影響分光光度法測定鈍頂螺旋藻干粉葉綠素含量的因素分析

羅光宏，許耀照*，何 琳

（1.甘肅省微藻工程技術研究中心，甘肅 張掖 734000；2.河西學院河西生態(tài)與綠洲農業(yè)研究院，甘肅 張掖 734000；3.張掖市科學技術局，甘肅 張掖 734000）

螺旋藻又名藍藻，是地球上最古老的物種之一，由于螺旋藻富含各種營養(yǎng)物質和生物活性物質，已成為一種新型“食藥同源”的優(yōu)質菌體蛋白[1-2]。螺旋藻是成功開發(fā)并實現(xiàn)產業(yè)化生產的微藻。目前工業(yè)化生產的螺旋藻只有鈍頂螺旋藻（Spirulina platnsis）和極大螺旋藻（Spirulina maxima）[3-4]。螺旋藻具有提高機體免疫力，防癌、抗輻射、抗衰老以及放射防護等能力[5-7]，被聯(lián)合國糧農組織和聯(lián)合國教科文組織推薦為“21世紀人類蛋白質的來源”和“人類明天最理想的保健食品”[8-9]。

螺旋藻為浮游性原始藻類植物，其葉綠素含量豐富，因此具有改善血紅素水平，提高血液循環(huán)系統(tǒng)的功能[10]。螺旋藻葉綠素a含量大約占有機物干質量的1%～2%，可作為估計藻類的生物量和生產力的指標的重要指標[11]。測定浮游植物葉綠素a的方法可以分為高效液相色譜法、熒光光度計法和分光光度計法等[12]。其中，可見分光光度法是測定浮游植物葉綠素最常用的方法[13-14]。國內外在該領域采用的葉綠素a測定方法是國家環(huán)?？偩帧端蛷U水監(jiān)測分析方法》和聯(lián)合國教科文推薦的分光光度法，其具有靈敏度高、儀器設備簡單、操作簡便、應用廣泛等優(yōu)點。彭文彬等[15]利用兩種分光光度法測定浮游植物葉綠素a含量，表明三色法和單色法分光光度法具有相同的精密度，但是單色法更具有較好的穩(wěn)定性和理論的符合性；戴榮繼等[16]通過分光光度計法測定了藻類葉綠素含量，發(fā)現(xiàn)不同藻類具有很大差異。段剛等[17]通過丙酮-分光光度法測定了滇池藻類葉綠素含量，間接測定了滇池藻類生長情況。董育紅等[18]通過分光光度法測定螺旋藻粉β-胡蘿卜素含量，發(fā)現(xiàn)其胡蘿卜素的含量是胡蘿卜的10倍以上。根據(jù)所用的色素萃取液不同，可分為丙酮法、甲醇法和乙醇法以及丙酮-乙醇混合液提取法等。國內常用的丙酮-分光光度法測定葉綠素含量，而國際上較通用的是熱乙醇-分光光度法。前人研究發(fā)現(xiàn)，提取液種類、提取方式以及提取時間等是影響葉綠素含量測定穩(wěn)定性的重要因素[19-23]。

目前關于螺旋藻葉綠素含量的測定多集中于從藻液中獲得的藻體，而關于鈍頂螺旋藻干粉葉綠素含量測定的報道較少，本研究擬對影響分光光度法測定鈍頂螺旋藻干粉葉綠素含量的因素進行探討，旨在為快速、高效檢測螺旋藻類干粉葉綠素含量和螺旋藻干粉的研究開發(fā)提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鈍頂螺旋藻（Spirulina platensis），綠色干片，由甘肅省微藻工程技術研究中心提供。

95%乙醇、99.5%丙酮均為分析純。

1.2 儀器與設備

UV-1200可見光分光光度計 鄭州南北儀器設備有限公司；BSA224S電子天平 賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；DHG-9123A電熱恒溫鼓風干燥箱 上海美普達儀器有限公司；RXZ-300D智能型人工氣候箱寧波市科技園區(qū)新江南儀器有限公司。

1.3 方法

稱取5.0 g鈍頂螺旋藻綠色干片，在45℃條件下烘干1.5 h，然后置干燥器中冷卻至室溫，用研缽（Φ=9 cm）反復研磨鈍頂螺旋藻為干粉，備用。實驗于2013年8月—12月在甘肅省河西走廊特色資源利用重點實驗室進行。

1.3.1 浸提劑的影響

精確稱取備用的鈍頂螺旋藻干粉0.030 g（精確至0.000 1 g）樣品于50 mL的具塞玻璃刻度試管中，分別加入以下試劑：T1（95%乙醇-99.5%丙酮（1∶1，V/V））12 mL，T2（99.5%丙酮）10 mL，T3（95%乙醇）10 mL，T4（95%乙醇-99.5%丙酮（2∶1，V/V））12 mL，T5（95%乙醇-99.5%丙酮（1∶2，V/V））12 mL，每個處理重復3次，與室溫（23±2）℃條件下避光浸提，每隔2 h攪動3～5 min，浸提24 h后沉淀1～2 min，將浸提液置于25 mL的棕色容量瓶中，用T1、T2、T3、T4和T5浸提劑溶液定容于容量瓶刻度線，并記錄定容液的體積數(shù)。并測定不同波長處浸提液的吸光度。

1.3.2 浸提時間的影響

精確稱取備用的鈍頂螺旋藻干粉0.030 g（精確至0.000 1 g）置于50 mL的具塞玻璃刻度試管中，加入以1.3.1節(jié)選擇的最優(yōu)浸提劑10 mL，于室溫（23±2）℃條件下避光浸提，每隔2 h攪動3～5 min，靜置沉淀1～2 min，浸提時間設為2、4、6、8、10、12、14、24 h 8個處理，每個處理重復3次，測定不同波長處浸提液的吸光度。

1.3.3 浸提溫度的影響

精確稱取備用的鈍頂螺旋藻干粉0.030 g（精確至0.000 1 g）置于50 mL的具塞玻璃刻度試管中，加入1.3.1節(jié)選擇的最優(yōu)浸提劑10 mL和1.3.2節(jié)選擇的最優(yōu)浸提時間條件下避光浸提，每隔2 h攪動3～5 min，靜置沉淀1～2 min，浸提溫度設為15、20、21、22、25℃ 5個處理，每個處理重復3次，在1.3.2節(jié)選擇的最優(yōu)浸提時間測定不同波長處浸提液的吸光度。

1.3.4 正交試驗設計

在單因素試驗的基礎上設計正交試驗[24-26]，采用L9（34）正交試驗設計，考察浸提劑、浸提時間、浸提溫度3個因素對鈍頂螺旋藻干粉葉綠素含量的影響，每個因素選擇3個水平。正交試驗因素與水平如表1所示。

表1 正交試驗因素與水平Table1 Factors and levels used for orthogonal array design

1.3.5 葉綠素含量計算

以浸提液相對應的浸提劑溶液作為空白，用帶塞的1 cm的玻璃比色皿在450、630、645、652、663、750 nm波長處測定浸提液的吸光度。再根據(jù)（1）、（2）和（3）式計算出浸提液中葉綠素、葉綠素a和類胡蘿卜素質量濃度，并依據(jù)（4）、（5）和（6）計算葉綠素、葉綠素a和類胡蘿卜素含量。

式中：ρ為葉綠素質量濃度/（mg/L）；ρa為葉綠素a質量濃度/（mg/L）；ρxc為類胡蘿卜素質量濃度/（mg/L）；A450nm、A630nm、A645nm、A663nm、A652nm、A750nm分別為450、630、645、663、652、750 nm波長處的吸光度；V為色素提取浸提混合液的體積；N為測定葉綠素稀釋倍數(shù)；m為樣品的質量/g。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2003軟件對數(shù)據(jù)進行分析和作圖；用DPS 7.05軟件對數(shù)據(jù)進行方差分析；利用Duncan式多重比較對差異顯著性進行分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 浸提劑對鈍頂螺旋藻干粉葉綠素含量的影響

圖1 浸提劑對鈍頂螺旋藻葉綠素、葉綠素a和類胡蘿卜素含量的影響Fig.1 Effect of extraction solvent on the determination of total chlorophyll, chlorophyll a and carotenoids in Spirulina platensis

由圖1可以看出，不同的浸提劑對鈍頂螺旋藻干粉葉綠素含量有明顯的影響。T1浸提劑處理的葉綠素、葉綠素a和類胡蘿卜素含量最高，依次為11.20、8.03 mg/g和2.03 mg/g，與T2、T3、T4和T5浸提劑處理的葉綠素、葉綠素a和類胡蘿卜素含量達到顯著差異（P＜0.05）；T2浸提劑處理的葉綠素a含量和類胡蘿卜素含量最小，依次為5.87 mg/g和1.25 mg/g；T3浸提劑處理的葉綠素含量最小，為7.45 mg/g；不同浸提劑處理對鈍頂螺旋藻干粉葉綠素含量依次為T1＞T4＞T5＞T2＞T3。這表明單一的丙酮或乙醇不宜做鈍頂螺旋藻干粉葉綠素的浸提劑，丙酮和乙醇以不同的體積比混合可以有效提高鈍頂螺旋藻干粉葉綠素含量，且以95%丙酮-95%乙醇（1∶1，V/V）浸提鈍頂螺旋藻干粉葉綠素是可選擇的適宜浸提劑。

2.2 浸提時間對鈍頂螺旋藻干粉葉綠素含量的影響

表2 浸提時間對鈍頂螺旋藻葉綠素、葉綠素a和類胡蘿卜素含量的影響Table2 Effect of extraction time on the determination of total chlorophyll, chlorophyll a and carotenoids in Spirulina platensis mg/g

由表2可以看出，由T1處理浸提劑浸提鈍頂螺旋藻干粉葉綠素，不同浸提時間對其葉綠素含量有明顯的影響。隨著浸提時間延長，T1處理浸提劑浸提鈍頂螺旋藻干粉葉綠素含量不斷增加，當浸提時間為8 h時，浸提的鈍頂螺旋藻干粉葉綠素含量達到最大值為14.59 mg/g，當浸提時間超過8 h后，浸提的葉綠素含量略有下降，但無明顯的降低。浸提8 h與其他浸提時間處理間達到顯著差異（P＜0.05）。當浸提時間為8 h時，鈍頂螺旋藻干粉葉綠素a的含量最大為8.97 mg/g，與其他浸提時間處理間達到顯著差異（P＜0.05），浸提時間為2、4、6、10、12 h和14 h處理的葉綠素a的含量無顯著差異。當浸提時間為8 h 時，鈍頂螺旋藻干粉類胡蘿卜素的含量最大為2.98 mg/g，與其他浸提時間處理間達到顯著差異（P＜0.05），浸提時間2 h時，鈍頂螺旋藻干粉類胡蘿卜素的含量最小為2.09 mg/g，且不同的浸提時間處理間類胡蘿卜素含量達到顯著差異（P＜0.05）。這表明浸提時間明顯影響鈍頂螺旋藻干粉葉綠素、葉綠素a和類胡蘿卜素的含量，且8 h是測定鈍頂螺旋藻干粉葉綠素含量可選擇的適宜浸提時間。

2.3 浸提溫度對鈍頂螺旋藻干粉葉綠素含量的影響

表3 浸提溫度對鈍頂螺旋藻葉綠素、葉綠素a和類胡蘿卜素含量的影響Table3 Effect of extraction temperature on the determination of total chlorophyll, chlorophyll a and carotenoids in Spirulina platensis mg/g

T1浸提劑處理，浸提8 h后測定鈍頂螺旋藻干粉葉綠素含量，由表3可以看出，不同浸提溫度對其葉綠素含量有明顯的影響。隨著浸提溫度升高，T1浸提劑處理浸提8 h時鈍頂螺旋藻干粉葉綠素含量不斷增加，當浸提溫度為21℃時，鈍頂螺旋藻干粉葉綠素含量達到最大值為13.21 mg/g，當浸提溫度低于20℃和超過22℃時，葉綠素含量顯著下降（P＜0.05），浸提溫度為20、21℃和22℃與15℃和25℃溫度處理間達到顯著差異（P＜0.05），浸提20、21℃和22℃間無明顯差異，但浸提溫度為21℃時，測定其葉綠素含量最大。浸提溫度對鈍頂螺旋藻干粉葉綠素a含量無顯著差異。浸提溫度為21℃時對鈍頂螺旋藻干粉類胡蘿卜素含量與其他浸提溫度達到顯著差異（P＜0.05）。這表明浸提溫度明顯影響鈍頂螺旋藻干粉葉綠素含量的測定，21℃是測定鈍頂螺旋藻干粉葉綠素含量可選擇的適宜浸提溫度。

2.4 正交試驗分析

表4 正交試驗設計與結果Table4 Results and analysis of orthogonal array design

表5 方差分析表Table5 Analysis of variance for the experimental results of orthogonal array design

由表4可以看出，各因素影響鈍頂螺旋藻干粉葉綠素含量的主次順序為浸提劑＞浸提時間＞浸提溫度，最優(yōu)因素水平組合為A1B2C2，即在浸提劑95%乙醇-99.5%丙酮（1∶1，V/V）、浸提時間8 h、浸提溫度21℃時，浸提鈍頂螺旋藻干粉葉綠素含量最高，為13.21 mg/g。由表5可知，浸提劑對鈍頂螺旋藻干粉葉綠素含量影響達到顯著水平（P＜0.05）。

3 結 論

本實驗對影響分光光度法測定鈍頂螺旋藻干粉葉綠素含量的因素進行了探討，以確定快速測定葉綠素含量的操作參數(shù)。其測定葉綠素含量的最佳參數(shù)為浸提劑95%乙醇-99.5%丙酮（1∶1，V/V）、浸提時間8 h和浸提溫度21℃，此條件下測定鈍頂螺旋藻干粉的葉綠素含量最高，其中浸提劑成分對鈍頂螺旋藻干粉的葉綠素含量有明顯影響。該方法簡便易行，浸提效果良好，可用于分光光度法測定藻類干粉的葉綠素含量。

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