丙酮提取菠蘿皮抑菌物的條件研究

譚雯文，劉亭君

（1.廣西工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530001；2.桂林理工大學(xué)化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西礦冶與環(huán)境科學(xué)實驗中心，廣西 桂林 541004）

菠蘿又名鳳梨，主要分布在我國廣西、云南、廣東、海南、臺灣等地區(qū)，是我國南方栽培面積最大，產(chǎn)量較多的大宗水果之一，華南地區(qū)年產(chǎn)量超過110萬t[1]。目前國內(nèi)菠蘿的加工產(chǎn)品主要是糖水菠蘿罐頭、菠蘿果汁，但在加工過程中幾乎有50%～60%的下腳料——菠蘿皮渣被隨意丟棄[2]，不僅浪費了大量的資源，又嚴(yán)重影響加工區(qū)的生態(tài)環(huán)境。據(jù)報道[3-4]，菠蘿皮渣中含有的營養(yǎng)成分與果肉相接近，如何綜合高效地利用廢棄的菠蘿皮，使其變廢為寶，國內(nèi)外已有很多有益的嘗試，但主要集中在作為發(fā)酵原料生產(chǎn)飲料、果酒，而有關(guān)菠蘿皮抑菌作用的研究，目前國內(nèi)尚未見公開報道。

尋找安全有效的天然防腐保鮮劑是目前國內(nèi)外研究的熱點。本實驗以對4種常見的食品污染菌的抑菌圈為優(yōu)化指標(biāo)，以丙酮為溶劑對菠蘿皮進(jìn)行提取，采用正交法確定菠蘿皮有效抑菌成分的提取條件，并研究該條件下提取液的最小抑菌濃度（MIC）,為開辟菠蘿皮新用途提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菠蘿皮：將新鮮的菠蘿皮切片，于60℃恒溫干燥箱烘24h，粉碎后裝入密封袋室溫保存。

供試菌種：細(xì)菌：大腸桿菌(Escherichia col i)、金黃色葡萄球菌(Staphyl ococcus aureus)；霉菌：黑曲霉（Aspergill us niger）、桔青霉（Penicil lium citrinum）。以上菌種均由桂林理工大學(xué)生物工程實驗室保藏。

培養(yǎng)基：大腸桿菌采用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，金黃色葡萄球菌采用營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，霉菌采用馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基[5]。

HWS-24電熱恒溫水浴鍋，LSH-150-2振蕩培養(yǎng)箱，SWCJ-IF超凈操作臺，RE-2000A真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，TDZZ5-WS臺式低速自動平衡離心機(jī)，SHZD(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵，DFY-800高速粉碎機(jī)。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌種活化及菌懸液的制備

將4種供試菌種接入相應(yīng)的搖瓶培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，細(xì)菌活化18h，霉菌活化40h，然后再將活化后的菌種轉(zhuǎn)接到相對應(yīng)的斜面培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。用接種環(huán)分別刮取一定量已活化好的菌種于9mL無菌生理鹽水中，充分搖勻，再用10倍稀釋法將菌懸液稀釋至含菌量為107CFU·mL-1的實驗用菌懸液[6]。

1.2.2 菠蘿皮提取物的制備及工藝條件研究

由于影響菠蘿皮有效抑菌成分提取的因素很多，經(jīng)反復(fù)小試，決定對料液比、丙酮濃度、提取時間、提取溫度4個主要因素，3個水平進(jìn)行正交試驗，方案見表1[7]。

表1 正交因素水平表

表2 菠蘿皮提取液試驗設(shè)計方案

具體操作如下：稱取粉碎后的菠蘿皮10g，按規(guī)定的料液比加入相應(yīng)濃度的丙酮溶液于具塞三角瓶中，在恒溫水浴鍋中震蕩浸提至規(guī)定時間，然后3000r·min-1離心5min，用紗布過濾，取清液用真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮至膏狀，再用蒸餾水溶解定容至10mL，其濃度為 1000mg·mL-1（指 1mL提取液相當(dāng)于1000mg菠蘿皮干樣品），最后置于4℃冰箱中保存待用。

1.2.3 提取物抑菌活性的測定

將15mL經(jīng)高壓滅菌的培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，靜置冷卻，待凝后加入0.1mL菌懸液于平板上，用無菌玻璃涂布棒將菌液涂布均勻，制成帶菌平板[8]。然后用無菌打孔器打出直徑為6mm的孔，在每個孔加入80 μL菠蘿皮丙酮提取液，以無菌水做空白對照，平行3次。細(xì)菌于36℃恒溫培養(yǎng)24h，霉菌于27℃培養(yǎng)48h。觀察菌落生長情況，采用十字交叉法測量抑菌圈直徑。

1.2.4 最低抑菌濃度（MIC）的測定

按1.2.3的試驗結(jié)果，將在最佳提取工藝條件下提取的丙酮菠蘿皮提取物配制成600、400、300、250、200、150、100、 80、 60、40mg·mL-1等系列濃度，參照抑菌活性實驗步驟，以未加提取物的培養(yǎng)基為對照培養(yǎng)各測試平板至相應(yīng)培養(yǎng)時間，觀察各菌體生長情況，比較提取物不同濃度溶液的抑菌效果, 每個濃度做3個平行。以培養(yǎng)基打孔周圍無菌生長的最低提取濃度為該提取物的最低抑菌濃度（MIC）[9-10]。

2 結(jié)果與分析

2.1 正交提取過程因素的變化對提取物抑菌效果的影響

表3是提取工藝條件的正交實驗結(jié)果。從表3中可以看出，菠蘿皮丙酮提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和黑曲霉都有抑菌作用，其中對大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng)，最大抑菌直徑達(dá)(28.40±0.31)mm，抑菌效果為大腸桿菌＞黑曲霉＞金黃色葡萄球菌；而提取物對桔青霉無抑菌效果。

表3 提取工藝條件正交試驗結(jié)果

2. 2 正交試驗結(jié)果的極差分析

表4～6分別為正交試驗對大腸桿菌、黑曲霉、金黃色葡萄球菌的極差分析表。從表4、5、6中數(shù)據(jù)可知，菠蘿皮丙酮提取物對大腸桿菌和黑曲霉的抑菌效果最佳的提取工藝條件均為料液比1∶30，丙酮濃度75 %，提取時間40 min，提取溫度70℃。各因素對大腸桿菌抑制能力的影響順序為：丙酮濃度＞料液比＞提取時間＞提取溫度。對黑曲霉抑制能力的影響順序為：料液比＞丙酮濃度＞提取溫度＞提取時間。其中丙酮濃度對結(jié)果的影響比較顯著。而抑菌物對金黃色葡萄球菌最佳的提取工藝條件為：料液比1∶10，丙酮濃度65 %，提取時間40 min，提取溫度50℃。各因素對金黃色葡萄球菌抑制能力的影響大小順序為：丙酮濃度＞提取時間＞提取溫度＞料液比。

表4 正交試驗對大腸桿菌的極差分析表

表5 正交試驗對黑曲霉的極差分析表

表6 正交試驗對金黃色葡萄球菌的極差分析表

注：Ki代表各因素i水平下抑菌圈平均值

2.3 最低抑菌濃度（MIC）的測定結(jié)果

表7是菠蘿皮提取物最小抑菌濃度的測定結(jié)果。從表7可知，在各自最佳提取工藝條件下，丙酮菠蘿皮提取物對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉的最低抑菌濃度（MIC）分別為 60、250、100mg·mL-1。

表7 菠蘿皮提取物最小抑菌濃度的測定

3 結(jié)果與討論

1) 試驗證明了菠蘿果皮中含有抑菌物質(zhì)，以丙酮為溶劑提取，提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉等常見的食品污染菌具有較強(qiáng)的抑制作用，對桔青霉則無。同一條件下，提取液對大腸桿菌的抑制效果最強(qiáng)。

2) 通過正交試驗優(yōu)化丙酮的提取條件，對大腸桿菌和黑曲霉的抑菌效果最佳的提取工藝條件均為：料液比1∶30，丙酮濃度75%，提取時間40 min，提取溫度70℃。對金黃色葡萄球菌最佳的提取工藝條件為：料液比1∶10，丙酮濃度65%，提取時間40 min，提取溫度50℃。

3) 在優(yōu)化條件下，菠蘿皮丙酮提取物對大腸桿菌、黑曲霉、金黃色葡萄球菌的MIC分別為60、100、250mg·mL-1。

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