脂肪源性干細胞無酶分離培養(yǎng)方法的研究＊

劉 蘋，史春夢△，胡玲莉，張 波，王正國（1.第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院復(fù)合傷研究所／創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點實驗室，重慶 40008；.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所四室，重慶 40004；.湖北省孝感市9589部隊后勤部門診部，湖北孝感 4000）

脂肪源性干細胞無酶分離培養(yǎng)方法的研究＊

劉 蘋1，2，史春夢1，2△，胡玲莉3，張 波2，王正國2（1.第三軍醫(yī)大學(xué)軍事預(yù)防醫(yī)學(xué)院復(fù)合傷研究所／創(chuàng)傷、燒傷與復(fù)合傷國家重點實驗室，重慶 400038；2.第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所四室，重慶 400042；3.湖北省孝感市95829部隊后勤部門診部，湖北孝感 432000）

目的探索適合臨床治療應(yīng)用的脂肪源性干細胞（ADSCs）分離培養(yǎng)方法。方法分別采用無酶分離法和膠原酶消化法從脂肪抽吸術(shù)抽吸的人脂肪組織中分離培養(yǎng)細胞，對比分析分離的間充質(zhì)干細胞特性。結(jié)果無酶分離法所需時間僅為膠原酶消化法的1／3，分離的細胞在細胞形態(tài)學(xué)、增殖能力、免疫表型、分化潛能等特性與膠原酶消化法分離培養(yǎng)的細胞一致。結(jié)論無酶分離法能夠從脂肪抽吸術(shù)抽吸的人脂肪組織中分離培養(yǎng)出ADSCs，是一種安全可靠、適合臨床應(yīng)用的ADSCs分離培養(yǎng)方法。

脂肪源性干細胞；分離方法；無酶；膠原酶消化法；細胞，培養(yǎng)的；脂肪組織

王正國

脂肪源性干細胞（adipose derived stem cells，ADSCs）是一種存在于脂肪組織中的間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs），在皮下白色脂肪組織中占細胞總量的10%～20%。自Zuk等［1］從人抽吸的脂肪組織中成功分離出ADSCs以來，采用膠原酶、分散酶、胰蛋白酶、透明質(zhì)酸酶等酶類消化，已經(jīng)建立了多種ADSCs的分離培養(yǎng)方法，但不同實驗室采用不同的分離培養(yǎng)方法獲得的干細胞數(shù)量、免疫表型、功能等存在一定的差異［2］，難以有效地多中心對照研究ADSCs的治療潛能；分離用的酶類價格昂貴，且多來源于動物或細菌，易對臨床應(yīng)用造成病毒污染或免疫反應(yīng)；而且這些分離方法耗費時間［3－4］。故建立高效、穩(wěn)定可靠的、適合臨床應(yīng)用的ADSCs分離培養(yǎng)方法，將推動ADSCs的深入研究和臨床治療的廣泛應(yīng)用［5－7］。因此，本研究在以往分離培養(yǎng)ADSCs方法的基礎(chǔ)上，探索無酶分離方法從脂肪抽吸術(shù)抽吸的人脂肪組織中分離培養(yǎng)ADSCs，并鑒定分析分離培養(yǎng)細胞的形態(tài)、增殖能力、免疫表型、分化潛能等方面指標，為下一步研究與臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 人脂肪組織來源于臨床進行脂肪抽吸術(shù)的患者腹部皮下組織，共14例，其中男3例，女11例，年齡（44.0±11.6）歲，均簽署知情同意書。本實驗經(jīng)中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院野戰(zhàn)外科研究所倫理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 ADSCs的分離培養(yǎng)方法 （1）將收集的人脂肪組織100～300mL置于500mL的玻璃瓶，加入50mL磷酸鹽緩沖液（PBS），擰緊瓶蓋，用手劇烈震蕩2～4min；室溫靜置約5min使液體與脂肪組織分離，收集瓶底的液體至50mL于離心管內(nèi)；將漂浮的脂肪組織重復(fù)以上步驟漂洗2～4次，收集下層的液體，1 200r／min室溫離心10min，收集沉淀。（2）加入2 mL氯化銨紅細胞裂解液于沉淀組織中，輕輕吹打混勻，裂解1～2min，加入15～20mL PBS混勻，2 000r／min離心5min，棄紅色上清液。（3）細胞沉淀用PBS洗滌2次，按5.0×104個／cm2的密度接種于50mL培養(yǎng)瓶中，加入含10% 胎牛血清（FBS）的DMEM／F12培養(yǎng)基，置于37℃、飽和濕度的5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。（4）培養(yǎng)24h后全量換液，棄未貼壁細胞，以后根據(jù)細胞生長情況，每3天換液1次，待細胞達到80%融合時用0.025%胰酶／乙二胺四乙酸消化傳代，隔天換液；倒置相差顯微鏡觀察記錄培養(yǎng)細胞生長情況。同時利用0.1%膠原酶消化法分離培養(yǎng)ADSCs作為對照，按照以往研究的ADSCs分離方法進行操作。

1.2.2 ADSCs生物學(xué)特性檢測 （1）增殖能力：將第3代ADSCs，以細胞計數(shù)法繪制細胞的生長曲線。根據(jù)公式計算細胞倍增時間：Td＝t×［lg2／（lgNt－lgN0）］，其中 Td代表細胞倍增時間，t代表培養(yǎng)時間，N0、Nt分別代表接種后及培養(yǎng)t小時后的細胞數(shù)，計算平均值得到細胞倍增時間。（2）免疫表型特征：取第4代脂肪組織分離細胞，利用流式細胞分析儀（FCM）檢測細胞CD90、CD73、CD14、CD105、CD45等的表達。（3）分離細胞胚層來源：將分離培養(yǎng)的細胞用α－平滑肌動蛋白（α-SMA）抗體和波形蛋白（VIM）抗體進行免疫熒光染色，采用共聚焦激光掃描顯微鏡（confocal laser scanning microscope，CLSM）觀察。

1.2.3 ADSCs的多向分化潛能鑒定

1.2.3.1 向脂肪細胞誘導(dǎo)分化 （1）以5.00×104個／mL密度將第3代ADSCs接種于預(yù)先置有蓋玻片的6孔板內(nèi)以制備細胞爬片。（2）細胞達到80%融合后，加入成脂條件培養(yǎng)基（含1μmol／L地塞米松、10mg／L胰島素、0.50mmol／L 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤、10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基）2mL，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（3）隔天換液1次，共誘導(dǎo)28d，對照組加入含10%FBS的低糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)。（4）誘導(dǎo)28d后應(yīng)用油紅O染色法檢測脂滴形成。

1.2.3.2 向成骨細胞誘導(dǎo)分化 （1）方法同1.2.3.1中的（1）。（2）細胞達到80%融合后，加入成骨條件培養(yǎng)基（含1 μmol／L地塞米松、50μg／mL 維生素 C、10mmol／Lβ－甘油磷酸鈉的高糖DMEM培養(yǎng)基）2mL，置培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。（3）方法同1.2.3.1中的（3）。（4）誘導(dǎo)28d后應(yīng)用茜素紅染色法檢測鈣沉積。

1.2.3.3 向成軟骨誘導(dǎo)分化 （1）將消化下來的ADSCs用非完全成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基2 000r／min離心5min，漂洗1次，吸棄上清液。（2）用非完全成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基按照7.50×105個／mL重懸，用2 000r／min離心5min，漂洗1次，吸棄上清液。（3）將轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor，TGF）-β3解凍，加至非完全成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基，成為完全成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基（每次使用前現(xiàn)配）。（4）將細胞按照5×105個／mL用完全成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸，按照每份0.50mL（2.50×105）分裝至誘導(dǎo)培養(yǎng)用的離心管內(nèi)，用2 000r／min離心5min，共做6份。（5）擰松蓋子，置細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)；每2～3天用0.50mL完全成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)基換液（避免將細胞吹起）。（6）共誘導(dǎo)14～21d后，用甲醛固定，切片，阿辛藍染色。

1.2.3.4 油紅O染色 （1）取成脂誘導(dǎo)28d的細胞爬片，用PBS清洗2次，每次5min。（2）用4%多聚甲醛固定15min，PBS漂洗2次，每次5min。（3）用60%異丙醇漂洗爬片1次。（4）將油紅O染液配制成2%濃度，使用前用濾紙過濾后，滴至細胞爬片上染色15min。（5）吸棄染料，蒸餾水沖洗，鏡下觀察脂肪細胞形態(tài)及染色情況。

1.2.3.5 茜素紅染色 （1）取成骨誘導(dǎo)28d的細胞用4%多聚甲醛固定15min。（2）蒸餾水沖洗3次，加入0.1%茜素紅Tris-HCl染液（pH 8.3），37℃下染色3～5min。（3）蒸餾水沖洗，干燥，鏡下觀察成骨細胞形態(tài)及染色情況。

1.2.3.6 阿辛藍染色 （1）將固定的成軟骨誘導(dǎo)的細胞球形體切片脫蠟至水。（2）根據(jù)需要應(yīng)用不同pH的阿辛藍染色浸染切片10～60min。（3）流水沖洗5min左右。（4）脫水，透明并封片，顯微鏡下觀察。

1.2.4 細胞免疫熒光染色 （1）取細胞爬片，PBS漂洗2次，用無水甲醇－10℃固定10min。（2）用PBS充分漂洗3次，加含0.1%Triton-X 100的PBS破膜20min。（3）用PBS充分漂洗3次，加入含10%二抗血清的封閉液封閉30min。（4）滴加稀釋適度的一抗（α-SMA抗體1∶400，VIM抗體1∶200稀釋），4℃冰箱孵育過夜。（5）用PBS充分漂洗5次，滴加熒光標記的二抗，在濕盒內(nèi)37℃避光孵育45min。（6）用PBS充分漂洗5次，滴加4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（4′，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）染色5～10min。（7）滴加甘油封片劑封片，采用CLSM觀察。

2 結(jié) 果

2.1 ADSCs的細胞形態(tài)與增殖 利用無酶分離法可從脂肪組織分離出1.10×104～8.50×104個／mL的活性細胞，需要耗費時間50min左右，而膠原酶消化分離法至少需要150min以上。在DMEM／F12培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)3d左右可增殖形成集落樣，第6天細胞能生長至80%～90%的融合，大部分細胞形態(tài)為梭形或三角形的成纖維細胞樣細胞（圖1A），有少量組織碎片；傳代第2或3代后細胞形態(tài)更單一呈梭形、旋渦狀生長，增殖迅速，細胞3～5d可傳代，分離培養(yǎng)的細胞可傳近8代，而未見細胞形態(tài)明顯變化（圖1B、C），傳至10代以上的ADSCs的細胞質(zhì)變得扁平，增殖速度稍有下降（圖1D），但也有部分細胞能夠傳10代后仍可保持穩(wěn)定的形態(tài)和增殖速度。與膠原酶分離培養(yǎng)的ADSCs未見明顯差異。采用細胞計數(shù)法繪制的細胞生長曲線顯示，無酶法培養(yǎng)條件下第3代的ADSCs有較強的增殖能力，第4、5天細胞能夠長滿培養(yǎng)板底部，7d內(nèi)至少可增殖近8倍，生長曲線有明顯的增殖期和平臺期，計算第3代ADSCs的細胞倍增時間為（61.30±7.30）h，與膠原酶法分離的細胞相似。α-SMA和VIM的表達是中胚層來源組織細胞的重要標志。培養(yǎng)至第3代的ADSCs免疫熒光染色顯示，絕大部分細胞均表達α-SMA和VIM（圖2），表明從脂肪組織分離獲得的細胞來源于中胚層。

2.2 ADSCs的免疫表型特征 無酶法分離細胞的FCM分析結(jié)果可見，傳至第4代的ADSCs的干細胞或間質(zhì)細胞標志CD90、CD73、CD105均為陽性，陽性率均在98.00%以上，而造血細胞相關(guān)標志CD45和CD14為陰性；CD105＋CD45－的細胞在95.00%以上，CD73＋CD14－的細胞達98.30%，見圖3。表明分離培養(yǎng)獲得的細胞是來源于間質(zhì)的純度較高的干細胞，并排除造血細胞的污染。

2.3 ADSCs的多向分化潛能 無酶分離法分離細胞經(jīng)過28 d的成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)后，倒置相差顯微鏡下可見大部分細胞變成圓形、橢圓性或短梭形，細胞質(zhì)內(nèi)有較多明亮的脂滴；未經(jīng)誘導(dǎo)的細胞為長梭形，細胞質(zhì)內(nèi)未見脂滴，油紅O染色可見成脂誘導(dǎo)后的細胞內(nèi)有較多橙紅色的脂滴（圖4A），而未誘導(dǎo)的ADSCs的細胞質(zhì)內(nèi)未見脂滴出現(xiàn)。成骨誘導(dǎo)培養(yǎng)后，倒置相差顯微鏡下可見大部分細胞變成多角形或短梭形，可見沙樣顆粒沉積，對照組細胞無特殊變化，茜素紅染色可見成骨誘導(dǎo)后的細胞有較多紅色礦化基質(zhì)沉積（圖4B），而未誘導(dǎo)的ADSCs未見紅色沉積物。進行成軟骨誘導(dǎo)的ADSCs第2天可肉眼發(fā)現(xiàn)錐形管底部形成白色顆粒，顯微鏡下為細胞聚集的球形體。在21d的誘導(dǎo)過程中，ADSCs的細胞球形體體積未見明顯變化；將21d成軟骨誘導(dǎo)分化的細胞進行阿辛藍染色，可見大多數(shù)細胞均顯示藍色（圖4C），提示誘導(dǎo)后細胞表達軟骨細胞特異性的Ⅱ型膠原蛋白。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察分離培養(yǎng)的ADSCs細胞形態(tài)（×40）

圖3 第3代ADSCs免疫表型的FCM分析鑒定圖

圖4 培養(yǎng)ADSCs的多向分化潛能鑒定（×40）

3 討 論

MSCs是中胚層來源的一類具有多向分化能力的干細胞，目前，MSCs并無特異性的表面標志物，其鑒定主要是根據(jù)細胞形態(tài)學(xué)、生長特征、多種免疫表型及多向分化潛能來綜合判斷［8］。細胞治療國際協(xié)會認為評判分離的細胞是否為 MSCs的最低標準是［9］：（1）分離的細胞在標準培養(yǎng)條件貼壁生長，細胞形態(tài)呈成纖維細胞樣細胞；（2）細胞免疫表型的CD105、CD73、CD90、CD166、CD44等分子表達必須大于 95%，而CD45、CD34、CD14或CD11b、CD79或CD19、人白細胞 DR抗原（HLA-DR）等分子表達小于2%；（3）多向分化潛能，細胞在體外特定的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下必須能夠分化成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞等中胚層來源細胞。因此，本研究分別從細胞形態(tài)、增殖能力、免疫表型、胚層來源、分化潛能等5個方面鑒定采用無酶分離法從脂肪組織分離培養(yǎng)的細胞。

本研究結(jié)果顯示，從人脂肪組織中分離培養(yǎng)的細胞能夠在培養(yǎng)瓶貼壁生長，呈較為均一的成纖維細胞樣細胞，與骨髓來源MSCs的細胞形態(tài)相似；細胞能傳代培養(yǎng)近10代，并保持細胞形態(tài)與增殖能力無明顯變化；第3代的ADSCs細胞生長曲線顯示分離培養(yǎng)的細胞增殖迅速，計算細胞倍增時間為（61.30±7.30）h，與其他人分離培養(yǎng) ADSCs的研究報道基本一致，與成人骨髓、臍帶血、臍帶組織等來源MSCs的倍增時間（60h）無明顯差異［10－12］。FCM 分析結(jié)果可見分離培養(yǎng)細胞的干細胞或間質(zhì)細胞標志物CD73、CD90、CD105等均為高表達，陽性率均超過95.00%，而造血干細胞抗原標志物CD45和CD14為陰性，提示分離的細胞群具有間充質(zhì)干細胞的抗原標志而不是造血干細胞，抗體雙標FCM分析顯示CD105＋CD45－和CD73＋CD14－的細胞占95.00%以上，進一步確認從脂肪組織分離獲得純度較高的MSCs，與其他組織來源MSCs的免疫表型一致［13］。α-SMA和VIM的表達是中胚層來源組織的重要標志。分離培養(yǎng)的細胞免疫熒光染色結(jié)果顯示分離培養(yǎng)的絕大部分細胞表達α-SMA和VIM，提示從脂肪組織分離培養(yǎng)的ADSCs來源于中胚層組織。多向分化潛能是MSCs的重要特性［9］，向脂肪細胞、成骨細胞、成軟骨細胞等中胚層來源細胞分化是鑒定MSCs的必備條件。本研究結(jié)果顯示，從脂肪組織分離培養(yǎng)的細胞經(jīng)成脂肪細胞誘導(dǎo)分化后，大部分細胞的油紅O染色陽性，經(jīng)成骨細胞誘導(dǎo)分化后的細胞形成茜素紅染色陽性的鈣結(jié)節(jié)，經(jīng)成軟骨細胞誘導(dǎo)分化的大部分細胞經(jīng)阿辛藍染色為陽性，提示本研究分離培養(yǎng)的細胞在特定的誘導(dǎo)培養(yǎng)條件下具備向脂肪細胞、成骨細胞和成軟骨細胞分化等多向分化潛能。以上結(jié)果表明從脂肪組織分離的基質(zhì)細胞在細胞形態(tài)與增殖能力、免疫表型和多向分化潛能上均與廣泛接受的MSCs鑒定標準相符合，故無酶分離法從脂肪抽吸術(shù)抽吸的人脂肪組織中分離培養(yǎng)的細胞為ADSCs。

本研究結(jié)果表明采用無酶分離法從脂肪組織中分離獲得的細胞在細胞形態(tài)、生長特性、免疫表型、分化潛能等特性方面與文獻報道膠原酶消化法分離的ADSCs未見明顯差異［14］。雖然無酶分離法分離ADSCs的細胞產(chǎn)量較膠原酶消化法獲得的細胞產(chǎn)量明顯減少，但耗費時間只有膠原酶消化法的1／3，同時避免了酶消化對細胞的損傷和破壞作用。更重要的是無酶分離法可排除動物或細菌來源的異源性酶類對分離細胞的臨床應(yīng)用造成病毒污染或免疫反應(yīng)，可望為臨床提供適合治療應(yīng)用的干細胞。

綜上所述，無酶分離法是一種能夠從脂肪抽吸術(shù)抽吸的人脂肪組織中分離培養(yǎng)出ADSCs的、穩(wěn)定可靠的、適合臨床應(yīng)用的ADSCs分離培養(yǎng)方法。脂肪抽吸術(shù)是一種可以獲得大量脂肪組織的安全“微創(chuàng)技術(shù)”，通過美容及整形外科去除人體多余脂肪的常用手段，可獲得大量的基質(zhì)干細胞，使ADSCs有望替代骨髓MSCs，而成為細胞治療多種疾病的干細胞來源［15］。

院士簡介：王正國，中國工程院首批院士，美國賓夕法尼亞大學(xué)醫(yī)學(xué)院教授會成員。我國野戰(zhàn)外科學(xué)、沖擊傷、創(chuàng)傷彈道學(xué)、交通醫(yī)學(xué)研究的主要創(chuàng)始人，在國際上享有較高聲譽。1999作為首席科學(xué)家主持我國創(chuàng)傷醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域和全軍第一個“973”項目。2005年在北京香山會議“再生醫(yī)學(xué)”主題研討會上首次提出了研究通用型干細胞的設(shè)想和目標。先后獲得以國家科技進步一等獎為代表的各類獎項20余項。1996年獲軍隊專業(yè)技術(shù)重大貢獻獎，1997年獲“何梁何利”獎，1998年獲美國“Michael DeBakey國際軍醫(yī)獎”（該獎設(shè)立以來獲此殊榮的惟一亞洲人），獲重慶市首屆爭光貢獻獎，2000年獲陳嘉庚獎和國際交通醫(yī)學(xué)重大貢獻獎，2002年獲第四屆中國光華工程科技獎，2009年獲吳階平獎。

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Study on non-enzymatic separation and culture method of adipose-derived stem cells＊

LiuPing1，2，ShiChunmeng1，2△，HuLingli3，ZhangBo2，WangZhengguo2
（1.ResearchInstituteofCombinedInjuries，CollegeofPreventiveMedicine，ThirdMilitaryMedicalUniversity，StateKeyLabofTrauma，BurnsandCombinedInjury，Chongqing400038，China；2.FourthRoom，ResearchInstituteofFieldSurgery，ThirdMilitaryMedicalUniversity，Chongqing400042，China；3.OutpatientDepartmentofLogistics，Unit95829，Xiaogan，Hubei432000，China）

ObjectiveTo explore a separation and culture method of human adipose-derived stem cells（ADSCs）suitable for the clinical application.MethodsThe non-enzymatic method and the collagenase digestion method were adopted to isolate and culture the cells from the human adipose tissue in the individuals with liposuction.The characteristics of isolated mesenchymal stem cells were comparatively analyzed.ResultsThe required time in the non-enzymatic method was one third of that in the collagenase digestion method and the cellular morphology，reproductive capacity，immunophenotype and differentiation potential of the isolated cells were consistent to those isolated by the collagenase digestion method.ConclusionThe no-enzymatic method may isolate and culture ADSCs from the adipose tissue in the individual with liposuction，which is a safety and reliable isolation and culture method of human adipose tissue-derived stem cells suitable for clinical application.

adipose derived stem cells；separation method；no-enzymatic；collagenase digestion method；cells，cultured；adipose tissue

10.3969／j.issn.1671-8348.2014.10.001

A

1671-8348（2014）10-1153-04

國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973）專項課題資助項目（2011CB964701）；重慶市科技攻關(guān)（重點）資助項目（cstc2012GGB10003）。

劉蘋（1971－），高級實驗師，碩士研究生，主要從事再生醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)研究。△

，Tel：13708396812；E-mail：shicm1010＠aliyun.com。

2013-10-08

2013-12-19）

論著·臨床研究