氣單胞菌外膜蛋白基因工程疫苗的研究進(jìn)展

單曉楓，曹 亮，沈錦玉，陳 龍，康元環(huán)，陳亨利，錢(qián)愛(ài)東?

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長(zhǎng)春130118；2.農(nóng)業(yè)部淡水漁業(yè)健康養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江省淡水水產(chǎn)研究所，浙江湖州，313001）

氣單胞菌（Aeromonas）隸屬于氣單胞菌科（Aermonadaceae），是一類(lèi)人-獸-魚(yú)共患的病原菌［1］，其廣泛存在于各種環(huán)境中，除引起人獸患病外，還可導(dǎo)致多種水生動(dòng)物感染發(fā)病，嚴(yán)重危害水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展［2-4］。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)細(xì)菌性疾病多采用抗生素療法進(jìn)行救治，但此法極易使致病菌產(chǎn)生耐藥性，且水生動(dòng)物體內(nèi)的藥物殘留也威脅著人類(lèi)自身安全［5］，因此，預(yù)防疾病的發(fā)生就顯得尤為重要。在水產(chǎn)養(yǎng)殖中，除日常管理外，疫苗的研發(fā)則是魚(yú)病防治的重要研究方向。目前，繼滅活疫苗、弱毒疫苗之后，基因工程疫苗是氣單胞菌研究的重點(diǎn)，而氣單胞菌的外膜蛋白（Outer membrane proteins，OMPs）由于具有良好的免疫原性以及交叉保護(hù)性［6-7］，可作為基因工程疫苗最具潛力的候選免疫抗原成分之一，逐漸成為水產(chǎn)疫苗研究的熱點(diǎn)［8-9］。本文就氣單胞菌外膜蛋白的基因工程疫苗研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，旨在為氣單胞菌疫苗的研發(fā)提供參考。

1 氣單胞菌外膜蛋白OMPs的基本特征

外膜是革蘭氏陰性菌（Gram negative bacteria，G-）特有結(jié)構(gòu)，存在于胞漿膜（內(nèi)膜）和肽聚糖外側(cè)，與胞漿膜共同組成G-膜系統(tǒng)，在維持菌體自身結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及物質(zhì)運(yùn)輸方面有重要作用［10-11］。與其他革蘭氏陰性菌相同，氣單胞菌外膜蛋白也是外膜中嵌合的多種蛋白的統(tǒng)稱(chēng)，根據(jù)在單細(xì)胞中的拷貝數(shù)的高低可分為主要蛋白和微量蛋白，主要蛋白包括外膜蛋白 A（OmpA）、微孔蛋白（Porins，OmpC）和脂蛋白（Lipoprotein，Lpp）等。OmpA富含 β折疊，功能上可為外膜提供通透性，同時(shí)維持菌體外膜的完整性；OmpC又稱(chēng)通道蛋白，它以非共價(jià)鍵與肽聚糖結(jié)合，形成跨越外膜的相對(duì)非特異性的通道，對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)（如氨基酸、二肽和雙糖等）、抗菌素等的運(yùn)輸及離子篩選有重要作用，某些氣單胞菌的OmpC（如嗜水氣單胞菌）可在缺鐵環(huán)境下產(chǎn)生鐵載體，以獲取更多的 Fe3+［12-13］；LPP 起到穩(wěn)定細(xì)菌外膜-肽聚糖復(fù)合物的作用，同時(shí)也可參與其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)。微量蛋白約有10～20種，如lamB蛋白、Tsx蛋白、FepA蛋白等，氣單胞菌的外膜蛋白被證明含有麥芽糖誘導(dǎo)的lamB同源蛋白，此外ExeD蛋白也被證實(shí)通過(guò)外膜的周質(zhì)間隙（periplasmic space）來(lái)轉(zhuǎn)運(yùn)胞內(nèi)蛋白［14］。

2 基因工程亞單位疫苗

亞單位疫苗即提取病原菌如外膜蛋白、脂多糖、外毒素等成分而制成的疫苗，而基因工程亞單位疫苗則是在其基礎(chǔ)上，利用DNA重組技術(shù)將病原菌的外膜蛋白等組分的基因連接到相應(yīng)載體中，表達(dá)出可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體的蛋白，并將蛋白純化而制成的疫苗。

Khushiramani等［15］以嗜水氣單胞菌外膜蛋白OMPTS為研究對(duì)象，PCR擴(kuò)增目的片段后重組表達(dá)，將純化的蛋白免疫接種印度鯉魚(yú)，夾心ELISA檢測(cè)顯示14 d和28 d抗體效價(jià)滴度分別為1∶4000和1∶12000，由此證實(shí) OMPs具有高度的免疫原性。Khushiramani等［16］從患病魚(yú)體中分離嗜水氣單胞菌，擴(kuò)增出OMP48目的基因片段后對(duì)其進(jìn)行測(cè)序并比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其與維氏氣單胞菌OMP48相似性高達(dá)98%，用純化的蛋白免疫接種鯪魚(yú)，可產(chǎn)生69%的保護(hù)率。WANG等［17］采用魴魚(yú)恢復(fù)期的血清，以雙向電泳和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜方法分離出嗜水氣單胞菌的OMP38蛋白，并將其免疫接種魴魚(yú)后，在注射疫苗后的45 d內(nèi)，魚(yú)體內(nèi)特異性IgM含量和吞噬細(xì)胞活性均呈現(xiàn)較高水平，暗示重組蛋白可用于預(yù)防嗜水氣單胞菌感染。Guan等［18］以氣單胞菌外膜蛋白保守序列OMPG重組表達(dá)的蛋白免疫歐洲鰻鱺，可使歐洲鰻鱺分別對(duì)兩株嗜水氣單胞菌、一株溫和氣單胞菌產(chǎn)生70%、50%與75%的保護(hù)率，這也是首次驗(yàn)證了用同一OMPs疫苗可對(duì)預(yù)防不同種氣單胞菌的感染。

3 核酸疫苗

核酸疫苗又稱(chēng)DNA疫苗，是指將外源基因連接到相應(yīng)質(zhì)粒上，然后將重組質(zhì)粒用基因槍或肌注動(dòng)物體內(nèi)，使外源基因在機(jī)體內(nèi)直接表達(dá)，核酸疫苗可同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的和相對(duì)較持久的免疫應(yīng)答，被稱(chēng)為第三代疫苗。

自1996年第一個(gè)DNA疫苗應(yīng)用于魚(yú)類(lèi)之后，對(duì)水生動(dòng)物的DNA疫苗的研究陸續(xù)展開(kāi)［19-20］，氣單胞菌外膜蛋白DNA疫苗也逐漸有報(bào)道。李盼等［21］為PCR擴(kuò)增嗜水氣單胞菌的外膜蛋白OMP基因，并連接pcDNA3質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染48 h后提取細(xì)胞RNA并進(jìn)行PT-PCR驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)可擴(kuò)增出特異性O(shè)MP片段，以此成功構(gòu)建了嗜水氣單胞菌外膜蛋白的DNA疫苗。Vazquez-Juarez等［22］將氣單胞菌外膜蛋白兩個(gè)重要的基因片段omp38和omp48連入質(zhì)粒中，制成核酸疫苗，免疫接種于斑點(diǎn)虹鱒，在免疫4～6周后感染病原菌，結(jié)果顯示該疫苗可對(duì)虹鱒產(chǎn)生50%～60%的保護(hù)率。

雖然DNA疫苗與傳統(tǒng)疫苗相比具有生產(chǎn)成本低廉，免疫方式簡(jiǎn)單，且易保存等優(yōu)點(diǎn)，然而DNA疫苗的免疫機(jī)制尚待研究中，且相關(guān)報(bào)道較少，目前，尚無(wú)臨床應(yīng)用的報(bào)道。

4 重組活載體疫苗

重組活載體疫苗是指將所編碼的病原菌的特異性目的片段導(dǎo)入到載體質(zhì)粒中，并將重組質(zhì)粒導(dǎo)入到益生菌，以此發(fā)揮免疫效果；活載體疫苗生產(chǎn)成本低，安全性好，且其載體兼具佐劑功能。其中乳酸菌長(zhǎng)期以來(lái)一直用于食品工業(yè)，被認(rèn)為是安全級(jí)微生物，是活載體疫苗常用的載體。

傅羅琴等［23］以乳酸乳球菌為載體，將嗜水氣單胞菌OMPA基因連接到pNZ8048表達(dá)質(zhì)粒后電擊轉(zhuǎn)化到乳酸乳球菌中，將得到的重組乳酸乳球菌口服免疫BALB／c小鼠，一周后用間接ELISA法檢測(cè)血清中免疫球蛋白含量變化，顯示出IgG含量顯著提高，免疫兩周后，嗜水氣單胞菌感染BALB／c小鼠，結(jié)果顯示重組乳酸乳球菌可對(duì)小鼠BALB／c產(chǎn)生87.5%的保護(hù)率。雖然研究結(jié)果證實(shí)活載體疫苗對(duì)哺乳動(dòng)物具有一定的保護(hù)力，但對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物的免疫效果仍需進(jìn)一步探索。

5 魚(yú)類(lèi)基因工程疫苗免疫方式

常見(jiàn)的魚(yú)類(lèi)免疫方法主要包括注射、浸泡以及口服等。而基因工程疫苗如基因工程亞單位疫苗等在試驗(yàn)階段常采用腹腔注射或肌肉注射免疫接種方式，DNA疫苗則以肌肉注射為主；浸泡免疫多為減毒細(xì)菌的免疫，如殺鮭氣單胞菌減毒株可以通過(guò)浸泡免疫魚(yú)而產(chǎn)生保護(hù)作用［24］。

而口服免疫由于抗原可能會(huì)被魚(yú)類(lèi)消化分解，為確?？乖茼樌竭_(dá)吸收部位，研究人員已嘗試對(duì)抗原進(jìn)行包裹以抵抗不良環(huán)境的干擾。而魚(yú)用疫苗的包裹材料要求在包裹抗原時(shí)不但要保證抗原的完整性使其具有良好的免疫原性，還要保證材料在魚(yú)體內(nèi)可自然降解，對(duì)魚(yú)體無(wú)毒副作用，溶解速度快，口味良好等特點(diǎn)，這就要求科研人員在前人研究基礎(chǔ)上，要不斷探索研究新的包裹材料［25-26］。

6 氣單胞菌OMPs基因工程疫苗的不足之處

氣單胞菌的OMPs已被證實(shí)是一種有效的保護(hù)性抗原，未來(lái)在預(yù)防免疫魚(yú)類(lèi)疾病上具有良好的研究?jī)r(jià)值和廣泛的應(yīng)用前景，但將氣單胞菌OMPs基因工程疫苗應(yīng)用到實(shí)踐中，尚需解決如下問(wèn)題：

首先，雖然氣單胞菌OMPs基因工程疫苗已被證實(shí)可誘導(dǎo)魚(yú)體產(chǎn)生特異性抗體，且與傳統(tǒng)疫苗相比其安全性高，穩(wěn)定性強(qiáng)，但也僅限于實(shí)驗(yàn)性研究。對(duì)于特異性抗體水平持續(xù)的時(shí)間，免疫安全水平及免疫的機(jī)理都缺乏更深入的了解；此外，對(duì)基因工程疫苗評(píng)價(jià)體系缺乏相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)，這也阻礙了疫苗商品化的進(jìn)程。

其次，免疫接種途徑有待于進(jìn)一步改善。目前魚(yú)類(lèi)免疫的主要方式以腹腔注射為主，而這種免疫方式并不適用于規(guī)?；B(yǎng)殖，且腹腔注射極易造成魚(yú)體傷害，且影響其生長(zhǎng)；相對(duì)來(lái)說(shuō)口服途徑免疫以更簡(jiǎn)單、方便、安全等優(yōu)點(diǎn)更適用于大規(guī)模魚(yú)群免疫，但由于不同種類(lèi)魚(yú)的消化系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和機(jī)能不盡相同，這要求我們需不斷開(kāi)發(fā)新的包裹材料，使免疫效果達(dá)到最佳。

7 展望

魚(yú)用基因工程疫苗以其在疾病防治上展現(xiàn)的優(yōu)越性得到越來(lái)越多人的關(guān)注與研究。我實(shí)驗(yàn)室已對(duì)不同源性的維氏氣單胞菌OMPs基因序列進(jìn)行了比較分析，同時(shí)在基因工程亞單位疫苗的研究上也取得了一定的進(jìn)展［27-29］，但是氣單胞菌屬包括多種氣單胞菌，且多數(shù)具有致病性，一種氣單胞菌的OMPs基因工程疫苗能否抵御多種氣單胞菌的感染，一種動(dòng)物源性氣單胞菌OMPs基因工程疫苗能否保護(hù)其它動(dòng)物也免受侵害，這都需要進(jìn)一步研究。而筆者認(rèn)為，將不同種的氣單胞菌OMPs基因進(jìn)行融合表達(dá)，不失為一種解決方案。當(dāng)然，隨著對(duì)魚(yú)用疫苗研究的深入與發(fā)展，未來(lái)越來(lái)越多的高效率、高安全性的基因工程疫苗將被研制，并應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，推動(dòng)其健康可持續(xù)發(fā)展。

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