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    三氟乙酸/超聲波預(yù)處理對(duì)芒草纖維素結(jié)構(gòu)及酶解效果的影響

    2014-01-29 02:11:42李本祥董新榮
    化工技術(shù)與開(kāi)發(fā) 2014年11期
    關(guān)鍵詞:三氟乙酸芒草固液

    李本祥,董新榮,羅 景

    (湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院應(yīng)用化學(xué)系,湖南 長(zhǎng)沙 410128)

    隨著能源問(wèn)題的日益突出,人們對(duì)可再生能源越來(lái)越重視,加強(qiáng)對(duì)木質(zhì)纖維素類可再生資源高值利用研究對(duì)解決能源危機(jī)具有重要的戰(zhàn)略意義[1-3]。芒屬植物以C4循環(huán)方式進(jìn)行光合作用,生長(zhǎng)迅速,生活周期短,抗逆性強(qiáng),產(chǎn)量高且纖維素和半纖維素占總量的80%以上,是一種理想制備燃料乙醇的木質(zhì)纖維素原料[4]。但木質(zhì)纖維素由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜,纖維素、半纖維素不但被木質(zhì)素包裹,而且半纖維素部分共價(jià)和木質(zhì)素結(jié)合,纖維素具有高度有序晶體結(jié)構(gòu),使其纖維素酶解嚴(yán)重受限,因此必須對(duì)其進(jìn)行預(yù)處理以去除部分或全部木質(zhì)素,或在一定程度上改變?cè)衔锢砘瘜W(xué)結(jié)構(gòu),如降低結(jié)晶度,減小聚合度,增加孔隙度和表面積等,以促進(jìn)酶與底物相互接觸并反應(yīng),提高酶解速率和總糖得率[5-7]。目前已知預(yù)處理方法有物理法、化學(xué)法和生物法等,但每種方法單獨(dú)使用其預(yù)處理效果和成本都有待改進(jìn)[8]。三氟乙酸能夠破壞纖維素的晶體結(jié)構(gòu)[9],超聲具有波長(zhǎng)較短、能量集中的特點(diǎn),在各行業(yè)有廣泛的用途,但利用超聲波破壞纖維素晶體結(jié)構(gòu)的報(bào)道較少[10]。本研究以三氟乙酸/超聲波聯(lián)合預(yù)處理方式處理芒草,考察不同的預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)纖維素晶體結(jié)構(gòu)及酶解效果的影響,為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)以芒草為原料生產(chǎn)生物乙醇技術(shù)奠定基礎(chǔ)。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 材料

    芒草秸稈取自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)試驗(yàn)田,洗凈自然風(fēng)干后切成1~2cm 的小段,在60℃下干燥36h ,然后用植物粉碎機(jī)粉碎,過(guò)0.84mm篩, 室溫貯存干燥器中備用。

    1.2 芒草秸稈的預(yù)處理

    取粉碎后的芒草秸桿5g置于250mL具塞磨口瓶中,加入三氟乙酸溶液,置于超聲波發(fā)生器中對(duì)試樣進(jìn)行預(yù)處理,考察不同的條件對(duì)預(yù)處理糖化率和芒草酶解糖化率的影響。

    1.3 預(yù)處理樣品的酶解

    試樣的酶解采用文獻(xiàn)[11]方法。取2g纖維素酶(酶活力15000 U·g-1)溶于1000mL的pH為4.6的醋酸-醋酸鈉緩沖溶液中。稱取預(yù)處理后的芒草樣品3g置于100 mL碘量瓶中,加入33mL纖維素酶溶液(相當(dāng)于22mg·g-1),搖勻,置于恒溫水浴振蕩器中,45℃、165r·min-1酶水解 72h,過(guò)濾,測(cè)濾液中的還原糖,其含量采用DNS 法測(cè)定。

    2 結(jié)果與討論

    2.1 預(yù)處理對(duì)芒草秸桿組成和結(jié)構(gòu)的影響

    2.1.1 XRD分析

    XRD曲線可以很好地描述纖維素結(jié)晶的狀況。圖1為預(yù)處理前后芒草中纖維素的X衍射圖。由圖1可以看出,預(yù)處理前芒草中纖維素在2θ為22.3°和16.1°各有一個(gè)主要峰和次要峰。主要峰代表的是002面峰的強(qiáng)度,即結(jié)晶區(qū)的衍射強(qiáng)度,次要峰代表的是無(wú)定形區(qū)的強(qiáng)度。樣品經(jīng)過(guò)三氟乙酸溶液處理之后,次要峰變成一組強(qiáng)度很低分布很寬的衍射峰,峰形不再尖銳明顯,主要峰強(qiáng)度也明顯降低。說(shuō)明纖維素經(jīng)過(guò)三氟乙酸溶液處理之后,原有晶形受到破壞,結(jié)晶度大大降低,這樣可為纖維素酶解組分中剪切作用最快、效果最好的內(nèi)切酶提供更多更好的作用位點(diǎn),可加快酶解速率,提高還原糖的轉(zhuǎn)化率,這在后面酶解實(shí)驗(yàn)中得到驗(yàn)證。同時(shí)從圖1(A線)中可以看出,纖維素經(jīng)過(guò)三氟乙酸/超聲波聯(lián)合預(yù)處理后,次要峰已經(jīng)完全消失,主要峰的強(qiáng)度進(jìn)一步降低,說(shuō)明超聲波能夠加速纖維素晶形破壞程度,使芒草中纖維素結(jié)晶度下降更為明顯,經(jīng)三氟乙酸/超聲波聯(lián)合預(yù)處理的底物有更好的酶解效果。

    圖1 不同預(yù)處理方式的纖維素的XRD圖Figur e 1 XRD pat ter ns of cel l ul ose sampl es

    2.1.2 FTIR分析

    由于芒草中纖維素的官能團(tuán)和化學(xué)鍵在紅外光譜中的特定頻率都已經(jīng)知道,因此通過(guò)紅外光譜可以定性和定量分析纖維素中存在的官能團(tuán)以及它們?cè)陬A(yù)處理前后的變化[12]。預(yù)處理前后芒草中纖維素的紅外光譜圖見(jiàn)圖2。從圖2中可以看出,預(yù)處理前后纖維素的紅外吸收峰形狀基本相同,但是吸收強(qiáng)度有所不同,表明預(yù)處理使纖維素的形態(tài)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化。經(jīng)過(guò)酸處理后,表征纖維素中-CH,-CH2伸縮振動(dòng)的波數(shù)為2900cm-1,吸收峰強(qiáng)度降低,表明纖維素大分子中甲基、亞甲基發(fā)生了部分?jǐn)嗔眩捎萌宜?超聲波聯(lián)合預(yù)處理時(shí),波數(shù)為2900cm-1的吸收峰強(qiáng)度降低得更明顯,說(shuō)明對(duì)纖維素結(jié)構(gòu)破環(huán)得更為嚴(yán)重。波數(shù)1635 cm-1處的吸收峰是表征吸附水的伸展振動(dòng),經(jīng)預(yù)處理后的纖維素中1635 cm-1處吸收峰強(qiáng)度都要明顯高于未處理的纖維素中此處吸收峰,說(shuō)明經(jīng)過(guò)三氟乙酸溶液特別是在超聲波的輔助作用下預(yù)處理后的物料中纖維素都明顯得到潤(rùn)脹,對(duì)水的可及度增加。纖維素的潤(rùn)脹對(duì)提高芒草的酶解效率起著重要的作用。

    圖2 不同預(yù)處理方式的纖維素的紅外光譜圖Figure 2 FTIR spect ra of as-r eceived untr eated sampl e

    2.1.3 SEM分析

    進(jìn)一步利用SEM技術(shù)從宏觀角度對(duì)預(yù)處理前后的芒草纖維素的形貌進(jìn)行分析,結(jié)果如圖3所示。未處理的芒草表面結(jié)構(gòu)比較緊密、有序,質(zhì)地也比較堅(jiān)硬(圖3A),纖維素分子表面十分平滑,結(jié)構(gòu)相當(dāng)規(guī)整,可見(jiàn)分子的平行排布形式(圖3a);經(jīng)三氟乙酸溶液預(yù)處理后纖維素結(jié)構(gòu)變得蓬松、柔軟,且具有部分微孔(圖3B),纖維素分子表面凹凸不平,有點(diǎn)狀突起并夾雜有小孔洞,纖維素表面蠟質(zhì)及硅晶體受到破壞(圖3b);在超聲波輔助作用下纖維素顆粒變得細(xì)小(圖3C),芒草纖維束發(fā)生斷裂,纖維素晶體受到破損(圖3c)。因此纖維素經(jīng)過(guò)預(yù)處理后,特別是經(jīng)過(guò)聯(lián)合預(yù)處理之后,纖維素晶體結(jié)構(gòu)破損,纖維素表面積增加,提高了芒草纖維素與纖維素酶的可及度,從而提高纖維素的酶解效率。

    圖3 不同預(yù)處理方式的纖維素的SEM圖Figur e3 Scanning el ect r on micr ogr aphs of sampl e

    2.2 預(yù)處理方式的選擇

    圖4 為采用不同預(yù)處理方式處理2h后在1.3的酶解條件下(下同)對(duì)試樣進(jìn)行酶解后的效果。從A和B及C和D比較可以看出,在超聲波的輔助作用下預(yù)處理試樣的酶解效果明顯好于未使用的,說(shuō)明超聲波預(yù)處理有利于加快芒草的酶水解,主要原因是超聲波具有空化作用,能夠破壞纖維素的晶體結(jié)構(gòu),增加試樣的酶解可及率,提高其酶解糖化率。

    經(jīng)過(guò)以上分析,超聲波能提高纖維素酸處理效果,后面的研究擬在采用超聲波的輔助作用下,用三氟乙酸預(yù)處理芒草,考察不同的預(yù)處理?xiàng)l件對(duì)纖維素酶水解效果的影響。

    圖4 不同預(yù)處理方式的酶解效果Fig4 Enzymatic hydrolysis efficiency of different pretreated silvergrass

    2.3 三氟乙酸濃度對(duì)預(yù)處理效果的影響

    在預(yù)處理溫度為30℃,時(shí)間為4h,固液比為1∶30情況下,以不同的三氟乙酸濃度處理芒草樣品,然后進(jìn)行酶解,其結(jié)果如圖5所示。從圖中可以看出,在酸處理后濾液中,糖含量隨著酸濃度的提高而升高,這與文獻(xiàn)報(bào)道相一致[13]。但對(duì)酸處理試樣進(jìn)行酶解時(shí),其酶解糖化率隨著酸濃度升高而升高,當(dāng)酸濃度進(jìn)一步升高時(shí),其酶解糖化率明顯降低。這是因?yàn)樗釢舛仍礁?,預(yù)處理濾液中糖含量升高,消耗纖維素和半纖維素的量增大,預(yù)處理后試樣中可供酶解的纖維素和半纖維素的含量相對(duì)降低,其酶解得率相應(yīng)也會(huì)降低。同時(shí),隨著酸濃度的升高,生成酶解抑制物如糠醛的含量也會(huì)升高,不利于后續(xù)酶解的反應(yīng)[13-14]。因此,在預(yù)處理過(guò)程中,以40%的酸濃度比較合適,其處理后試樣酶解糖化率達(dá)到64.6%以上。

    圖5 三氟乙酸濃度對(duì)預(yù)處理效果的影響Fig5 Effect of trifluoroacetic acid concentration on the pretreatment ef f ect iveness

    2.4 固液比對(duì)預(yù)處理效果的影響

    在預(yù)處理酸濃度為40%,溫度為30℃,時(shí)間為4h情況下,以不同的固液比處理芒草然后對(duì)其進(jìn)行酶解,其結(jié)果如圖6所示。從圖6可以看出,隨著固液比增加,其預(yù)處理糖化率和酶解糖化率隨著固液比的升高而升高,預(yù)處理糖化率隨固液比提高而增加不明顯,而酶解糖化率隨著固液比的升高而提高,當(dāng)固液比達(dá)到1∶30時(shí),其增加不明顯,故預(yù)處理時(shí)選擇固液比為1∶30。

    圖6 固液比對(duì)預(yù)處理效果的影響Fig6 Effect of ratio of solid-liquid on the pretreatment effectiveness

    2.5 預(yù)處理時(shí)間對(duì)預(yù)處理效果的影響

    在預(yù)處理酸濃度為40%,固液比為1∶30,溫度為30℃的情況下,采用不同的處理時(shí)間處理芒草樣品,酶解,其結(jié)果如圖7所示。從圖7可以看出,隨著預(yù)處理時(shí)間的增加,預(yù)處理糖化率變化不明顯,而預(yù)處理試樣酶解糖化率在預(yù)處理時(shí)間達(dá)到3h以上時(shí),變化不明顯,故選擇預(yù)處理時(shí)間為3h。

    圖7 預(yù)處理時(shí)間對(duì)預(yù)處理效果的影響Fig7 Ef f ect of time on t he pr et r eat ment ef f ect iveness

    2.6 預(yù)處理溫度對(duì)預(yù)處理效果的影響

    在預(yù)處理酸濃度為40%,固液比為1∶30,時(shí)間為3h,以不同的溫度處理芒草樣品,酶解,其結(jié)果如圖8所示。從圖8中可以看出,隨著預(yù)處理溫度的升高,預(yù)處理糖化率有所增加,但變化不明顯,而試樣酶解糖化率則明顯降低。當(dāng)預(yù)處理溫度升高時(shí),半纖維素水解所產(chǎn)生的木糖在高溫下會(huì)進(jìn)一步降解為糠醛,糠醛對(duì)酶解具有明顯的抑制作用[15];同時(shí),在高溫下三氟乙酸與葡萄糖發(fā)生酯化反應(yīng),所產(chǎn)生的副產(chǎn)物也會(huì)對(duì)酶解產(chǎn)生一定的抑制作用。根據(jù)紅外譜圖和預(yù)處理試樣酶解效果分析,在低溫下進(jìn)行預(yù)處理對(duì)試樣酶解效果有利,由于超聲波在空化過(guò)程中具有加熱作用,很難維持低溫,故選擇預(yù)處理溫度為30℃。

    圖8 溫度對(duì)預(yù)處理效果的影響Fig8 Effect of temperature on the pretreatment effectiveness

    3 結(jié)論

    三氟乙酸/超聲波預(yù)處理芒草能夠有效破壞纖維素的晶形結(jié)構(gòu),增加纖維素酶與底物的酶解可及度,促進(jìn)了芒草秸桿的酶解糖化率。在40%三氟乙酸溶液、30℃、固液比為1∶30及超聲波的輔助作用下預(yù)處理4h的芒草秸桿,在pH為4.6、加酶量22mg·g-1、45℃下酶解72h,其酶解糖化率可達(dá)64.6%。

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