自體紅骨髓及其不同成分復(fù)合PCPC修復(fù)兔橈骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

方 勇 肖玉周 廖中亞

（安徽省亳州市人民醫(yī)院骨科，安徽 亳州 236800）

自體紅骨髓及其不同成分復(fù)合PCPC修復(fù)兔橈骨缺損的實(shí)驗(yàn)研究

方 勇 肖玉周 廖中亞

（安徽省亳州市人民醫(yī)院骨科，安徽 亳州 236800）

目的研究自體紅骨髓復(fù)合多孔磷酸鈣骨水泥對(duì)骨缺損的治療效果，希望通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證自體紅骨髓中促進(jìn)骨缺損愈合的相關(guān)成分。方法選擇體質(zhì)量范圍在2.5～3.0 kg的新西蘭大白兔60只。實(shí)驗(yàn)中建造新西蘭大白兔雙側(cè)橈骨骨缺損模型（骨缺損大小1.5 cm）。利用隨機(jī)分組法將120側(cè)橈骨骨缺損模型分為五組，分別為A、B、C、D、E組，每組24側(cè)橈骨骨缺損模型，以E組作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。A組：自體紅骨髓+PCPC；B組：骨髓單個(gè)核細(xì)胞+PCPC；C組：無(wú)細(xì)胞成分骨髓液+PCPC；D組：去上清液骨髓細(xì)胞成分+PCPC；E組：?jiǎn)渭働CPC。標(biāo)本采集及數(shù)據(jù)分析：獲取標(biāo)本時(shí)間分別為手術(shù)后第4、8、12周），每個(gè)獲取標(biāo)本時(shí)間點(diǎn)每個(gè)實(shí)驗(yàn)組選取6只新西蘭大白兔，其中3只行X線攝片，另外3只兔子處死后用于組織形態(tài)學(xué)研究，研究不同時(shí)間段中骨缺損模型中新生骨生產(chǎn)情況。結(jié)果利用改良Lane-Sandhu X線評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)標(biāo)本X線結(jié)果進(jìn)行評(píng)分并完成統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果不同時(shí)間段實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的大體解剖學(xué)觀察、X線攝片和組織學(xué)觀察顯示，在植入物內(nèi)部骨細(xì)胞、骨小梁、骨基質(zhì)、骨質(zhì)重塑上，以及PCPC降解情況，ARBM接種PCPC復(fù)合人工骨組（A組）明顯優(yōu)于其他各組。Lane-Sandhu X線及組織學(xué)評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論新西蘭大白兔自體紅骨髓中的有形成分（如細(xì)胞成分）以及骨髓上清液中的無(wú)形成分（如生長(zhǎng)因子）對(duì)骨缺損的修復(fù)均有促進(jìn)作用。另外紅骨髓中的有形成分（細(xì)胞成分）以及無(wú)形成分（含生長(zhǎng)因子的骨髓上清液）在促進(jìn)骨缺損的修復(fù)中存在協(xié)同作用。自體紅骨髓中的有形成分（骨髓單個(gè)核細(xì)胞）在促進(jìn)骨缺損愈合過(guò)程中起到主要作用，可以將紅骨髓的促新骨形成作用應(yīng)用于骨缺損的治療中。

磷酸鈣骨水泥；CPC；ARBM；自體紅骨髓；骨髓單個(gè)核細(xì)胞；骨缺損；多孔

骨缺損是骨科研究領(lǐng)域的重要課題之一，骨缺損治療起來(lái)較為棘手，若治療不當(dāng)可導(dǎo)致嚴(yán)重的后果，給患者帶來(lái)很大的痛苦，機(jī)體功能以及生活質(zhì)量嚴(yán)重降低，骨缺損的傳統(tǒng)治療方案很多，如自體骨或異體骨移植、應(yīng)用生物替代材料以及骨延長(zhǎng)術(shù)等，但上述方法或多或少存在不同的短板及局限性，自體骨或異體骨移植材料需要進(jìn)行處理，如各種滅菌、滅活處理，導(dǎo)致成骨成分喪失，另外由于是非自身骨還存在不同程度的排斥反應(yīng)。生物替代材料雖然無(wú)排斥反應(yīng)，但無(wú)促進(jìn)骨愈合功能，另外骨延長(zhǎng)術(shù)也存在一定的缺點(diǎn)，如治療時(shí)間長(zhǎng)、并發(fā)癥多，治療費(fèi)用高等。

現(xiàn)如今大家較為公認(rèn)的治療骨缺損“金標(biāo)準(zhǔn)”的方法是自體骨移植，但因?yàn)樽泽w骨移植也存在一定的不足之處，如：①自體骨骨源及數(shù)量的限制；②供骨區(qū)的創(chuàng)傷及并發(fā)癥，自體骨移植在骨缺損治療中也存在較大的限制，所以研究者們一直致力于尋找更新的治療方案，或從自體骨移植的不足之處入手，需找出解決此類不足之處的新方法。近來(lái)自體紅骨髓移植治療骨缺損的研究成為熱點(diǎn)，研究表明自體紅骨髓移植治療骨缺損有它自身多方面優(yōu)點(diǎn)[1,2]：取材操作方便、療效確切以及并發(fā)癥少等優(yōu)點(diǎn)。本文作者亦準(zhǔn)備從自體紅骨髓入手，通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)紅骨髓治療骨缺損的促進(jìn)作用，期望發(fā)現(xiàn)紅骨髓中治療骨缺損的有效成分，為臨床上治療骨缺損提供相關(guān)證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及相關(guān)材料：成年健康新西蘭大白兔（蚌埠醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心），多孔磷酸鈣骨水泥（PCPC，上海瑞邦生物科技有限公司），5810R垂直離心機(jī)（德國(guó)EPPENDORF公司），X線攝片儀（德國(guó)飛利浦制造）。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組及模型制作：先后將60只大白兔（新西蘭）均建立雙側(cè)橈骨1.5 cm的骨缺損實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀＠秒S機(jī)分組法將120側(cè)橈骨骨缺損模型分為五組，分別為A、B、C、D、E組，每組24側(cè)橈骨骨缺損模型，以E組作為實(shí)驗(yàn)對(duì)照組。A組：PCPC+自體紅骨髓；B組：PCPC+骨髓單個(gè)核細(xì)胞；C組：PCPC+無(wú)細(xì)胞成分骨髓液；D組：PCPC+去上清液骨髓細(xì)胞成分；E組：?jiǎn)渭兞姿徕}骨水泥。

1.3 試驗(yàn)方法：①紅骨髓的獲取：無(wú)菌操作下應(yīng)用16號(hào)骨髓穿刺針穿刺抽取2.0 mL兔紅骨髓，保存、備用。②制備骨髓單個(gè)核細(xì)胞：采用密度梯度離心法提取骨髓單個(gè)核細(xì)胞，保存、備用。③制備無(wú)細(xì)胞成分骨髓液、去上清液骨髓細(xì)胞：采用2000轉(zhuǎn)/分鐘的離心機(jī)將保存?zhèn)溆玫耐眉t骨髓置于無(wú)菌抗凝試管中，離心時(shí)間達(dá)15 min，直至細(xì)胞成分和液體成分分層，分別留取、備用。④不同復(fù)合物的制備：將PCPC放置于裝有自體紅骨髓的無(wú)菌試管中（抗凝），抽取試管內(nèi)氣體，使管內(nèi)形成負(fù)壓，并置于恒溫水浴箱中，讓其充分浸潤(rùn)混合制成PCPC+ARBM復(fù)合物。并參照PCPC+ARBM的制備方法制備出不同復(fù)合物，如PCPC+去上清液骨髓細(xì)胞，PCPC+單個(gè)核細(xì)胞，PCPC+無(wú)細(xì)胞成分骨髓液。⑤手術(shù)過(guò)程：將兔以20%烏拉坦（5 mL/kg）靜脈麻醉后，仰臥位，常規(guī)消毒鋪巾，無(wú)菌條件下手術(shù)顯露雙側(cè)橈骨中斷，連同骨膜切除橈骨1.5 cm，造成節(jié)段性骨缺損模型[3]。然后分別于橈骨缺損處植入不同的事先準(zhǔn)備好的復(fù)合物，移植好復(fù)合物后仔細(xì)縫合傷口，并包扎。⑥結(jié)果觀察：分別于4、8、12周觀察：a.大體解剖學(xué)觀察。b.X攝片檢查：觀察家兔術(shù)后精神狀態(tài)、進(jìn)食、活動(dòng)和傷口愈合情況；術(shù)后4、8、12周攝X線片，根據(jù)Lane-Sandhu等（1987年）的X線評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)各組移植區(qū)骨形成、骨連接和骨塑形進(jìn)行評(píng)分。c.組織學(xué)觀察：將取材的各組標(biāo)本置于10%中性甲醛中固定，脫鈣，石蠟包埋，以缺損區(qū)為中心水平位切片，HE染色，光鏡下觀察新骨生成情況。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法：所有采集的數(shù)據(jù)均應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行處理，采用多個(gè)樣本均數(shù)的兩兩比較（F檢驗(yàn)）。

2 結(jié) 果

2.1 大體解剖學(xué)觀察：術(shù)后第4周時(shí)，A組骨缺損處可見(jiàn)大量淡紅色質(zhì)硬纖維組織充填，植入物表面可見(jiàn)大量纖維骨痂，植入物與自體骨結(jié)合處模糊，結(jié)合尚不牢固；B、C、D三組骨缺損處部分淡紅色質(zhì)硬纖維組織填充，少量纖維骨痂，界限尚清，與自體骨結(jié)合不牢固；E組骨缺損處大量質(zhì)軟纖維組織充填，與自體骨界限清晰。

術(shù)后第8周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組骨痂明顯多于對(duì)照組，A組（A組植入物表面大量堅(jiān)硬的連續(xù)骨痂成膨脹性生長(zhǎng)，植入物表面的腔隙已被充填，植入物和自體骨結(jié)合牢固）；B、D組（組植入物表面部分被骨組織覆蓋，植入物與自體骨界限模糊，結(jié)合欠牢固）；C組以上表現(xiàn)比B、D兩組差；E組可見(jiàn)少量反應(yīng)性骨形成。

術(shù)后第12周，A組（組缺損處均完全被骨組織覆蓋，呈骨性愈合，骨缺損完全愈合）；B、C、D（各組植入物表面可見(jiàn)大量堅(jiān)硬的連續(xù)骨痂生長(zhǎng)，植入物與自體骨結(jié)合牢固），E組缺損兩端部分硬骨痂充填，結(jié)合欠牢固。

2.2 X線攝片檢測(cè)：術(shù)后第4周時(shí)，A組骨缺損處表面模糊，骨痂形成，人工骨少量吸收，B、C、D三組缺損處兩端可見(jiàn)部分骨痂形成，植入物無(wú)吸收；E組骨缺損處未見(jiàn)明顯骨痂形成，植入物無(wú)吸收。

術(shù)后第8周時(shí)，A組（骨缺損處可見(jiàn)大量連續(xù)骨痂生成，包裹植入物，連接截骨斷端，密度增加，人工骨大部分吸收，骨髓腔可見(jiàn)再通）。B、D組骨缺損處可見(jiàn)部分連續(xù)性骨痂形成，植入物兩端模糊，密度有所增高，植入物少量吸收，其中C組較B、D兩組稍差，植入物輪廓可見(jiàn)。E組可見(jiàn)少許反應(yīng)性骨痂形成，植入物無(wú)吸收，髓腔兩端硬化封閉。

術(shù)后第12周時(shí)，A組（缺損處可見(jiàn)新生皮質(zhì)骨改造塑型完成，新生骨密度接近正常骨組織，與自體骨自然連接，人工骨基本吸收，骨髓腔基本再通）植入物與骨端融合，形成新的骨皮質(zhì)且光滑，骨缺損完全修復(fù)且可見(jiàn)部分髓腔再通影像。B、D組（缺損處可見(jiàn)大量連續(xù)骨痂形成，完全包裹人工骨，皮質(zhì)骨基本連續(xù)，人工骨大部分吸收，骨髓腔部分再通），C組表面可見(jiàn)大量連續(xù)骨痂形成，包裹植入物，皮質(zhì)骨基本連續(xù)，植入物大部分吸收，骨髓腔少部分再通。E組可見(jiàn)反應(yīng)性骨痂形成，髓腔封閉，植入物無(wú)吸收。

術(shù)后12周A組骨缺損完全修復(fù)、部分髓腔再通術(shù)后12周B組見(jiàn)骨缺損基本修復(fù)術(shù)后12周C組見(jiàn)大量骨痂形成、骨折線模糊；術(shù)后12周D組見(jiàn)骨缺損基本修復(fù)；術(shù)后12周E組見(jiàn)人工骨兩端及近尺骨側(cè)骨痂形成，骨缺損未修復(fù)。各時(shí)期各組Lane-Sandhu X線評(píng)分結(jié)果統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（xˉ±s）。注：各時(shí)期各組之間兩兩比較，除B、D組比較P值＞0.05，表示B、D組無(wú)顯著性差異。其余各組之間兩兩比較P值＜0.05，表示有顯著性差異。

2.3 組織形態(tài)學(xué)觀察：術(shù)后4周時(shí)，A組植入物孔隙內(nèi)及邊緣可見(jiàn)大量軟骨細(xì)胞及成骨細(xì)胞，外周的新生軟骨以及不成熟的骨小梁覆蓋部分植入物，缺損兩端大量成骨，植入物內(nèi)還可見(jiàn)新生毛細(xì)血管形成；B、C、D組植入物間隙內(nèi)可見(jiàn)大量纖維組織，部分軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，外周的新生骨痂形成，但不連續(xù)，包裹少部分植入物，截骨兩端大量成骨，植入物內(nèi)偶可見(jiàn)新生毛細(xì)血管。E組植入物間隙內(nèi)可見(jiàn)大量纖維組織，少量軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，缺損區(qū)與自體骨界限清楚。

術(shù)后8周時(shí)，A組（植入物內(nèi)可見(jiàn)大量新生骨組織，且可見(jiàn)破骨細(xì)胞形成，新生骨逐漸取代人工骨，可見(jiàn)少量骨髓組織，植入物表面新生骨痂片狀增生，包裹大部分植入物表面，新生骨痂與缺損兩斷端連成片狀；B、D組植入物內(nèi)可見(jiàn)新生骨，并有可見(jiàn)大量破骨細(xì)胞形成，新生骨逐漸取代植入物，植入物內(nèi)可見(jiàn)新生毛細(xì)血管，表面可見(jiàn)大量新生骨痂增生成條索狀，包裹部分人工骨。C組植入物內(nèi)可見(jiàn)新生骨，并可見(jiàn)部分破骨細(xì)胞，新生骨部分取代植入物，骨內(nèi)可見(jiàn)少量新生毛細(xì)血管形成。E組截骨兩端附近植入物間隙內(nèi)可見(jiàn)軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。

術(shù)后12周時(shí)，A組植入物孔隙內(nèi)可見(jiàn)大量成熟骨組織，植入物大部分被吸收，且可見(jiàn)大量骨髓組織形成。植入物與新骨間可見(jiàn)大量成熟骨小梁通過(guò)，其間可見(jiàn)新的哈佛系統(tǒng)，編織骨改建成板層骨。B、D組植入物內(nèi)可見(jiàn)部分成熟骨組織、成骨細(xì)胞及破骨細(xì)胞，植入物大部分被吸收，可見(jiàn)骨髓組織，表面可見(jiàn)部分皮質(zhì)骨包裹，且與自體骨形成片狀連接，C組人工骨間隙內(nèi)少量成熟骨組織，成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞，人工骨部分被吸收，可見(jiàn)少量骨髓組織，見(jiàn)原始骨髓、骨髓腔形成；E組植入物內(nèi)少量新生骨，骨缺損區(qū)與自體骨界限略模糊。A、B、C、D、E組術(shù)后12周，HE染色。

3 討 論

治療骨缺損一直都是骨科界的棘手問(wèn)題之一，現(xiàn)在大家公認(rèn)的治療骨缺損的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法是自體骨移植，但因?yàn)樽泽w骨移植存在一定程度的缺陷，如自體骨來(lái)源有限，不能滿足臨床對(duì)其數(shù)量上的需要，且存在供骨區(qū)的損失及后遺癥。其他方法如：同種異體骨移植以及生物材料的應(yīng)用，但都存在不同程度的缺點(diǎn)。如同種異體骨的缺點(diǎn)：新骨生成能力低、被吸收率高、血管化程度差及免疫排斥反應(yīng)會(huì)導(dǎo)致失敗。生物材料雖可避免免疫排斥反應(yīng)，但無(wú)誘導(dǎo)成骨作用。近年來(lái)，對(duì)于骨缺損修復(fù)研究的熱點(diǎn)集中在組織工程骨以及生長(zhǎng)因子與組織工程骨的結(jié)合。

應(yīng)用自體紅骨髓局部注射治療骨不連，將紅骨髓注入骨不連斷端處，在斷端周圍形成血腫，連接骨折斷端，進(jìn)而機(jī)化并有新生血管生成，斷端周圍形成大量間質(zhì)細(xì)胞，從而促進(jìn)骨不連修復(fù)。由于自體紅骨髓ARBM中含有大量骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP）、骨髓基質(zhì)干細(xì)胞、骨內(nèi)膜細(xì)胞和骨祖細(xì)胞，另外骨髓中含有的單核細(xì)胞及血小板等還能產(chǎn)生促進(jìn)骨愈合的生長(zhǎng)因子[4]。骨髓中的成骨能力來(lái)源于有形成分中的骨髓基質(zhì)干細(xì)胞，BMSC以兩種形式存在，第1種是IOPC，在因子的誘導(dǎo)作用下分化為成骨細(xì)胞，從而促進(jìn)成骨；第2種是DOPC，直接定向分化為成骨祖細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)成骨，BMSC即使在體外脫離誘導(dǎo)物培養(yǎng)條件下也能成骨[5]。骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與成骨細(xì)胞在生長(zhǎng)因子的作用下大量增殖，胞外基質(zhì)合成增加。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)[6]兔自體紅骨髓中存在多種促進(jìn)骨折愈合的生長(zhǎng)因子，例如：BMP-2、成纖維生長(zhǎng)因子-b、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子- beta、胰島素樣生長(zhǎng)因子-1、血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子-165、血小板衍生生長(zhǎng)因子-BB，且骨髓中的含量明顯高于外周血液，另外通過(guò)此研究發(fā)現(xiàn)含有生長(zhǎng)因子的紅骨髓上清液可誘導(dǎo)骨髓基質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化。

磷酸鈣骨水泥（PCPC）是組織工程骨支架材料研究的熱點(diǎn)，它是一種在化學(xué)組成上與骨組織的無(wú)機(jī)成分相同的骨缺損支架材料，它不僅具有優(yōu)良的骨傳導(dǎo)性，而且具有骨誘導(dǎo)性[7]。

PCPC是上海瑞邦生物科技有限公司研制的成品[1]。PCPC所具有的優(yōu)點(diǎn)[8]：①人工制備、數(shù)量充足。②形態(tài)塑造性強(qiáng)。③凝固過(guò)程中不產(chǎn)熱。④具有較好的孔徑及孔隙率，為新骨的長(zhǎng)入和增殖提供了良好的結(jié)構(gòu)[9]。⑤生物相容性和安全性高[10-12]。⑥體內(nèi)可降解性且降解產(chǎn)物無(wú)毒性[13]。⑦強(qiáng)度合適：強(qiáng)度在松質(zhì)骨與皮質(zhì)骨之間，適用于骨缺損支架材料。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)了ARBM復(fù)合PCPC可以促進(jìn)骨缺損的修復(fù)；ARBM中的骨髓單個(gè)核細(xì)胞和骨髓上清液均對(duì)骨缺損修復(fù)起到促進(jìn)作用，主要以骨髓單個(gè)核細(xì)胞促進(jìn)骨修復(fù)的作用為主。同時(shí)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)PCPC具有的體內(nèi)可降解性、良好的生物相容性及生物安全性構(gòu)等優(yōu)點(diǎn)。為臨床上應(yīng)用ARBM移植治療骨缺損或骨不連提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。雖然如此，但還有很多研究工作需要我們?nèi)プ?，如ARBM治療骨缺損的用量多少問(wèn)題；ARBM和載體材料復(fù)合方法的進(jìn)一步研究；另外，如何使得PCPC在孔隙率、孔徑大小和機(jī)械強(qiáng)度之間找到一個(gè)完美的平衡點(diǎn)，都將是我們以后研究的課題。

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The Experimental Study of Autologous Red Bone Marrow and the Different Composite Components PCPC Repairing Bone Defect

FANG Yong, XIAO Yu-zhou, LIAO Zhong-ya
(Department of Orthopedics, Bozhou People’s Hospital, Bozhou 236800, China)

ObjectiveTo discuss the efficacy treatment by autologous red bone marrow (ARBM)and various components composite porous calcium phosphate cement (PCPC)bone defect in order to find the evident of autologous red bone marrow healing role in the bone defect. Through this study we provides experimental evidence for the clinical treatment about bone defects red bone marrow transplant.MethodWe select 60 healthy New Zealand white rabbits, weighing 2.5～3.0 kg. All animals were established experimental model of bilateral bone defect(1.5 cm). All animals were completely random divided into A, B, C, D, E according to forelimbs(24 side per five groups), which E was the control group. A group was implanted autologous red bone marrow in the bone defect site. Group B was implanted bone marrow mononuclear cells. Group C was implanted composite acellular components; D group was implanted composite bone marrow supernatant cell components; E group was implanted with simple PCPC. we get the samples 4、8 and 12 weeks in each group at each time point and six rabbits were randomly selected(three killed, three under anesthesia)to get X-ray exam, the killed three rabbits receive histological examination such as various periods of new bone formation. We make statistical analysis according to modified Lane-Sandhu X scoring and histological score.ResultThe gross anatomy, x-ray and histological observation at all time points showed that the bone cells, trabecular bone matrix, bone remodeling, and PCPC degradation inside the implant, ARBM the composite of artificial inoculation (PCPC)group was better than the other groups. Lane-Sandhu X ray and histological score has statistically significant difference (P＜0.05).ConclusionAutologous red bone marrow and growth factors have the effect on promoting bone defects as well as a synergistic effect in promoting bone defect repair process. Autologous red bone marrow can be used in the treatment of bone defect repair which the main-promoting ingredients was the bone marrow mononuclear cells.

Calcium phosphate bone cement; CPC; ARBM; Autologous red bone marrow; Bone marrow mononuclear cells; Bone defect; Porous

R68

B

1671-8194（2014）28-0088-03