基質(zhì)金屬蛋白酶-2、-9與腦缺血微血管損傷的關(guān)系

劉昱言 劉 軻 劉敬霞 李建生

(河南中醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000)

缺血性腦血管疾病(ICVD)約占全部腦血管意外的60%～80%〔1〕。大多數(shù)的ICVD是由動脈血管內(nèi)血栓阻塞血管所致，理想的治療方法是早期再通閉塞的血管。溶栓治療可在有效的時間窗內(nèi)溶解血栓，恢復(fù)血流，挽救缺血半暗帶的部分損傷腦組織，是急性腦梗死治療中挽救缺血腦組織的最佳方案〔2〕。但溶栓后血流再通及再灌注損傷可引起腦微血管基底膜模糊、斷裂、水腫,出現(xiàn)節(jié)段性溶解、脫落、缺損,微血管結(jié)構(gòu)完整性受損,這不僅加重缺血區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞損傷；而且使血腦屏障(BBB)通透性增高,引起毛細(xì)血管內(nèi)水分和血漿蛋白外滲,導(dǎo)致血管源性腦水腫。近年來研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2、-9在腦微血管損傷的病理過程中發(fā)揮重要作用，此為腦缺血微血管損傷的病理生理機制及其治療提供新思路。MMP-2、-9屬于蛋白酶家族中的明膠酶系，通常降解細(xì)胞-1(TIMP-1)可特異性地對抗其增強，起到保護微血管受損的作用?，F(xiàn)就MMP-2、-9與腦缺血微血管損傷的關(guān)系進行綜述。

1 明膠酶系

1.1分類 明膠酶系屬于MMPs家族中的成員，所謂MMPs是一組具有許多共同生化性質(zhì)的可降解細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的鈣離子和鋅離子依賴性內(nèi)肽酶，以酶原形式存在,在細(xì)胞外激活,激活的MMPs可選擇性降解多種ECM成分,主要包括：膠原、明膠、纖維連接蛋白、彈性蛋白和蛋白多糖等。依據(jù)其作用底物的不同可分為膠原酶(MMP-1,-8等)、明膠酶(MMP-2,-9)、間質(zhì)溶解素(MMP-3,-10，-11)、膜型MMPs(MMP-14,-15,-16,-17)和其他成員(基質(zhì)降解素、巨噬細(xì)胞彈性蛋白酶)。其中，MMP-2、-9因在催化區(qū)內(nèi)含有3個重復(fù)的纖維連接蛋白-Ⅱ基因片段,共用具有相似的蛋白水解活性和降解變性的膠原、明膠、還有一些細(xì)胞外基質(zhì)分子被稱為“明膠酶系”。這些細(xì)胞外基質(zhì)分子包括天然Ⅳ，Ⅴ和Ⅺ型膠原、層黏連蛋白及聚集蛋白聚糖核心蛋白。MMP-2因相對分子質(zhì)量為 72×103(72 kD)又被稱為72 kD Ⅳ型膠原酶或明膠酶A，主要底物包括明膠、Ⅳ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原、層黏連蛋白、彈性蛋白及纖維連接蛋白。MMP-9的相對分子質(zhì)量為92×103(92 kD)被稱為92 kD Ⅳ型膠原酶或明膠酶B，主要底物包括明膠、Ⅳ、Ⅴ型膠原和彈性蛋白。MMP-2還能溶解Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型膠原。然而，MMP-2的膠原酶活性相對其他酶弱一些。由于MMP-2酶原被募集于細(xì)胞表面并由膜結(jié)合的MT-MMPs激活，它可聚集于細(xì)胞外并表達某種原生膠原酶活性，并能發(fā)揮協(xié)同作用，使膠原分解為更小的碎片，這些碎片會在37℃的體溫下變性〔3〕。

1.2MMP-2 、MMP-9在中樞神經(jīng)系的分布、表達及作用 健康人類的中樞神經(jīng)系統(tǒng),可檢測到星形膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞及中性粒細(xì)胞等都能釋放MMP-2、-9。MMP-2 mRNA、蛋白質(zhì)、酶活性廣泛存在于腦組織中,膠質(zhì)細(xì)胞中最多?；钚訫MP-2產(chǎn)生于星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞。MMP-9 mRNA、蛋白質(zhì)、酶活性主要存在于海馬、小腦和大腦皮層的神經(jīng)細(xì)胞中,MMP-9的蛋白和酶活性主要在胞體和樹突中，而且體外研究表明MMP-9蛋白可在體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元表達〔4〕。

MMPs在健康中樞神經(jīng)系統(tǒng)中是調(diào)控生長發(fā)育的一種重要蛋白酶，能選擇性作用多種ECM成分，消化降解間質(zhì)內(nèi)的ECM成分，并影響基質(zhì)的重塑，通過維持ECM成分合成和降解的動態(tài)平衡。當(dāng)神經(jīng)系統(tǒng)出現(xiàn)損傷時起修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)的作用，但某些情況下，機內(nèi)的一些MMPs同時急劇升高反而會導(dǎo)致機體病理損傷。因此，MMPs有雙重功能，一方面能介導(dǎo)神經(jīng)修復(fù)和功能恢復(fù)，另一方面又造成機體損。在正常穩(wěn)定狀態(tài)的組織中，MMPs表達量極少；而在涉及人體多種生理和病理過程中，如炎癥，新生血管形成，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移時，其表達量上升。

1.3MMP-2 、MMP-9的活性調(diào)節(jié) MMPs的生物活性受基因轉(zhuǎn)錄、酶原活化和酶抑制劑等多因素調(diào)控，其中轉(zhuǎn)錄水平包括白介素(IL)-1、IL-12、血小板衍生生長因子(PDGF)、轉(zhuǎn)化生長因子α(TGF)-α、腫瘤壞死因子(TNF)-α等。研究表明TNF-α能上調(diào)MMPs的表達；TGF-β、IFN-γ、類固醇激素(包括糖皮質(zhì)激素)和視黃醛則下調(diào)MMPs的表達〔5〕。MMPs是以無活性的酶原形式分泌的，通常認(rèn)為只有被活化后才能降解基質(zhì)蛋白，這是控制ECM降解的重要調(diào)節(jié)機制。研究表明:纖溶酶原在尿激酶纖溶酶原活化劑或組織纖溶酶原活化劑(uPA或tPA)催化下變成纖溶酶，纖溶酶可部分激活間質(zhì)膠原酶和基質(zhì)分解素原〔6〕。MMP-2體內(nèi)激活途徑與其他MMPs不同，不被plasmin/uPA系統(tǒng)激活，而是通過其C末端與位于細(xì)胞膜表面的MT1-MMP相互作用而激活。金屬蛋白酶相互間也存在著激活作用，研究表明，受損血管平滑肌細(xì)胞中MMP-3增加，而MMP-3可誘導(dǎo)MMP-2，MMP-9的表達，共同參與血管壁損傷〔7〕。MMPs分子之間存在的相互級聯(lián)激活機制對于調(diào)節(jié)MMPs的潛在活性具有重要作用，同時也把MMPs與纖溶系統(tǒng)聯(lián)系在一起。TIMP調(diào)控，MMPs的蛋白水解酶活性受非特異性和特異性抑制劑的抑制，非特異性抑制劑包括a2-巨球蛋白、a1-抗蛋白酶和BB-94(batimistat)；特異性抑制劑為組織型TIMPs。目前發(fā)現(xiàn)的，TIMPs分4型，它以1∶1的比例與活化的MMPs結(jié)合，并抑制其活性。TIMP-1抑制大多數(shù)MMPs的活性，但不包括MT1-MMP和MMP-2；TIMP-2對除MMP-9外的大多數(shù)MMPs均有抑制作用；TIMP-3具有抑制MMP-1,-2,-3,-9,-13活性的作用。TIMP-4則參與穩(wěn)定ECM。TIMPs在ECM代謝中起著與MMPs對應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)作用，可阻止MMPs的活化，并抑制其作用，影響蛋白分解損傷的程度和持續(xù)時間。在一些基質(zhì)過度降解的疾病，MMPs和TIMPs之間平衡失調(diào)，導(dǎo)致MMPs活性總體上凈增加〔3〕。

2 MMP-2、MMP-9與BBB損傷

腦部微血管與體內(nèi)大多數(shù)微血管床不同，小分子的溶質(zhì)不能自由通過腦微血管，即所謂BBB。其主要結(jié)構(gòu)包括內(nèi)皮細(xì)胞(EC)、EC的緊密連接(TJ)、星形細(xì)胞、周皮細(xì)胞和血管周圍的小膠質(zhì)細(xì)胞以及基底膜等。當(dāng)腦組織發(fā)生病變時,腦微血管是受侵害的首要靶點,缺血可以使腦微血管結(jié)構(gòu)發(fā)生損傷性變化。微血管結(jié)構(gòu)的損害導(dǎo)致BBB功能破壞,加重缺血區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞損傷。許多著名的實驗研究均證明永久或短暫性腦缺血后病變區(qū)MMP-2與MMP-9表達增加，同時有ECM中的片蛋白、纖維連接蛋白與Ⅳ型膠原的消失、毛細(xì)血管通透性增加，注射Evans藍可見外溢。腦缺血后缺血區(qū)MMP-2與MMP-9表達有明顯的時間差異，MMP-9表達時間比MMP-2早。缺血后3～4 h缺血區(qū)MMP-9表達開始增加,12 h明顯增高,4～5 d達到高峰，一直持續(xù)到缺血后第15天表達恢復(fù)至基礎(chǔ)水平。MMP-2則從缺血后24 h出現(xiàn)低水平表達，第5天開始表達增高,至30 d時仍有不明顯的低水平表達。MMP-2與MMP-9這種表達時間上的差異可能是由于MMP-9與急性期BBB損傷有關(guān),而MMP-2則與缺血后損傷的修復(fù)有關(guān)〔8〕。缺血后MMP-2和MMP-9對BBB損傷主要表現(xiàn)在為降解內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜的底物。研究表明：內(nèi)皮細(xì)胞同體內(nèi)其他細(xì)胞一樣，在生長分化過程中，也產(chǎn)生豐富的ECM，其中Ⅳ型膠原是內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生的特異性ECM。這些基質(zhì)成分部分存在于內(nèi)皮細(xì)胞間隙，部分在內(nèi)皮細(xì)胞下形成內(nèi)皮細(xì)胞基底膜。內(nèi)皮ECM除了維持內(nèi)皮細(xì)胞正常生存、分化和運動外環(huán)境，還與內(nèi)皮的屏障功能有關(guān)。MMP-2和MMP-9能特異性地分解Ⅳ型膠原，對內(nèi)皮細(xì)胞通透性具有直接的調(diào)控作用。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)顯著促進內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生MMP-2，MMP-2抗體顯著抑制VEGF增加內(nèi)皮細(xì)胞單層通透性作用，結(jié)果表明MMP-2活性改變以及由此導(dǎo)致的特異性基質(zhì)的分解可能與VEGF的促通透作用有關(guān)。實驗中未觀察到MMP-9的產(chǎn)生，表明MMP-2是內(nèi)皮細(xì)胞中惟一介導(dǎo)VEGF促通透作用的Ⅳ型膠原酶〔9〕。俞鳴〔10〕通過臨床觀察表明，急性腦梗死患者血清VEGF和MMP-9水平均明顯升高， 血清VEGF和MMP-9水平與腦梗死患者的梗死面積有一定相關(guān)性。ECM由細(xì)胞間的多種蛋白質(zhì)和非蛋白質(zhì)組成，構(gòu)成細(xì)胞生活的微環(huán)境，具有支持、連接、營養(yǎng)和防御等生理作用。ECM和基底膜的降解，在一定程度上決定著血管的完整性〔11〕。腦毛細(xì)血管壁基底膜的主要成分為Ⅳ型膠原、層黏蛋白和纖維連接蛋白，局灶性腦缺血可以引起基底膜通透性和結(jié)構(gòu)的變化，造成BBB損傷。Heo等〔12〕研究表明將Wisrar大鼠大腦中動脈(MCA)阻斷30 min就可出現(xiàn)MMP-9水平的升高，這一時間窗內(nèi)同時出現(xiàn)水和離子從緊密連接處流出，說明MMP-9在缺血剛開始時就出現(xiàn)上調(diào)，在BBB降解過程發(fā)揮作用。

3 MMP-2、MMP-9與腦缺血再灌注損傷

腦缺血后早期的血流再通有助于保護缺血半暗帶，而后期的再灌注卻加重組織損傷。腦缺血再灌注后MMPs表達增加，尤以MMP-2 和MMP-9活性增強最為明顯，MMPs通過降解ECM、使基底膜模糊、斷裂、水腫，出現(xiàn)節(jié)段性溶解、脫落、缺損，微血管結(jié)構(gòu)完整性受損，通透性增高,引起毛細(xì)血管內(nèi)水分和血漿蛋白外滲,導(dǎo)致細(xì)胞間隙內(nèi)水分增多，即形成血管源性腦水腫。李建生等〔13〕采用大腦中動脈線栓法(MCAO)復(fù)制腦缺血模型，觀察神經(jīng)癥狀積分、梗死面積、病理變化、基底膜Ⅳ型膠原(ColⅣ)和層連蛋白(LN)。結(jié)果顯示腦I/R損傷與微血管基底膜ColⅣ 和LN降解有關(guān)，隨再灌注時間的延長而加重。腦缺血3 h時ColⅣ 和LN變化不明顯，I/R 6 h、12 h顯著降解并逐漸加重，I/R 24 h降解達到峰值，I/R 6 d損傷趨勢有所減緩。孫曉偉等〔14〕亦采用MCAO法，用免疫組化技術(shù)分別觀察腦缺血再灌注后不同時相點MMP-9 蛋白表達的變化。結(jié)果顯示缺血再灌注后MMP-9含量隨再灌注時間而呈動態(tài)變化，再灌注4 h開始升高，12 h增加明顯，4～48 h時達到高峰，隨后有所減低，從而證明MMP-9參與了腦缺血再灌注后 BBB 的破壞以及繼發(fā)性腦水腫的形成。Liu等〔15〕研究表明：雌激素能減輕缺血再灌注后腦水腫和神經(jīng)細(xì)胞損傷程度，其機制就是通過MMP-2、MMP-9的表達和活性介導(dǎo)。

組織型纖溶酶原激活物(rt-PA)是目前治療急性缺血性腦卒中最有效的措施之一，其嚴(yán)重的并發(fā)癥是腦內(nèi)出血。有研究表明rt-PA溶栓治療引起的出血與再灌注后MMPs的過度活化，使膠原、層黏連蛋白、基底膜等腦血管中的重要蛋白被降解，從而破壞血管結(jié)構(gòu)的完整性有密切關(guān)系。Rosenberg等〔16〕假設(shè)腦梗死后缺血與腦缺血再灌注損傷引發(fā)MMP-9的表達，MMP-9的表達誘導(dǎo)TNF、IL等細(xì)胞因子、部分趨化因子以及氧自由基等參與的一系列連續(xù)反應(yīng)。MMPs酶原的激活，尤其是MMP-9酶原的激活是蛋白酶參與BBB破壞反應(yīng)的關(guān)鍵，這一過程涉及其他蛋白酶和氧自由基等的參與，MMP-9的激活需要MMP-3，氧自由基的作用,而MMP-3自身的激活可能需要纖維蛋白溶酶的作用。MMP-9激活后引起的BBB遲發(fā)性開放(再灌注24～48 h),導(dǎo)致血管源性腦水腫和出血性轉(zhuǎn)化。

4 MMP-2、MMP-9抑制劑與腦缺血微血管損傷

大量的研究表明腦缺血溶栓治療在挽救缺血半暗帶的同時，增加了顱內(nèi)出血和血管源性水腫的風(fēng)險。腦缺血和缺血再灌注時MMPs水平升高，使用合成的TIMP可不同程度地抑制上述改變,減輕BBB損傷，緩解繼發(fā)的血管源性腦水腫及出血性轉(zhuǎn)化。Pfeferkorn等〔17〕的研究提示，應(yīng)用TIMP (BB-94)可使rt-PA溶栓治療的并發(fā)癥的發(fā)生率降低，從而有望使溶栓治療的時間窗有所延長并減少因溶栓所致的出血性并發(fā)癥。由此可知，在腦缺血再灌注的過程中及時通過TIMP對MMP-2、MMP-9進行干預(yù)，可能成為缺血性腦血管疾病的新途徑，亦為尋找新的治療靶點提供依據(jù)。Rosenberg等〔18〕近期研究表明再灌注損傷可使BBB形成雙向開放，由于MMP-2的激活導(dǎo)致再灌注損傷在BBB開放的早幾個小時內(nèi)即可出現(xiàn)。早期的BBB開放只是短暫的,在24～48 h后由于MMP-9和MMP-3的激活可造成更嚴(yán)重的血管損傷。TIMP僅對恢復(fù)早期再灌注造成的血管損傷有幫助,因為TIMP在保護血管的同時抑制了血管和神經(jīng)的重塑，影響了康復(fù)。

5 問題及展望

綜上所述，在腦缺血/再灌注損傷中MMP-2、-9可降解ECM，改變血管通透性，參與血管源性腦水腫和腦出血機制方面已達共識。在TIMP可抑制明膠酶的表達，調(diào)節(jié)MMPs對ECM破壞、在腦缺血/再灌注過程中起到保護作用的機制也逐漸得到認(rèn)可。MMPs與TIMP的相關(guān)研究多集中在動物實驗方面，臨床研究較少，動物實驗結(jié)果與臨床實際療效尚存在一定的差距；MMPs的激活通路十分復(fù)雜，除了腦組織缺血缺氧和腦缺血/再灌注可導(dǎo)致MMs的過度表達，纖溶酶系統(tǒng)作為血管基底膜和ECM降解的主要酶類其激活MMPs的通路尚不清楚。另外，關(guān)于TIMP對MMP-2、-9的調(diào)節(jié)作用機制仍未明了，TIMP與纖溶酶原激活物之間是否也存在相互作用等問題皆需要進一步的研究；與MMPs、TIMP研究的整體水平相比，有關(guān)中醫(yī)藥對MMPs、TIMP干預(yù)作用的研究報道較少。

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