煙草重要基因篇：3.煙草煙堿合成代謝相關基因

張洪博

（西南大學農(nóng)學與生物科技學院，重慶 400715）

煙堿（nicotine），即尼古丁，是煙草生物堿（包括煙堿、降煙堿、新煙草堿和假木賊堿等）的一種，約占煙草生物堿總含量的90%～95%[1]。煙葉煙堿含量占葉片干重的0.6%～3.0%，是煙草和卷煙質量的一項重要指標。對煙堿代謝的分子遺傳學研究可以揭示煙堿代謝累積的分子機制，并為煙堿含量及煙堿成分調節(jié)相關的育種工作提供理論基礎。近年來，有關煙堿合成、轉運及轉化的一些重要基因已被陸續(xù)克隆，對煙堿合成代謝機理研究和煙草遺傳育種工作產(chǎn)生了重要推動作用。

1 煙堿合成相關基因

煙堿分子由一個吡咯烷環(huán)和一個吡啶環(huán)構成，在煙草根部合成，通過木質部向地上部運輸，在煙草植株的葉片中含量最高，莖部含量最低[2-3]。

煙堿吡咯烷環(huán)由氮代謝中形成的腐胺合成。腐胺可通過精氨酸脫羧酶（ADC，arginine decarboxylase）催化精氨酸脫羧形成，或由鳥氨酸脫羧酶（ODC，ornithine decarboxylase）催化鳥氨酸脫羧形成[4-6]。腐胺在腐胺 N-甲基轉移酶（PMT，putrescine-N-methyltransferase）作用下獲得由 S-腺苷蛋氨酸（SAM，S-adenosyl-L-methionine）提供的甲基形成 N-甲基腐胺[7-9]，這是一個依賴S-腺苷蛋氨酸合成酶（SAMS，S-adenosylmethionine synthase）活性的反應。N-甲基腐胺在N-甲基腐胺氧化酶（MPO，N-methylputrescine oxidase）催化下形成4-甲氨基丁醚[10]，并通過自身環(huán)化形成N-甲基-△1-吡咯啉陽離子，隨后與提供吡啶環(huán)部分的煙酸衍生物發(fā)生縮合反應形成煙堿[11]。

煙堿吡啶環(huán)部分由煙酸提供，其前體是由天冬氨酸合成的喹啉酸[12]。喹啉酸在喹啉酸磷酸核糖轉移酶（QPRT，quinolinate phosphoribosyltransferase）催化下形成煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD），然后經(jīng)由吡啶核苷酸循環(huán)途徑生成煙酸[7,13]。

近期有關煙堿吡咯烷環(huán)部分和吡啶環(huán)部分縮合反應的研究表明，NADPH依賴性還原酶的PIP 家族（包括松脂醇還原酶、異黃酮還原酶和苯基香豆?jié)M芐基醚還原酶）成員類異黃酮還原酶基因A622及其同源基因參與了這一過程[14-15]，小檗堿橋接酶（Berberine bridge enzyme）家族成員BBL基因也參與了這一反應[16]。

2 煙堿轉運相關基因

煙堿在煙草根尖細胞合成后[2,17]，經(jīng)木質部運輸?shù)綗熑~的葉肉細胞并儲存于液泡內，推測應有大量蛋白參與了煙堿的轉運過程。近期研究已從煙草中分離鑒定了若干煙堿轉運蛋白基因，主要有定位于液泡膜的煙堿轉運蛋白基因及定位于質膜的煙堿轉運蛋白基因。

目前發(fā)現(xiàn)的定位于液泡膜的煙堿轉運蛋白基因主要是多藥與毒性化合物外排家族（MATE，multidrug and toxic compound extrusion）基因。MATE是一類新型二級轉運蛋白基因家族，在植物中有多個成員[18]。2009年，Morita等從煙草中分離到一個MATE家族的轉運蛋白基因，該基因受茉莉酸誘導表達，被命名為茉莉酸誘導煙堿轉運蛋白基因JAT1[19]。JAT1蛋白定位于煙草葉片細胞的液泡膜上，可以轉運煙堿及假木賊堿[19]。同時，另外兩個煙堿轉運蛋白基因 MATE1 和MATE2也在煙草中得到分離，MATE1和MATE2蛋白也定位于煙草葉片細胞的液泡膜上[20]。

最近分離鑒定的煙草尼古丁吸收透性酶（NUP1，nicotine uptake permease 1）基因編碼另一類具有煙堿轉運功能的蛋白，與定位于液泡膜上的MATE蛋白不同，NUP1蛋白定位于質膜上，負責將胞質外體的煙堿轉運到胞質內[21]。此外，NUP1與MATE蛋白的煙堿轉運功能也有差別[21]。

3 煙堿轉化相關基因

煙堿是煙草特有亞硝胺NNK[4-(N-甲基亞硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮]和NNN（N'–亞硝基降煙堿）的前體[22]。煙草中煙堿向降煙堿的轉化由細胞色素P450基因家族中CYP82E亞族成員編碼的煙堿-N-去甲基化酶（NND，nicotine N-demethylase）催化[23]。降煙堿是一種有害物質，是致癌物N'–亞硝基降煙堿（NNN）的主要前體[24-25]。目前已有多個催化煙堿向降煙堿轉化的基因得到分離和鑒定，如：CYP82E5v2[23]、CYP82E2[26]、CYP82E10[27]和CYP82E4[28]等。在這些煙堿-N-去甲基化酶基因中，CYP82E5v2在綠色葉片中表達量較高，CYP82E4則主要在衰老葉片中表達[23]。近期還發(fā)現(xiàn)一個亞甲基四氫葉酸還原酶 MTHFR1（Methylenetetrahydrofolate reductase 1）可以通過調控CYP82E4基因的表達水平而影響煙堿向降煙堿的轉化[29]。

4 煙堿代謝相關調控基因

煙堿合成受到多種因子調控，已知參與煙堿代謝調控的植物激素主要有茉莉酸、生長素及乙烯，其中生長素和乙烯是煙堿合成的負調控因子[4,30-33]。近期的煙堿代謝調控研究主要集中于茉莉酸信號途徑調控因子。茉莉酸（JA，jasmonate）是重要的植物次生代謝調節(jié)因子，煙草中大部分煙堿合成功能基因都受到茉莉素信號途徑調控[4,30,32,34-36]。

茉莉酸受體是由COI1、負調控因子JAZ（Jasmonate ZIM-Domain）蛋白和肌醇戊基磷酸分子組成的復合體[37-38]。有茉莉酸存在時，茉莉酸衍生物JA-Ile與茉莉酸受體相結合導致負調控因子JAZ蛋白的泛素化降解，從而釋放下游轉錄激活因子并激活植物的茉莉酸應答[39]。煙草的茉莉酸途徑調控因子COI1和JAZ蛋白都已被證明是煙堿合成調控因子[35]。近期研究還鑒定了一些調控煙堿合成的轉錄因子，如 ERF轉錄因子家族成員JAP1、ERF32及ORC1的同源基因等[40-41]，bHLH轉錄因子家族成員bHLH1/2和MYC2等[42-43]，這些ERF轉錄因子和bHLH轉錄因子還可以通過彼此間的相互調控影響煙堿代謝過程[44-45]。

前期對煙堿合成基因PMT啟動子中一段由G-box，AT-rich和GCC-box-like元件構成的茉莉酸應答片段的研究證明這三個元件都是茉莉酸應答的必需元件[32]，已鑒定的ERF和bHLH煙堿合成調控因子可結合其中的G-box和GCC-box-like元件[41,43]，但AT-rich元件的結合蛋白還未發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)有研究也無法解釋PMT基因的茉莉酸應答機理。因此，煙堿合成代謝相關調控因子基因的分離和鑒定仍是一個重要研究方向。

5 問題與展望

雖然煙草的煙堿代謝途徑已基本清楚，且大部分代謝步驟都有一些功能基因得到分離鑒定，但是這些功能基因在煙草中的同源基因遠未得到完全發(fā)掘，特別是普通煙草為多倍體植物，每個基因都有大約5個同源基因，因此，煙堿代謝功能基因的研究還有大量工作需要開展。近來，煙堿代謝功能基因的調控機理研究已經(jīng)成為煙堿代謝調控研究的熱點問題，分離和鑒定煙堿代謝功能基因的調控因子將是未來一段時期的主要研究內容。

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