蛋白芯片聯(lián)合檢測(cè)病原體抗體在急性呼吸道感染中診斷價(jià)值的探討

陳文旭 王華妮 郭小艷 江 裕 陳溶微

福建省福州市第二醫(yī)院檢驗(yàn)科 350007

急性呼吸道感染（ARI）是兒童常見病與多發(fā)病之一，據(jù)統(tǒng)計(jì)，導(dǎo)致全球?qū)W齡前兒童死亡的疾病中部分是由ARI引起［1］。ARI可由多種病原體感染引起，危害兒童身體健康，目前急性呼吸道感染，隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，呼吸道病毒和肺炎支原體感染呈上升趨勢(shì)并成為重要致病原，許多病毒感染強(qiáng)、傳染快、發(fā)病急、無免疫記憶、多次發(fā)病、發(fā)病率高，容易在兒童中流行［2～4］，呼吸道細(xì)菌感染的發(fā)生率有所降低，而呼吸道病毒感染則呈上升趨勢(shì)，因此快速檢測(cè)出病原體對(duì)于輔助臨床診斷和治療就顯得尤其關(guān)鍵。近年來臨床診斷急性呼吸感染疾病無足夠的臨床取樣和病原體檢測(cè)，ARI病原體感染傳統(tǒng)檢測(cè)方法有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)法、免疫熒光法、病毒培養(yǎng)、肺炎支原體培養(yǎng)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法，這些方法的共同特點(diǎn)是操作繁瑣，檢測(cè)出報(bào)告時(shí)間長，達(dá)不到臨床迫切需要的多種病原體快速、準(zhǔn)確、聯(lián)合檢測(cè)并報(bào)告的要求，客觀上造成非細(xì)菌性感染抗菌素濫用現(xiàn)象日益嚴(yán)重，傳統(tǒng)檢測(cè)方法還存在檢測(cè)費(fèi)用高，標(biāo)本檢測(cè)通量受限，且每次只能檢測(cè)一種病原體等。蛋白芯片是近年來發(fā)展起來的新技術(shù)，是對(duì)功能基因蛋白產(chǎn)物表達(dá)水平的檢測(cè)，芯片以硝酸纖維素微孔濾膜為載體，同時(shí)點(diǎn)布高純度的待測(cè)病原體高純度的抗原，利用微孔濾膜的滲濾、濃縮、凝聚作用，使抗原抗體反應(yīng)快速在固相的濾膜上完成，反應(yīng)結(jié)果強(qiáng)弱以熒光信號(hào)強(qiáng)弱來表示，結(jié)果是通過蛋白芯片專用閱讀器判讀，定量由閱讀器攜帶的專業(yè)軟件進(jìn)行分析，它結(jié)合了免疫滲濾技術(shù)與微陣列技術(shù)，可高效、聯(lián)合檢測(cè)多種病原體，是多種病原體抗體聯(lián)合檢測(cè)的一種創(chuàng)新。本文通過收集474份ARI臨床資料，采用蛋白芯片技術(shù)聯(lián)合檢測(cè)同一標(biāo)本的4種病原體，總結(jié)分析如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究通過選取2011年2月－2013年1月，我院兒科門診和住院診斷急性呼吸道感染的474例患兒，男244例，女230例。其中第一組年齡小于1歲144例（30.4%），第二組年齡1～3歲166例（35.0%），第三組年齡3～6歲99例（20.9%），第四組年齡大于6歲65例（13.7%）。年齡最小的8個(gè)月，最大的13周歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)參照第7版《諸福棠實(shí)用兒科學(xué)》［5］。

1.2 方法 選用西安聯(lián)爾科技有限公司蛋白芯片分析儀，靜脈抽血3ml，常溫凝固后分離血清待用，蛋白芯片微孔濾膜窗口內(nèi)滴加試劑A 6滴，靜置一段時(shí)間使膜表面浸濕，待A完全滲入后，加入待檢測(cè)標(biāo)本的血清100μl，待血清完全滲入后，靜置10s，加入6滴試劑B清洗，待試劑B完全滲入后再滴加試劑C 6滴顯色，再加入試劑D 6滴清洗。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 各年齡組感染的不同病原體之間的差異進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各年齡組間病原體感染病陽性率的差異進(jìn)行χ2檢驗(yàn)，檢測(cè)以P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，各年齡組間季節(jié)分布也以χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)分析采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)處理在SPSS10.0軟件上進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 檢出的病原體 474份血清標(biāo)本中FLU感染392例，陽性率最高為82.7%，其次是 MP 375例，陽性率為79.1%，RSV 162例，陽性率為34.2%，ADV 41例，陽性率是8.6%?；旌细腥疽?MP＋FLU常見，有283例，陽性率是59.7%，其次是MP＋FLU＋RSV 79例，陽性率16.7%，F(xiàn)LU＋RSV只有11例，占2.3%。

2.2 各年齡組病原體分布 4種病原體IgM抗體中MP、ADV、RSV、FLU在各年齡組間分布的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），總檢出陽性率各年齡組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 不同年齡組ARI患兒病原體檢出率〔n（%）〕

2.3 各年齡組病原體感染例數(shù)季節(jié)分布 各年齡組ARI 1～3月分布最多，分別占39.6%、30.1%、30.3%、29.2%，其次多發(fā)生在4～6月，7～9月發(fā)病最少，但是季節(jié)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

表2 各年齡組ARI季節(jié)分布〔n（%）〕

2.4 在單純病原體感染的部分標(biāo)本同時(shí)檢測(cè)了CRP和ALT兩個(gè)生化指標(biāo)，升高的百分率作比較，發(fā)現(xiàn)MP與RSV比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），MP與FLU比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），RSV與FLU比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 單純MP、RSV、FLU感染其他實(shí)驗(yàn)室診斷指標(biāo)比較〔n（%）〕

3 討論

ARI是導(dǎo)致兒童尤其是發(fā)展中國家兒童高致病率和高死亡率的主要疾病之一［6］。ARI按部位可分為急性上呼吸道感染（Acute upper resperate infection，AURI）和急性下呼吸道感染（Acute lower resperate infection，ALRI），它是一組包括肺炎、流行性感冒和呼吸道合胞病毒感染等的臨床疾?。?］。人群中感染的常見病原體主要是細(xì)菌感染（鏈球菌最常見），非典型細(xì)菌（如MP）和病毒感染也占據(jù)很大的比例［8～10］。近年來由于病毒學(xué)和各種檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展，病毒性肺炎和非典型肺炎發(fā)病有增多趨勢(shì)并成為臨床危急重癥，并且由此所致的混合感染也日益增加。其中，臨床常見的病毒有RSV、FLU（包括A和B兩種亞型）、CoV（人類冠狀病毒）、HRV（人類鼻病毒）、HAdV（人類腺病毒）等［11，12］。本文通過收集474例臨床診斷為ARI的患兒標(biāo)本進(jìn)行病原體包括常見病毒如ADV、RSV、FLU以及非典型MP檢測(cè)。結(jié)果顯示總體陽性率幾近達(dá)到百分之百（99.2%），其中單獨(dú)感染FLU陽性率為82.7%，MP陽性率為79.1%，RSV陽性率為34.2%，ADV陽性率為8.6%；混合感染中MP＋FLU陽性率為59.7%，MP＋FLU＋RSV陽性率為16.7%，F(xiàn)LU＋RSV陽性率為2.3%。此組數(shù)據(jù)基本都高于以往的報(bào)告［13，14］，可能與此次收集的病例數(shù)量有關(guān)系，同時(shí)說明病毒感染在ARI中非常普遍，混合感染也較常見，其中又以流感病毒和支原體混合感染較常見。此病原學(xué)檢測(cè)結(jié)果也有助于指導(dǎo)兒科臨床醫(yī)師用藥，減少抗生素濫用現(xiàn)象。

蛋白芯片因操作簡便，測(cè)試時(shí)間短，可以隨到隨檢，可聯(lián)合檢測(cè)多種ARI病原體［13］，因此已廣泛應(yīng)用于臨床輔助ARI病原體檢測(cè)。ARI臨床多見于嬰幼兒，尤其是5歲以下的嬰幼兒，因其呼吸系統(tǒng)發(fā)育尚未完善，系統(tǒng)清理外來病原的能力較弱，加上本身免疫功能仍未成熟等，導(dǎo)致這一人群感染各種病原體的機(jī)會(huì)更大。本報(bào)告應(yīng)用蛋白芯片法檢測(cè)4種常見病原體，各年齡段的病原體檢出率均較高（分別為86.8%，94.0%，97.0%，96.9%），既可說明蛋白芯片法的高敏感性，也說明嬰幼兒易于感染各種病原體的生理特征。在呼吸道感染病原體檢測(cè)標(biāo)本類型的選擇方面，考慮到嬰幼兒的特殊生理，如果采用一般的細(xì)菌培養(yǎng)，不僅難以收集到檢測(cè)樣本（咽試子或痰），而且存在病原體含量少、呼吸道雜菌污染多、培養(yǎng)周期長等問題，因此常規(guī)的培養(yǎng)方法很受限制，在這方面，蛋白芯片所要求的靜脈血液標(biāo)本還是相對(duì)容易獲得的，其檢測(cè)周期短也是臨床應(yīng)用的優(yōu)勢(shì)。

ARI是兒科常見病，其病原體日趨多樣性，并與嬰幼兒年齡發(fā)病與季節(jié)有一定相關(guān)性。本報(bào)告統(tǒng)計(jì)分析，4種病原體IgM抗體在各年齡組間分布有顯著性差異（P＜0.05），總檢出陽性率各年齡組間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），其中1歲以下嬰幼兒以MP感染最常見，1～3歲則以MP和FLU混合感染常見，3～6歲MP和FLU混合感染常見，RSV感染也較常見（45.5%），6歲以上則與3～6歲兒童感染分布類似，其中RSV感染比例稍低，約占38.4%。總體陽性率以6歲以下兒童偏高，本報(bào)告6歲以上兒童也偏高（96.9%），估計(jì)與本次收集病例過少有關(guān)。各年齡組ARI 1～3月分布最多，其次多發(fā)生在4～6月，7～9月發(fā)病最少，但是季節(jié)間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

綜上所述，蛋白芯片聯(lián)合檢測(cè)ARI病原體敏感性高、隨到隨檢、檢測(cè)周期短，在臨床輔助診斷ARI方面具有極大的應(yīng)用價(jià)值，值得在臨床推廣應(yīng)用。

臨床采用抗生素聯(lián)合抗病毒經(jīng)驗(yàn)性的治療常常達(dá)不到療效［15］，實(shí)際上非細(xì)菌性的ARI更為常見，本文就選擇非細(xì)菌性ARI展開病原體研究。

肺炎支原體分離培養(yǎng)，是診斷MP感染的標(biāo)準(zhǔn)方法，咽試子和痰存在雜菌多污染的問題，盡管病原體含量比血液標(biāo)本高，但靈敏度不高而且耗時(shí)長、技術(shù)要求高不能滿足臨床快速診斷的要求。MP－IgM是機(jī)體出現(xiàn)的最早的肺炎支原體抗體感染后1周就可檢出，可持續(xù)12～16周與MP分離培養(yǎng)方法比較，MP－IgM抗體效價(jià)≥1∶160時(shí)對(duì)MP急性感染有診斷價(jià)值［16］。

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