代謝組學(xué)技術(shù)與糖尿病的研究

吳小秋 劉志龍

(廣東省中醫(yī)院珠海醫(yī)院，廣東 珠海 519000)

糖尿病(DM)90%以上是2型糖尿病(T2DM)。根據(jù)國際DM聯(lián)盟(IDF)統(tǒng)計，在2000年全球有DM患者1.51億，估計到2030年有近5億人。我國近年來研究顯示DM患病人群逐年上升〔1～4〕，總DM患病率為9.7%，據(jù)此推算，在我國成年人中DM人數(shù)有9 240萬〔5〕。

1 代謝組學(xué)技術(shù)的概念

代謝組學(xué)指的是單個細(xì)胞、組織、器官或體液中所有小分子代謝物的集合，主要包括基因調(diào)控生物體在代謝過程中形成的中間產(chǎn)物和最終產(chǎn)物，即有機體內(nèi)合成的代謝物便構(gòu)成了代謝組，是關(guān)于生物體系內(nèi)源代謝物質(zhì)種類、數(shù)量及其變化規(guī)律的科學(xué)。它研究的是生物整體、系統(tǒng)或器官的內(nèi)源性代謝物質(zhì)及其與所受內(nèi)在或外在因素影響的關(guān)系〔6〕；是運用多元統(tǒng)計學(xué)和模式識別技術(shù)，對細(xì)胞或有機體中由于擾動作用而引起的代謝物變化進(jìn)行全面系統(tǒng)研究的學(xué)科，常運用的技術(shù)包括磁共振、高效液相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)〔7〕。

2 代謝組學(xué)技術(shù)在DM領(lǐng)域研究的可行性

DM是一組以長期高血糖為主要特征的代謝綜合征，由于胰島素缺乏和(或)胰島素生物作用障礙導(dǎo)致糖代謝紊亂，同時伴有脂肪、蛋白質(zhì)、水、電解質(zhì)等代謝障礙〔8〕。而代謝組學(xué)通過對DM生物樣品的代謝譜分析，獲得內(nèi)源性代謝產(chǎn)物的信息，從而找到可以反映DM的病理和發(fā)展進(jìn)程的生物標(biāo)記物〔7〕。代謝組學(xué)技術(shù)如何運用于DM研究？首先，代謝組學(xué)的研究對象代謝產(chǎn)物組是基因和蛋白表達(dá)的終端產(chǎn)物，是判斷健康、疾病和治療效果的分子集合，反映的是基因、環(huán)境、致病因素、營養(yǎng)、藥物、時間等諸多因素綜合作用于機體后的總反應(yīng)；另一方面，DM是一種內(nèi)分泌代謝紊亂性疾病，通常表現(xiàn)的是整體的代謝紊亂，傳統(tǒng)的研究方法只能從單個或幾個大分子成分闡述糖尿病，對DM的早期診斷及病因病機研究困難較大。代謝組學(xué)技術(shù)主要測定生物體液(如血液、尿液)、細(xì)胞提取物和組織或者組織提取液中所有分子量小于1 000 kD的小分子代謝物組信息，揭示的是系列關(guān)聯(lián)生物標(biāo)記物的綜合差異，可從整體上全面分析疾病對生物系統(tǒng)的影響，要比傳統(tǒng)依賴單一標(biāo)志物的診斷方法具有更高的準(zhǔn)確性〔9〕。因此，以生物體液為研究對象的代謝組學(xué)技術(shù)將對DM的整體性研究有直接意義〔10，11〕。

3 研究現(xiàn)狀

3.1代謝產(chǎn)物的研究 當(dāng)前代謝組學(xué)研究中存在兩個難點同時也是熱點問題：一是代謝產(chǎn)物的定性、定量分析，二是代謝產(chǎn)物復(fù)雜數(shù)據(jù)分析體系中有用信息的提取和挖掘。而DM的研究也正是從這個問題出發(fā)。目前在DM代謝產(chǎn)物分析方面，臨床與實驗研究已作了初步探討，找到部分代謝產(chǎn)物作為參考。如利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法中的多元分辨和模式識別方法，對T2DM及相關(guān)疾病患者血漿中的脂肪酸代謝譜進(jìn)行了全面、細(xì)致的研究，篩選出3個潛在的生物標(biāo)記物：油酸、α-亞麻酸和二十碳五烯酸〔12〕。代謝產(chǎn)物的篩選為DM的臨床診斷和評價治療效果具有非常重要的意義。另一項研究在對DM的氨基酸代謝譜研究方面發(fā)現(xiàn)有7種氨基酸(Arg、Cit、Asp、Asn、Thr、Leu、Trp)與DM相關(guān)，可作為反映血糖值高低變化的標(biāo)志物組，對于DM的早期診斷及深入研究具有潛在的科研及臨床價值〔13〕。而在研究初診DM患者代謝產(chǎn)物時發(fā)現(xiàn)，初診DM患者主要代謝產(chǎn)物差異主要為游離脂肪酸、溶血磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、鞘磷脂和磷脂酰膽堿等〔14〕。

除了運用氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)研究代謝組學(xué)產(chǎn)物方面，還可利用磁共振技術(shù)。如在探討腎虛痰瘀型T2DM患者血清代謝變化及發(fā)生機制時發(fā)現(xiàn)，血清中多種氨基酸如異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、谷氨酸、組氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、1-甲基組氨酸顯著降低，而且乳酸、檸檬酸、肌酸及肌酸酐也較健康人顯著降低，同時腎虛痰瘀型T2DM患者血清中α-葡萄糖及β-葡萄糖較健康人增加，為腎虛痰瘀型T2DM患者代謝產(chǎn)物作了初步研究〔15〕。而在糖尿病患者中醫(yī)氣虛和氣陰兩虛方面的研究中，找到了花生四烯酸和油酸這兩種可作為虛證重要信息的潛在標(biāo)志物〔16〕。以上研究結(jié)果提示，T2DM的代謝產(chǎn)物參與了DM的代謝。因此對T2DM的代謝產(chǎn)物通過運用代謝組學(xué)技術(shù)分析有助于DM早期診斷及用藥療效評價。

3.2實驗研究 通過運用磁共振的代謝組學(xué)方法檢測鏈脲霉素誘導(dǎo)DM模型大鼠的尿液、血清及肝臟提取物，發(fā)現(xiàn)3種小分子代謝物甘油三酸酯、脂肪酸和乙酰乙酸的含量變化具有顯著性差異，這3種小分子物質(zhì)可能成為DM診斷的潛在生物標(biāo)記物，為深入分析DM的小分子發(fā)病機制作了初步的探討〔10，17〕。而在探討甲基蓮心堿對T2DM模型大鼠尿液的代謝產(chǎn)物的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)甲基蓮心堿處理組大鼠空腹血糖較DM模型組降低，且發(fā)現(xiàn)基蓮心堿處理組大鼠代謝產(chǎn)物中二羥延胡索酸下降，前列腺素I2、脂氧素A4、脂氧素B4升高〔18〕。

在另一項實驗研究中通過運用氯甲酸乙酯(ECF)衍生和氣相色譜-質(zhì)譜檢測聯(lián)用發(fā)現(xiàn)T2DM大鼠尿液代謝譜主要有10個生物學(xué)標(biāo)記物(琥珀酸、亮氨酸、異亮氨酸、醋酸、丙氨酸、對羥基苯乙酸、檸檬酸鹽、馬尿酸、甘氨酸、丙酸)〔19〕。在研究黃連治療T2DM的機制時發(fā)現(xiàn)，T2DM大鼠發(fā)現(xiàn)12個差異代謝物顯著上升；給藥黃連后，其中的4個代謝物中苯甲酸、氨基丙二酸、丁四醇、核糖酸的相對含量顯著下降；3個代謝物2，3-二羥基丁酸、L-抗壞血酸、3-羥基己二酸的相對含量顯著上升〔20〕。在DM代謝組學(xué)與中醫(yī)證候方面的研究中，發(fā)現(xiàn)DM腎陰虛證大鼠血液的代謝組學(xué)變化主要有甘氨酸、乳酸、尿素、D-葡萄糖、葡萄糖、半乳糖含量均顯著升高〔21〕；而其在另一DM腎陰虛證尿液的代謝表型的實驗研究方面，發(fā)現(xiàn)尿液中包含的甘氨酸、琥珀酸含量顯著升高，十六烷酸、膽固醇含量顯著下降〔22〕。

3.3臨床研究 在研究交泰丸對T2DM的代謝產(chǎn)物時發(fā)現(xiàn)，T2DM患者葡萄糖、糖蛋白、低密度脂蛋白、β-羥丁酸、乙酰乙酸、丙酮酸、肌氨酸酐、甘氨酸較高；乳酸、氨基乙磺酸、琥珀酸、檸檬酸、谷氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、纈氨酸較低，經(jīng)交泰丸治療后葡萄糖、糖蛋白、低密度脂蛋白、β-羥丁酸、乙酰乙酸、丙酮酸較低；琥珀酸、檸檬酸、谷氨酸、丙氨酸、蛋氨酸、纈氨酸較高〔23〕。而在觀察絡(luò)沙坦治療DM代謝產(chǎn)物時結(jié)果提示葡萄糖醇和肌醇等代謝物發(fā)生變化，為臨床早期判斷藥物療效提供思路〔24〕。

3.4DM并發(fā)癥的代謝組學(xué)研究 并發(fā)癥主要有DM血管病變、神經(jīng)病變等。目前代謝組學(xué)在DM慢性并發(fā)癥的研究中較多的主要是DM腎病(DN)。在DM的代謝組學(xué)實驗研究中，通過運用磁共振技術(shù)分析DM小鼠血漿中的小分子代謝物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血漿中葡萄糖和氧化三甲胺的含量升高，多種氨基酸含量下降，實驗研究結(jié)果為臨床診斷及機制研究提供新思路〔25〕。而在另一項DN的實驗研究中發(fā)現(xiàn)，DN大鼠腎皮質(zhì)中出現(xiàn)了明顯的脂質(zhì)代謝異常：多種磷脂(PC、PE、SM)含量明顯降低，而甘油三酯含量明顯上升，證明這些代謝物相關(guān)代謝途徑的異?？赡芘cDN的進(jìn)展密切相關(guān)〔26〕。在T2DM小鼠模型中研究腎臟代謝表型的變化發(fā)現(xiàn)，乳酸和糖等代謝物的含量顯著升高，而谷氨酸、乙酸、膽堿和甘氨酸的含量顯著降低〔27〕。

在臨床方面，于歡等〔28〕通過運用超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜方法，分析DN患者血漿代謝物變化差異，發(fā)現(xiàn)磷脂代謝、脂肪酸代謝、氨基酸代謝、嘌呤嘧啶代謝、固醇類代謝等多個代謝途徑發(fā)生變化，并證明糖腎方可糾正以上代謝產(chǎn)物的變化。在比較正常人、T2DM患者、DN患者3個人群的晨尿，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DM患者較健康對照組尿中代謝產(chǎn)物如赤蘚糖醇、2，3，4，5-四羥基戊酸、D-果糖、木糖醇、D-半乳糖，戊糖醇顯著增加；DN尿中代謝代謝產(chǎn)物如赤蘚糖醇、2，3，4，5-四羥基戊酸、D-果糖、木糖醇、2，3-二羥苯丙酸、葡糖醛酮、D-呋喃核糖較健康對照組顯著增加〔29〕。

4 研究展望

代謝組學(xué)技術(shù)作為后基因時代的一項新的技術(shù)，屬于系統(tǒng)生物學(xué)一個分支。雖然到目前為止代謝組學(xué)技術(shù)的臨床、實驗研究尚不如基因、蛋白質(zhì)組學(xué)研究，但其最大的優(yōu)勢在于可全景監(jiān)測小分子代謝終端產(chǎn)物的變化，在疾病研究方面有極大可開發(fā)性。而這正符合DM作為一種內(nèi)分泌代謝疾病的特點〔10〕。

針對目前研究現(xiàn)狀，代謝組學(xué)技術(shù)的研究尚存在不少困難，主要有：①代謝產(chǎn)物的多樣性。在DM的前期實驗與臨床研究中，不乏發(fā)現(xiàn)其代謝產(chǎn)物多樣，且同一疾病在不同實驗條件、對象下的代謝產(chǎn)物均可能不統(tǒng)一，給最終結(jié)果帶來不確實性，因此實驗、臨床研究可重復(fù)性尚不確定；②代謝組學(xué)技術(shù)要求較高。目前我國代謝組學(xué)研究尚屬起步階段，技術(shù)不十分成熟，且對技術(shù)要求較高，僅有為數(shù)不多的科研機構(gòu)有相關(guān)的技術(shù)人員配備；③臨床研究較少。目前代謝組學(xué)技術(shù)剛剛起步不久，主要是實驗室研究，而臨床研究較少，尚不能充分為臨床服務(wù)，解決臨床實際問題；且在DM的研究中主要側(cè)重于T2DM，而對1型糖尿病的研究較少；④研究方法多樣。目前主要應(yīng)用于代謝組學(xué)的方法有磁共振、高效液相色譜和氣相色譜-質(zhì)譜技術(shù)。這些技術(shù)在檢測中互為補充，但均不能替代。因此尋找高通量、高分辨率的分析檢測技術(shù)是一個重要問題。

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