH反應(yīng)，產(chǎn)生具有綠色熒光的DCF。通過流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞內(nèi)DCF熒光強(qiáng)度，可以反應(yīng)出細(xì)胞內(nèi)的活性氧的水平。對于陽性樣品，即不用蜂膠樣品處理細(xì)胞，其細(xì)胞內(nèi)活性氧的含量很高，，其陽性細(xì)胞率和總熒光強(qiáng)度分別達(dá)到了96.40%和221 104（圖3c）。當(dāng)細(xì)胞經(jīng)蜂膠樣品處理后，細(xì)胞內(nèi)的活性氧都有不同程度的降低，即相比于不加蜂膠的對照樣，其陽性細(xì)胞比例和總熒光強(qiáng)度都有明顯的下降，說明這些蜂膠樣品在細(xì)胞內(nèi)都表現(xiàn)了一定的抗氧化能力。黑龍江寶清、北京蜜蜂所、甘肅天水這3種蜂膠樣品處理后的熒光強(qiáng)度降低的最明顯，都降到空白的一半以下，說明這3種蜂膠的細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力是最強(qiáng)的。其中，黑龍江寶清的蜂膠樣品，細(xì)胞內(nèi)的活性氧減少的最多，即細(xì)胞內(nèi)大量的活性氧被該蜂膠樣品清除，其陽性細(xì)胞比例為16.90%，與對照相比降低了79.5%，總熒光強(qiáng)度由之前的221 104變?yōu)?7 651，降為原來的1/3（圖3f），表明黑龍江寶清的蜂膠樣品細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力最強(qiáng)。這與之前的ORAC實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，這說明細(xì)胞模型法和體外ORAC法測定蜂膠的抗氧化能力的結(jié)果具有一定的相似性。而河北故城和河南拓城的蜂膠細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力很低。其中經(jīng)過河北故城的蜂膠樣品處理后，其清除活性氧的效果不明顯，陽性細(xì)胞比例和總熒光強(qiáng)度分別為85.20%和159 311，與對照相比差別不大，說明其清除活性氧的效果不明顯，其細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力是這幾種蜂膠樣品相比是最弱的。總之從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，9個(gè)蜂膠樣品在細(xì)胞內(nèi)均表現(xiàn)出一定的抗氧化能力。

細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力的強(qiáng)弱與ORAC法測定的細(xì)胞外抗氧化的結(jié)果有一定的相關(guān)性，但也存在一定的差異。兩種方法顯示黑龍江寶清的樣品在體外和體內(nèi)的抗氧化能力都是最強(qiáng)；而河北故城的蜂膠在處理細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的活性氧降低得最少，但其總熒光強(qiáng)度也有一定程度的降低，說明也有一定的抗氧化能力，與ORAC法測定得到其抗氧化能力是非常強(qiáng)的結(jié)果不相符，這可能是河北故城蜂膠樣品中有一部分活性成分沒有進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮抗氧化作用，從而導(dǎo)致細(xì)胞外的抗氧化能力強(qiáng)，而細(xì)胞內(nèi)的抗氧化能力弱。此外，北京蜜蜂所和甘肅天水的樣品ORAC抗氧化能力較低，而在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的結(jié)果則顯示較高。此二者中總酚酸含量低導(dǎo)致了體外的抗氧化能力低，而它們的總黃酮的含量相對來說較高。因此推測蜂膠的細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力可能與黃酮類成分有關(guān)。黃酮類成分與酚酸類成分相比可能更容易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，從而發(fā)揮抗氧化的作用，但具體機(jī)理需進(jìn)一步研究。

3 結(jié) 論

通過HPLC對9個(gè)蜂膠中多酚類成分進(jìn)行定性和定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，9個(gè)蜂膠樣品的主要多酚類成分是黃酮、酚酸和酯類物質(zhì)。黃酮類化合物含量較高的有短葉松素-3-乙酸酯、松屬素、柯因、短葉松素和高良姜素；酚酸及酯類物質(zhì)含量較高的有咖啡酸苯乙酯、p-香豆酸、咖啡酸和異阿魏酸。利用ORAC法和細(xì)胞模型研究了這9個(gè)蜂膠樣品的抗氧化活性性，結(jié)果表明這些蜂膠樣品都具有很強(qiáng)的抗氧化能力。但不同的蜂膠因含有多酚類成分及含量的差異，表現(xiàn)出的抗氧化能力也存在一定差異。一般來說，總酚酸含量高的樣品具有比較高的體外ORAC抗氧化能力。在細(xì)胞模型中，總酚酸和總黃酮含量都高的樣品，細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力強(qiáng)；蜂膠的細(xì)胞內(nèi)抗氧化能力可能與黃酮類成分有關(guān)?？傮w來說，蜂膠具有較強(qiáng)的體外和細(xì)胞水平的抗氧化能力。

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