非諾貝特保護(hù)非酒精性脂肪性肝病小鼠胰島素抵抗作用機(jī)制的探討

沈馨茹，魯云霞，章 秋

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指以除外酒精或其他明確的損肝因素所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征。近年來，隨著人們生活水平的提高和生活方式的改變，NAFLD的發(fā)病率逐年上升，已成為最常見的慢性肝臟疾?。?］。NAFLD除了可直接導(dǎo)致失代償期肝硬化、肝細(xì)胞癌和移植肝復(fù)發(fā)外，還可影響其他慢性肝病的進(jìn)展，并參與2型糖尿病和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)病過程［2］。NAFLD的重要病理學(xué)特征之一是胰島素抵抗［3］，近年來文獻(xiàn)［4］報(bào)道其可能與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)有關(guān)。非諾貝特是目前臨床上較為常用的調(diào)脂藥物，其作用機(jī)制可能與降脂、抗炎和抗氧化應(yīng)激等有關(guān)，但尚無其參與ERS的相關(guān)報(bào)道［5］。由于非諾貝特的藥效學(xué)效應(yīng)較明確，該研究先用模擬人類高熱量高膽固醇飲食(high-calorie and high-cholesterol diet，HCD)的比例制作的飼料誘導(dǎo)構(gòu)建NAFLD小鼠模型，然后給予單一劑量的非諾貝特干預(yù)，初步探討其保護(hù)作用是否與改變過氧化物酶體增殖物激活受體α(peroxisome proliferator-acivated receptor α，PPARα)以及ERS標(biāo)志蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein 78，GRP78)和轉(zhuǎn)錄因子GADD153(CCAAT/enhancer-binding protein homologous protein，CHOP)的表達(dá)有關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 8周齡C57BL/6小鼠36只，清潔級(jí)，雄性，體重20～25 g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，每籠6只，溫度20～25℃，相對(duì)濕度35% ～60%，自由攝食飲水，常規(guī)飼養(yǎng)1周后實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑 非諾貝特(江蘇神龍藥業(yè)有限公司);油紅 O(美國(guó) Sigma公司);RNAiso Reagent、Real-time PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司);RT試劑盒(美國(guó)Fermentas公司);BCA蛋白定量試劑盒(上海生工生物工程有限公司);3-磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)鼠單克隆抗體(康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司);兔抗鼠 PPARα、CHOP一抗(美國(guó) Santa Cruz公司);兔抗鼠 GRP78一抗(美國(guó) Abcam公司);山羊抗兔及山羊抗鼠辣根過氧化物酶抗體(武漢博士德生物技術(shù)有限公司);ECL增強(qiáng)型發(fā)光劑(美國(guó)Pierce公司);RIPA裂解液(碧云天生物技術(shù)研究所)。

1.3 造模與分組 將C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常飲食組(SCD組，n=10)和HCD組(n=26)，SCD組給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)(安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，總熱量14.5 kJ/g，含66.9%碳水化合物，24.8%蛋白質(zhì)，8.3%脂肪);HCD組給予高熱量高膽固醇飼料喂養(yǎng)(由20%豬油，20%蔗糖，10%蛋黃粉，1%膽固醇和49%基礎(chǔ)飼料混合壓制成型)，12周后取體重明顯增加的小鼠20只隨機(jī)分為HCD組(n=10)和HCD+非諾貝特組(HCF組，n=10)，HCD組繼續(xù)予以HCD喂養(yǎng)2周，HCF組在給予HCD的同時(shí)予以非諾貝特40 mg/(kg·d)灌胃治療2周。

1.4 葡萄糖耐量試驗(yàn)(GTT)和胰島素耐量試驗(yàn)(ITT) 小鼠禁食12 h后，灌胃給予葡萄糖2 g/kg，分別于0、30、60、90、120 min 鼠尾采血測(cè)定血糖水平，行GTT;小鼠禁食4 h后，腹腔注射胰島素0.1 U/kg，分別于 0、30、60、90、120 min 采血測(cè)定血糖值，行ITT。采血量約5 μl，采血過程中小鼠生命體征平穩(wěn)。

1.5 血清學(xué)檢測(cè) 所有小鼠禁食12 h，CO2窒息處死，摘眼球取血，3 000 r/min離心5 min，分離血清，檢測(cè)血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartic transaminase，AST)、三酰甘油(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、高密度脂蛋白膽固醇(high-density lipoprotein-cholesterol，HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(low-density lipoprotein-cholesterol，LDL-C)水平。

1.6 HE和油紅O染色 將肝組織經(jīng)4%多聚甲醛固定后進(jìn)行石蠟包埋，5 μm切片，HE染色，200倍光鏡下觀察并采集圖像。將肝組織進(jìn)行冰凍切片，厚約5 μm，60%異丙醇中稍洗，油紅O染色約1 h，60%異丙醇洗去多余染液，蘇木精染核，甘油明膠封片，400倍光鏡下觀察并采集圖像。

1.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR TRIzol法抽提肝臟組織總RNA，2 μg總RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)引物。PPARα上游:5'-ACGATGCTGTCCTCCTTGATG-3'，下 游:5'-GTGTGATAAAGCCATTGCCGT-3';GRP78上游:5'-TGTGGTACCCACCAAGAAGTC-3'，下游:5'-TTCAGCTGTCACTCGGAGAAT-3';CHOP上游:5'-ATATCTCATCCCCAGGAAACG-3'，下游:5'-TCTTCCTTGCTCTTCCTCCTC-3';GAPDH上游:5'-TGTGTCCGTCGTGGATCTGA-3'，下游:5'-CCTGCTTCACCACCTTCTTGAT-3'。在StepOnePlus(美國(guó)ABI公司)上進(jìn)行擴(kuò)增，94℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性15 s，60 ℃ 40 s，共40個(gè)循環(huán)，用比較Ct法(ΔΔCt法)分析結(jié)果。

1.8 Western blot 各組肝臟組織50 mg，RIPA裂解液抽提總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度，12%SDSPAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉后分別用抗 GAPDH(1 ∶800)、PPARα (1 ∶800)、GRP78(1∶600)和CHOP(1∶1 000)一抗4℃孵育過夜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或抗鼠二抗室溫孵育1 h，加入ECL發(fā)光劑反應(yīng)5～10 min，暗室顯影成像，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 非諾貝特對(duì)NAFLD小鼠胰島素抵抗的影響GTT結(jié)果表明:HCD組小鼠空腹血糖值比SCD和HCF組高，注射葡萄糖30 min后血糖達(dá)到峰值，且明顯高于SCD和HCF組，此后下降緩慢，血糖波動(dòng)大;與HCD組相比，HCF組血糖波動(dòng)較平穩(wěn)，且峰值明顯低于HCD組。ITT結(jié)果表明:在注射胰島素30 min內(nèi)，SCD組小鼠血糖迅速下降，隨后緩慢上升，HCD組血糖下降緩慢，且始終維持在較高水平;HCF組各時(shí)間點(diǎn)的血糖值介于SCD和HCD組之間，見圖1。

表1 3組小鼠的血液生化指標(biāo)變化(n=10，±s)

表1 3組小鼠的血液生化指標(biāo)變化(n=10，±s)

與SCD組比較:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;與HCD組比較:#P＜0.05

SCD 0.44 ±0.07 1.67 ±0.29 1.78 ±0.39 0.21 ±0.0539.20 ±5.71 68.40 ±10.14 HCD 0.73 ±0.14＊＊ 2.42 ±0.45＊＊ 1.29 ±0.26＊＊ 0.49 ±0.09* 40.14 ±8.19 68.00 ±18.58 HCF 0.44 ±0.12# 2.21 ±0.25 1.56 ±0.18 0.42 ±0.27 41.14 ±7.38 74.57 ±13.21 F值3.864 7.044 4.148 3.809 0.104 0.412

2.2 非諾貝特對(duì)NAFLD小鼠血清生化指標(biāo)的影響 如表1所示，與SCD組小鼠相比，HCD組小鼠血清TG、TC、LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01，P＜0.05);與HCD組比較，HCF組中TG下降明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05);ALT和AST水平在3組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

圖1 各組小鼠GTT和ITT

2.3 非諾貝特對(duì)NAFLD小鼠肝臟組織病理學(xué)的影響 SCD組小鼠肝細(xì)胞形態(tài)正常，胞質(zhì)清晰;HCD組可見肝細(xì)胞內(nèi)有大小不等的脂滴形成，肝細(xì)胞有氣球樣變，中央靜脈處有炎性細(xì)胞浸潤(rùn);而HCF組肝細(xì)胞脂肪變性程度及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較HCD組明顯減少;油紅O染色同樣表明了HCD組肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴明顯多于SCD組，而HCF組肝細(xì)胞內(nèi)脂滴明顯減少。見圖2。

2.4 非諾貝特對(duì)PPARα、GRP78和CHOP mRNA水平表達(dá)的影響 Real-time PCR結(jié)果表明，與SCD組比較，HCD組小鼠肝臟組織內(nèi) PPARα、GRP78 mRNA表達(dá)量明顯降低，而CHOP mRNA表達(dá)量明顯升高(P＜0.05);非諾貝特干預(yù)后能夠顯著增加肝臟組織內(nèi)的PPARα、GRP78 mRNA的表達(dá)量，減少CHOP mRNA的表達(dá)量(P＜0.05)，見圖3。

2.5 非諾貝特對(duì)PPARα、GRP78和CHOP蛋白水平表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果表明，與SCD組相比，HCD組小鼠肝臟組織表達(dá)的PPARα、GRP78蛋白水平顯著下降，CHOP的蛋白表達(dá)量明顯升高(P＜0.05);非諾貝特干預(yù)后PPARα、GRP78的蛋白水平表達(dá)顯著上升，CHOP的蛋白表達(dá)量明顯下調(diào)(P＜0.05)，見圖4。

圖2 各組肝組織病理學(xué)情況

3 討論

NAFLD是一種與胰島素抵抗和遺傳易感性密切相關(guān)的代謝應(yīng)激性肝病，包含了一系列肝臟損傷狀態(tài)，包括單純性脂肪肝(simple steatosis，SFL)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)及其最后的肝硬化和肝纖維化。本次研究采用高熱量高膽固醇飼料喂養(yǎng)小鼠12周，HCD組小鼠血清的TG、TC、LDL-C水平顯著升高，HDL-C水平明顯下降;病理學(xué)檢測(cè)顯示HCD組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)有大小不等的脂滴形成，肝細(xì)胞部分氣球樣變，局部有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，表明已成功建立了NAFLD模型。

圖3 非諾貝特對(duì)各組小鼠肝臟組織PPARα、CHOP、GRP78 mRNA表達(dá)水平的影響

圖4 非諾貝特對(duì)各組小鼠肝臟組織PPARα、GRP78、CHOP蛋白表達(dá)水平的影響

非諾貝特是PPARα的特異性激動(dòng)劑，具有抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)、抗凋亡等作用，可降低2型糖尿病血管并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)［6－8］。本實(shí)驗(yàn)采用該藥治療時(shí)，顯示非諾貝特可明顯降低NAFLD小鼠的血清TG水平，減少肝細(xì)胞內(nèi)的脂滴，表明非諾貝特能夠降低血脂和減輕肝臟脂肪沉積。然而，ALT和AST水平在3組小鼠間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，之前曾有文獻(xiàn)［9］報(bào)道59%的脂肪肝患者血清ALT是正常的，這些患者肝臟活檢證實(shí)還未進(jìn)展至NASH階段，本次研究結(jié)果與其基本一致。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的平衡方面具有重要作用，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)被破壞時(shí)，將會(huì)導(dǎo)致ERS，而已知ERS在NAFLD的發(fā)生發(fā)展中扮演相當(dāng)重要的角色［10］。GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中最重要的分子伴侶之一，可參與新生多肽鏈的折疊、裝配和轉(zhuǎn)運(yùn)，研究［11］表明在ERS的早期，GRP78的表達(dá)迅速增加，可幫助變性蛋白重新折疊，恢復(fù)蛋白質(zhì)的正確構(gòu)象，減輕ERS，同時(shí)將無法恢復(fù)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移降解，從而避免細(xì)胞進(jìn)一步受到傷害。然而，持續(xù)過強(qiáng)的應(yīng)激將會(huì)使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自穩(wěn)態(tài)功能受到嚴(yán)重?fù)p害，GRP78合成減少，同時(shí)CHOP的表達(dá)明顯增加，從而啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的凋亡通路，使細(xì)胞死亡［12］。本研究中非諾貝特能明顯激活PPARα的表達(dá)，從而通過增加肝組織中TG的氧化分解來起降脂作用;另一方面通過增加GRP78的表達(dá)、降低CHOP的表達(dá)來減輕ERS進(jìn)而激活下游的胰島素信號(hào)通路來改善胰島素抵抗;但GRP78 mRNA和蛋白水平的改變不太一致，可能與其轉(zhuǎn)錄后模板降解增加有關(guān)，其具體原因有待后期的進(jìn)一步深入研究。

本研究結(jié)果表明:非諾貝特有明顯的改善NAFLD小鼠的胰島素抵抗、降低TG的作用，可能與激活PPARα及減輕ERS有關(guān)。然而非諾貝特具體影響ERS下游的哪條信號(hào)通路還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)來證實(shí)，其機(jī)制的闡明將為非諾貝特開發(fā)作為治療NAFLD的藥物奠定基礎(chǔ)。

［1］Tiniakos D G，Vos M B，Brunt E M.Nonalcoholic fatty liver disease:pathology and pathogenesis［J］.Annu Rev Pathol，2010，5:145－71.

［2］Adams L A，Waters O R，Knuiman M W，et al.NAFLD as a risk factor for the development of diabetes and the metabolic syndrome:an eleven-year follow-up study［J］.Am J Gastroenterology，2009，104(4):861－7.

［3］Cohen J C，Horton J D，Hobbs H H.Human fatty liver disease:old questions and new insights［J］.Science，2011，322(6037):1519－23.

［4］Puri P，Mirshahi F，Cheung O，et al.Activation and dysregulation of the unfolded protein response in nonalcoholic fatty liver disease［J］.Gastroenterology，2008，134(2):568 － 76.

［5］Michael S K，Anastazia K，Moses S E.Current role of fenofibrate in the prevention and management of non-alcoholic fatty liver disease［J］.World J Hepatol，2013，5(9):470 －8.

［6］Vera T，Taylor M，Bohman Q，et al.Fenofibrate prevents the development of angiotensin Ⅱ-dependent hypertension in mice［J］.Hypertension，2005，45(4):730－5.

［7］Miranda S，Gonzalez-Rodriquez A，Garcia-Ramirez M，et al.Beneficial effects of fenofibrate in retinal pigment epithelium by the modulation of stress and survival signaling under diabetic conditions［J］.J Cell Physiol，2012，227(6):2352 －62.

［8］Walker A E，Kaplon R E，Lucking S M，et al.Fenofibrate improves vascular endothelial function by reducing oxidative stress while increasing endothelial nitric oxide synthase in healthy normolipidemic older adults［J］.Hypertension，2012，60(6):1517 －23.

［9］Fracanzani A L，Valenti L，Bugianesi E，et al.Risk of severe liver disease in nonalcoholic fatty liver disease with normal aminotransferase levels:a role for insulin resistance and diabetes［J］.Hepathology，2008，48(3):792 －8.

［10］Abdelmalek M F，Diehl A M.Nonalcoholic fatty liver disease as a complication of insulin resisitance［J］.Med Clin North Am，2007，91(6):1125－49.

［11］Hotamisligi G S.Endoplasmic reticulum stress and the inflammatory basis metabolic disease［J］.Cell，2010，140(6):900 －17.

［12］Tajiri S，Yano S，Morioka M，et al.CHOP is involved in neuronal apoptosis induced by neurotrophic factor deprivation［J］.FEBS Lett，2006，580(14):3462 －8.