醬油釀造中蛋白酶系的研究進(jìn)展

張金蘭，王文平，王夫杰，張建，趙燕，*

（1.中國肉類食品綜合研究中心，北京100068；2.北京食品科學(xué)研究院，北京100050；3.北京市食品釀造研究所，北京100050）

醬油釀造中蛋白酶系的研究進(jìn)展

張金蘭1，3，王文平2，王夫杰3，張建3，趙燕2，3*

（1.中國肉類食品綜合研究中心，北京100068；2.北京食品科學(xué)研究院，北京100050；3.北京市食品釀造研究所，北京100050）

蛋白酶是醬油釀造中最重要的酶，對(duì)醬油產(chǎn)品品質(zhì)和生產(chǎn)成本起著決定性的作用。文中分別從醬油釀造中蛋白酶的分類特性、高蛋白酶活力菌株的選育、影響蛋白酶活的因素幾個(gè)方面對(duì)研究報(bào)道進(jìn)行了綜述。對(duì)醬油釀造中純化出的蛋白酶、菌株選育的方法、釀造各階段影響蛋白酶活的因素進(jìn)行了詳細(xì)的介紹，并對(duì)醬油釀造中蛋白酶系的研究前景進(jìn)行了預(yù)測。

醬油；蛋白酶系；蛋白酶活力

醬油釀造中的微生物以曲霉為主，兼有酵母菌和細(xì)菌。蛋白酶作為曲霉所產(chǎn)的主要胞外酶之一，在醬油的釀造過程中具有極為重要的作用，它參與原料的降解過程，提高蛋白酶活，可以提高原料利用率，降低企業(yè)成本；且其降解產(chǎn)物多肽和氨基酸等都會(huì)對(duì)醬醪發(fā)酵階段的酵母菌及乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生影響，進(jìn)而影響到醬油的風(fēng)味。本文對(duì)醬油釀造中的蛋白酶系研究現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，以期為醬油原料利用率的提高和生產(chǎn)技術(shù)的進(jìn)步提供借鑒。

醬油生產(chǎn)過程中蛋白質(zhì)的分解過程是蛋白質(zhì)內(nèi)切酶將原料中的蛋白質(zhì)降解為肽，起著蛋白質(zhì)溶解，促進(jìn)原料的利用和著色的作用，這是醬油原料分解的第一步。醬油原料分解的第二步是原料接著在蛋白質(zhì)外切酶（即肽酶）的作用下，將小分子的肽進(jìn)一步水解為氨基酸，對(duì)醬油的風(fēng)味和顏色起著重要的作用；肽酶可分為亮氨酸氨基肽酶等氨基肽酶、酸性羧基肽酶。最后谷氨酰胺在谷氨酰胺酶的作用下，分解為谷氨酸，對(duì)醬油的風(fēng)味起著決定性的作用。

目前對(duì)醬油蛋白酶系的研究集中在蛋白酶的分離純化、誘變菌株提高酶活力等；近年來也有學(xué)者研究其蛋白酶組分、分析組分之間的酶學(xué)性質(zhì)差異、影響酶活的因素等。這些研究對(duì)醬油生產(chǎn)技術(shù)的進(jìn)步，具有重要的理論指導(dǎo)意義。

1 醬油生產(chǎn)中的蛋白質(zhì)內(nèi)切酶的分類及特性

醬油生產(chǎn)中的蛋白質(zhì)內(nèi)切酶目前分離純化出來的可以分為堿性蛋白酶（微生物絲氨酸蛋白酶）、中性蛋白酶（微生物金屬蛋白酶）、酸性蛋白酶（微生物天冬氨酸酶）、半堿性蛋白酶。

在醬油曲抽出液中，堿性蛋白酶的活性是極強(qiáng)的，對(duì)這種酶的研究也最深入。許多堿性蛋白酶已經(jīng)從米曲霉、醬油曲霉等分離出來，然而這些酶在大豆蛋白的水解中真正起的作用并不明確，直到用純化的多種酶對(duì)發(fā)酵系統(tǒng)進(jìn)行了模擬分析[1]。NAKADAI T等[2]從米曲霉460中純化出了一種堿性蛋白酶，其分子質(zhì)量約為23 000 u，該堿性蛋白酶沒有羧基肽酶和氨基肽酶活力，但是能水解異亮氨酸-谷氨酰胺-天冬酰胺-半胱氨酸-脯氨酸-亮氨酸-甘氨酸-氨基（Ile-Gln-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2）中的亮氨酸-甘氨酸（Leu-Gly）肽鍵；聚左旋α-谷氨酸（poly-L-α-glutamic acid）；聚左旋賴氨酸（poly-L-lysine）；芐氧羰基-亮氨酸-甘氨酸-氨基（Cbz-Leu-Gly-NH2）中的甘氨酸-氨基（Gly-NH2）鍵；芐氧羰基-脯氨酸-亮氨酸-氨基（Cbz-Pro-Leu-NH2）中的亮氨酸-氨基（Leu-NH2）鍵。大月秀夫等[3]從米曲霉的麩曲抽出液中分離出最適pH值為8.2～8.4的半堿性蛋白酶結(jié)晶，其相對(duì)分子質(zhì)量大約為32000u，該酶尚未在米曲霉的液體培養(yǎng)液及其他曲霉的麩曲培養(yǎng)液中發(fā)現(xiàn)。

目前，許多研究者從曲霉中分離出了中性蛋白酶，雖然醬油曲霉中分離出的蛋白酶已經(jīng)純化為均一物質(zhì)，但是該酶作用于人工合成肽的機(jī)理還沒有研究。NAKADAI T等[4-5]從米曲霉中分離出兩種中性蛋白酶，最近的研究認(rèn)為中性蛋白酶僅僅將大豆蛋白水解為寡肽和少部分的游離氨基酸，純化的中性蛋白酶Ⅰ沒有氨基端肽酶和羧基端肽酶活性，可以水解芐氧羰基-甘氨酸-苯丙氨酸-氨基（Cbz-Gly-Phe-NH2）的甘氨酸-苯丙氨酸（Gly-Phe）鍵，芐氧羰基-甘氨酸-亮氨酸-氨基（Cbz-Gly-Leu-NH2）的甘氨酸-亮氨酸（Gly-Leu）鍵，芐氧羰基-脯氨酸-亮氨酸-氨基（Cbz-Pro-Leu-NH2）的脯氨酸-亮氨酸（Pro-Leu）鍵，聚左旋α-谷氨酸（poly-L-α-glutamic acid）；聚左旋賴氨酸（poly-L-lysine）。該酶活性被乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）抑制，但不被氟磷酸二異丙酯（diisopropyl fluorophosphates，DFP）抑制。中性蛋白酶Ⅱ?qū)Χ?、三肽和芐氧羰基-甘氨酸-苯丙氨酸-氨基（Cbz-Gly-Phe-NH2）沒有活力，對(duì)多聚賴氨酸和多聚谷氨酸有微弱的活力，其最適pH為5.5～6.0，在90℃加熱10 min后仍保持有70%的活力，在EDTA（10-2mol/L）下?lián)p失70%的活力，在18%的氯化鈉溶液中仍能保持50%的活力。

米曲霉分泌的酸性蛋白酶純化后在pH值為3.5條件下可以激活牛胰蛋白酶原和糜蛋白酶原，而且對(duì)前者的切割位點(diǎn)在牛胰凝乳蛋白酶原的精氨酸（15）-異亮氨酸（16）（Arg（15）-Ile（16））處，它也能水解合成的胃蛋白酶底物芐氧羰基-組氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸乙酯（Cbz-His-Phe-Phe-Oet）和芐氧羰基-丙氨酸-丙氨酸-苯丙氨酸-苯丙氨酸-4-哌嗪丙酯（Cbz-Ala-Ala-Phe-Phe-4-OPy-Pr），切割位點(diǎn)均在苯丙氨酸-苯丙氨酸（Phe-Phe）處[6-7]。米曲霉460分離出的酸性蛋白酶對(duì)酪蛋白的最適pH值為3.7，分子質(zhì)量經(jīng)凝膠層析過濾測定，約39 000 u。酸性蛋白酶沒有酸性羧基肽酶的活力，也沒有氨基肽酶的活力，是一種典型的內(nèi)肽酶，水解蛋白質(zhì)僅釋放少量的游離氨基酸。酸性蛋白酶和酸性羧基肽酶混合作用，可水解蛋白質(zhì)釋放大量游離氨基酸[8]。

2 醬油成曲中蛋白質(zhì)外切酶的分類及特性

肽酶可分為氨基肽酶和羧基肽酶；氨基肽酶是在氨基端水解蛋白質(zhì)和多肽的肽鍵，羧基肽酶是在羧基端水解蛋白質(zhì)和肽的肽鍵；微生物的肽酶在分解外源蛋白質(zhì)獲得必需氨基酸、提供代謝的能量和輔助因子的循環(huán)方面有重要的意義[9]。

NAKADAI T等[10]在對(duì)大豆蛋白質(zhì)分解中，對(duì)于生成全氮、甲醛滴定氮、谷氨酸有關(guān)的這些酶之作用，以正交試驗(yàn)法進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)的分析，結(jié)果查明在醬油釀造中，中性蛋白酶對(duì)甲醛滴定氮、谷氨酸的生成無關(guān)。而肽酶特別是亮氨酸氨基肽酶I所起的作用最大。再者，研究了這些酶的性質(zhì)，特別是對(duì)合成肽的作用，結(jié)果查明肽酶對(duì)許多的低分子肽都顯示出分解活性。在使用不同微生物來源的酶分解大豆蛋白質(zhì)時(shí)，釀造用米曲霉來源的肽酶，無論從量上或從質(zhì)上來說，都較其他微生物的酶優(yōu)越。目前，對(duì)醬油生產(chǎn)中的肽酶的報(bào)道以亮氨酸氨基肽酶和羧基肽酶居多。

NAKADAI T[1]報(bào)道了米曲霉460所產(chǎn)亮氨酸氨基肽酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ的純化及特性研究。以L-亮氨酸-β-萘基胺為底物，純化出的米曲霉460亮氨酸氨基肽酶Ⅰ最適pH值為8.5，酶的分子質(zhì)量約為26 500 u，因其能夠?qū)Ｒ恍缘乃庖粤涟彼釣榘被崮┒说墓央亩撁缚梢员唤饘衮蟿┖投蜴I分離劑所抑制，但不被巰基試劑抑制[10]。以L-亮氨酸-β-萘基胺和左旋亮氨酸-甘氨酸-甘氨酸（L-Leu-Gly-Gly）為底物，亮氨酸氨基肽酶Ⅱ最適pH值為8.0，酶的分子質(zhì)量約為61 000 u，該酶可以被金屬螯合劑和二硫鍵分離劑所抑制，但不被巰基試劑抑制，該酶對(duì)亮氨酸為氨基末端的寡肽具有很強(qiáng)的活性，證明這是一種亮氨酸氨基肽酶[11]；亮氨酸氨基肽酶Ⅲ經(jīng)過溶劑沉淀、陰離子-纖維素柱層析、陰離子-葡聚糖A50柱層析、磺基纖維素柱層析、凝膠過濾層析而得到純化，純化后的酶達(dá)到了電泳純。以左旋亮氨酸-甘氨酸-甘氨酸（L-Leu-Gly-Gly）為底物，該酶的最適pH值為8.0，活性可以被巰基試劑抑制，分子質(zhì)量大約為56 000 u[12]；CHIEN H C R等[13]純化的醬油曲霉（ATCC 42249）的亮氨酸氨基肽酶，最適pH值為9.0，最適反應(yīng)溫度為70℃。

NAKADAI T[14-17]報(bào)道了米曲霉460所產(chǎn)羧基肽酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ的純化及特性研究，以芐氧羰基-丙氨酸-谷氨酸（Cbz-Ala-Glu）為底物，純化的酸性羧基肽酶Ⅰ最適pH值為4.0，該酶可以被巰基試劑抑制，但是不被金屬螯合劑抑制，其分子質(zhì)量約為26 500 u，經(jīng)過有機(jī)溶劑分離、陰離子交換層析、二乙氨乙基-交聯(lián)葡聚糖凝膠層析、陽離子交換層析而得到純化[14]。以芐氧羰基-谷氨酸-酪氨酸（Cbz-Glu-Tyr）為底物，純化的酸性羧基肽酶Ⅱ最適pH值為3.0，該酶可以被異丙硫醚和巰基試劑（如對(duì)氯汞苯甲酸鹽和碘乙酸鹽）抑制，但不被金屬螯合劑抑制，其分子質(zhì)量約為105 000 u[15]。以芐氧羰基-谷氨酸-酪氨酸（Cbz-Glu-Tyr）為底物，純化的酸性羧基肽酶Ⅲ最適pH值為3.0，該酶可以被異丙硫醚和巰基試劑（如對(duì)氯汞苯甲酸鹽和碘乙酸鹽）抑制，但不被金屬螯合劑抑制，其分子質(zhì)量約為61 000 u，可以還水解聚α-L-谷氨酸[16]。以芐氧羰基-谷氨酸-酪氨酸（Cbz-Glu-Tyr）為底物，純化的酸性羧基肽酶Ⅳ最適pH值為3.0，該酶可以被異丙硫醚和巰基試劑抑制，但不被金屬螯合劑抑制，其分子質(zhì)量約為43 000 u，經(jīng)過有機(jī)溶劑分離、陰離子交換層析、二乙氨乙基-交聯(lián)葡聚糖凝膠層析、疏水作用層析、陽離子交換層析和凝膠過濾層析制得[17]。

3 谷氨酰胺酶

谷氨酰胺酶催化L-型谷氨酰胺水解為L-型谷氨酸，谷氨酸是食品中重要的風(fēng)味物質(zhì)。在醬油的發(fā)酵過程中，L-型谷氨酸的產(chǎn)生途徑有兩種：一是蛋白酶或肽酶直接水解原料蛋白質(zhì)獲得；二是谷氨酰胺酶水解原料蛋白質(zhì)中游離出來的谷氨酰胺，其是醬油發(fā)酵過程中促進(jìn)風(fēng)味形成的重要步驟。由于L-型谷氨酸可以轉(zhuǎn)化為沒有風(fēng)味貢獻(xiàn)的焦谷氨酸，這不需要酶的參與，并且以非常快的速度進(jìn)行[18]。在醬油中的谷氨酸的濃度取決于用于發(fā)酵的米曲霉的谷氨酰胺酶的活性[19]和米曲霉細(xì)胞壁上的谷氨酰胺酶的活力[20]，因此，在醬油釀造過程中，L-型谷氨酸被認(rèn)為是谷氨酰胺在谷氨酰胺酶的作用下轉(zhuǎn)化而來的[21]。在醬油發(fā)酵過程中，由于谷氨酰胺酶是增加谷氨酸濃度的關(guān)鍵酶，對(duì)于開發(fā)出谷氨酰胺酶活力高的成曲極為重要。

米曲霉產(chǎn)的許多谷氨酰胺酶已經(jīng)被分離鑒定[22]。MASUO N等[23]最近發(fā)現(xiàn)在米曲霉RIB40的基因組中有四種谷氨酰胺酶的基因（米曲霉谷氨酰胺酶基因A，米曲霉谷氨酰胺酶基因B，米曲霉谷氨酰胺酶基因C，米曲霉谷氨酰胺酶基因D可以被重新分類，這是由于其和隱球酵母（Cryptococcus nodaensis）[24]產(chǎn)生的耐鹽耐熱的谷氨酰胺酶一致。表達(dá)序列標(biāo)簽（expressed sequence tag，EST）分析表明，隱球酵母谷氨酰胺酶基因在固態(tài)培養(yǎng)的條件下表達(dá)。醬油曲霉谷氨酰胺酶基因A源自醬油曲霉，研究人員克隆了它的同源基因，并從過量表達(dá)的菌株中純化出谷氨酰胺酶A的基因，并研究了酶的特性，這使谷氨酰胺酶被分類到谷氨酰胺-天冬氨酸酶類型[25]。因此，許多米曲霉和醬油曲霉中得基因都編碼蛋白質(zhì)，具有谷氨酰胺酶活性，但這些基因是否對(duì)醬油發(fā)酵過程中谷氨酸的形成有貢獻(xiàn)并不清楚。

曲霉的谷氨酰胺酶活性在混合培養(yǎng)基中顯然高于單一培養(yǎng)基。UEKI T等[26]試驗(yàn)了9種米曲霉在單一培養(yǎng)基中的谷氨酰胺酶活性。當(dāng)使用混合接種物的以1∶1接種時(shí)，谷氨酰胺酶的活力通常是翻了一倍。為了制得混合的醬油曲，特殊的微生物不需要被純化。在醬油生產(chǎn)過程中使用混合醬油曲，不僅能改善制曲過程中的生產(chǎn)環(huán)境，還能增加醬油中的谷氨酸含量。

4 高蛋白酶活菌株的選育

菌種蛋白酶活力低會(huì)造成成曲質(zhì)量不良、發(fā)酵周期長、原料利用率低等問題，嚴(yán)重影響企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益和產(chǎn)品品質(zhì)的提高，因此大量科研人員對(duì)醬油生產(chǎn)中高產(chǎn)蛋白酶的菌株進(jìn)行了誘變篩選。

黃偉等[27]從保靖醬醅中分離得到一株米曲霉，采用紫外線篩選出的突變株比原菌株蛋白酶活提高了1.47倍；劉達(dá)玉等[28]將從醬油廠曲池中分離純化的5株米曲霉作為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外誘變后，通過初篩、復(fù)篩和遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)，篩選獲得1株具有蛋白酶活力且遺傳穩(wěn)定的變異菌株。該菌株蛋白酶活力1 245.17 U/g，是同培養(yǎng)條件下的滬釀3.042酶活力的1.21倍。王華等[29]研究了高壓對(duì)米曲霉的誘變，研究發(fā)現(xiàn)，在一定壓力范圍內(nèi)（0.1～200 MPa）蛋白酶的活性隨著壓力的增加而減小，但隨著壓力的進(jìn)一步升高（200～400MPa）蛋白酶的活性又逐漸增強(qiáng)，在300 MPa時(shí)超過對(duì)照組，400 MPa時(shí)蛋白酶的活性達(dá)到最高值，這就為菌種的進(jìn)一步篩選創(chuàng)造了有利條件。NOBUYOSHI I等[30]對(duì)生產(chǎn)菌種曾進(jìn)行過X射線照射誘變，得到蛋白酶活力比原出發(fā)菌株高2倍的x816菌株，SEIICHI N等[31]再次誘變，把x816的蛋白酶活提高到6倍，所得到的變異株與原出發(fā)菌株的酶系統(tǒng)沒有改變。

鄧靖等[32]采用紫外線、硫酸二乙酯以及復(fù)合誘變，結(jié)果表明，經(jīng)紫外線誘變后，米曲霉堿性蛋白酶活力增強(qiáng)較明顯；經(jīng)硫酸二乙酯誘變后，米曲霉中性蛋白酶、酸性蛋白酶活力增強(qiáng)較明顯；經(jīng)硫酸二乙酯-紫外線誘變后，米曲霉中性蛋白酶、堿性蛋白酶、酸性蛋白酶活力都明顯增強(qiáng)。有學(xué)者以米曲霉l-7.3為出發(fā)菌株，通過紫外誘變，采用含有不同制霉素藥物濃度的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養(yǎng)基，初篩得到生長速度快、孢子顏色和菌落形態(tài)發(fā)生變化的菌株125株[33]。通過制曲復(fù)篩進(jìn)一步得到了一株綜合酶系優(yōu)良的目標(biāo)菌株80110，該菌株產(chǎn)生的酸性蛋白酶和中性蛋白酶的酶活力較之1-7.3分別提高了230.10%和17.50%。林劍青等[34]對(duì)米曲霉與醬油曲霉進(jìn)行誘變選育，實(shí)驗(yàn)通過紫外誘變、亞硝基胍誘變以及紫外-亞硝基胍復(fù)合誘變方法分別對(duì)米曲霉和醬油曲霉菌株進(jìn)行了誘變，采用酪蛋白透明法初篩以及福林酚法結(jié)合3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法復(fù)篩，根據(jù)堿性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶酶活水平的變化，選育出2株米曲霉高酶活菌株，3株醬油曲霉高酶活菌株。傅力等[35]通過對(duì)滬釀3.042米曲霉的原生質(zhì)體進(jìn)行紫外線-氯化鋰復(fù)合誘變，篩選出蛋白酶活力高的菌株UF366，其蛋白酶活力達(dá)1 440 U/g，比對(duì)照提高了33.3%。UF366菌株的遺傳穩(wěn)定性好，在pH值為7.2，40℃時(shí)其中性蛋白酶活力最高。

5 影響蛋白酶活的因素

張賀迎等[36]認(rèn)為大量孢子不利于蛋白酶活力的提高，研發(fā)的一種激活劑可以促進(jìn)米曲霉生長，誘導(dǎo)、激活米曲霉分泌各種酶，并抑制孢子生成，提高成曲蛋白酶活力。何青等[37]對(duì)19個(gè)米曲霉菌株的蛋白酶活力與孢子顏色加以比較，認(rèn)為孢子顏色為綠色菌株蛋白酶活力高，平均值為10908U/g干曲，孢子顏色為黃色菌株，蛋白酶活力較低，平均值為1 663 U/g干曲，綠色菌株蛋白酶活力是黃色菌株蛋白酶活力的7倍左右。

沙慧琴等[38]研究了添加微量元素、激活劑、植酸對(duì)米曲霉產(chǎn)蛋白酶活力的影響，結(jié)果表明，當(dāng)采用固體培養(yǎng)基時(shí)，加入微量元素對(duì)米曲霉產(chǎn)蛋白酶產(chǎn)生了抑制作用；試驗(yàn)中3號(hào)激活劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%、1.0%時(shí)，對(duì)米曲霉產(chǎn)生蛋白酶的促進(jìn)作用最為明顯；當(dāng)植酸的加入量為0.18%時(shí)，對(duì)米曲霉產(chǎn)生蛋白酶的作用效果較好。為今后的生產(chǎn)實(shí)踐提供了參考價(jià)值。張賀迎等[39]研究了不同外源酶添加量對(duì)醬油成曲酶活的影響，制曲過程中，米曲霉所產(chǎn)生的酶很難徹底分解原料，添加外源酶能有效地彌補(bǔ)其自身酶系種類與數(shù)量的不足，提高原料利用率，但應(yīng)考慮外源酶分解和阻遏兩種作用，加入原料質(zhì)量0.008%的蛋白酶效果最好，使成曲酶活提高了22%。

從實(shí)際情況來說，最好的醬醪為冬天制得，而夏天制得的醬醪有較少的游離態(tài)氨基酸和谷氨酸，這說明溫度對(duì)醬油生產(chǎn)中的蛋白酶系有較大的影響。SU N W等[40]發(fā)現(xiàn)醬油曲中粗酶的蛋白酶活力在45℃作用240 min，活力僅存70%，在55℃處理240 min，活力僅存17%。NAKAHARA T等[41]研究發(fā)現(xiàn)，亮氨酸氨基肽酶I和亮氨酸氨基肽酶II的活性在45℃很快下降至44%和12%，相反的，在15℃將成曲孵育6 d，亮氨酸氨基肽酶I的活力有所升高，這可能是由于細(xì)胞內(nèi)的氨基肽酶不斷的釋放出來。酸性羧基肽酶在45℃、15℃和30℃孵育6 d，其活力并不受到影響，這說明酸性羧基肽酶對(duì)溫度有良好的穩(wěn)定性。YOKOTSUKA T等[42]發(fā)現(xiàn)較低的溫度可以阻止pH的快速降低并且鈍化堿性蛋白酶，更重要的是，谷氨酰胺酶對(duì)溫度也極為敏感。

陳伯林[43]研究了乙醇對(duì)醬油發(fā)酵體系中蛋白酶系的影響，發(fā)現(xiàn)乙醇對(duì)堿性蛋白酶的穩(wěn)定性影響很大，特別是在發(fā)酵溫度為30℃、pH 5.0、乙醇含量＞2%時(shí)堿性蛋白酶失活加劇；乙醇對(duì)中性蛋白酶活力的抑制作用較明顯，特別是在乙醇含量＞2%以后，其活力急劇下降，最低降到38%。研究結(jié)果顯示，適度的酒精發(fā)酵對(duì)氨基酸態(tài)氮生成和原料蛋白利用率有益，但過度的酒精發(fā)酵則會(huì)起到相反的作用。

氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)過高較明顯的抑制了蛋白酶的活力。根據(jù)SU N W等[39]的研究結(jié)果在18%的氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)條件下（醬汁中鹽含量的一般值），僅3%的蛋白酶活力殘存。醬油曲中活性蛋白酶可能被鹽析出或者由于高鹽而變性，5%的氯化鈉降低蛋白酶的活力62%。根據(jù)研究結(jié)果，建議醬油曲采用45℃，＜5%的氯化鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)，短時(shí)間對(duì)醬油進(jìn)行快速發(fā)酵預(yù)處理。

6 展望

在我國現(xiàn)有市場競爭機(jī)制下，醬油生產(chǎn)企業(yè)大多只注重短期的生產(chǎn)成本，無暇顧及醬油生產(chǎn)過程中的基礎(chǔ)研究，因此導(dǎo)致近年來我國醬油生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展與日本等國家的差距越來越大。

醬油中主要的風(fēng)味物質(zhì)為從原料蛋白質(zhì)降解得到的氨基酸和短鏈肽。由于這個(gè)原因，醬油曲的蛋白酶活力在醬油的整個(gè)生產(chǎn)中顯得尤為重要。釀造過程中蛋白質(zhì)的降解是在蛋白酶系的作用下完成的，因此提高蛋白酶的活力就可以提高原料的蛋白利用率并縮短釀造周期，通過研究醬油蛋白酶系，可以使醬醅中各種酶類的比例更趨合理，從而提高氨基酸生成率和原料利用率。

優(yōu)化醬油生產(chǎn)中的蛋白酶系，可提高醬油的出品率，提升醬油產(chǎn)品的風(fēng)味，有利于醬油產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，也為改進(jìn)醬油傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝、促進(jìn)現(xiàn)代生物技術(shù)在醬油生產(chǎn)中的進(jìn)一步應(yīng)用提供理論技術(shù)依據(jù)。

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Research advance on proteases system in soy sauce production

ZHANG Jinlan1,3,WANG Wenping2,WANG Fujie3,ZHANG Jian3,ZHAO Yan2,3*
(1.China Meat Research Center,Beijing 100068,China;2.Beijing Academy of Food Sciences,Beijing 100050,China; 3.Beijing Institute of Food&Brewing,Beijing 100050,China)

The proteases play the most important roles in soy sauce brewing,especially in the product quality and the cost.This paper summarized lots of research reports about the characterization of proteases,strains screening of high productivity of protease and the effective factors on the protease. In addition,the proteases purified in soy sauce brewing,the screening method of strains and the important influence on the enzyme activity in the production of soy sauce were summarized.The development trend of the soy sauce proteases in the future was also forecasted.

soy sauce;proteases system;protease activity

TS264.2

A

0254-5071（2014）11-0001-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2014.11.001

2014-09-19

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31171738）；國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃‘863計(jì)劃’（2013AA102105）

張金蘭（1984-），女，工程師，碩士，研究方向?yàn)獒勗煺{(diào)味品。

*通訊作者：趙燕（1973-），女，高級(jí)工程師，碩士，研究方向?yàn)槿庵破芳庸べ|(zhì)量安全控制和清潔生產(chǎn)與節(jié)能減排。