阿爾茨海默病動物模型的研究進(jìn)展

薛小燕 吳君偉 郭小華 李 敏 羅煥敏

(贛州市人民醫(yī)院藥劑科，江西 贛州 341000)

阿爾茨海默病(AD)是以漸進(jìn)性認(rèn)知功能損害為特征的多病因病或臨床綜合征，有其特征性的神經(jīng)病理，其病因與發(fā)病機制非常復(fù)雜。目前還沒有一個完全具備AD所有特征的理想動物模型。理想的AD動物模型應(yīng)具備以下3個方面的特征：①具備AD主要的神經(jīng)病理學(xué)特征-老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)和神經(jīng)元及突觸丟失；②具備炎癥、星形膠質(zhì)細(xì)胞增生等其他AD病理特征；③出現(xiàn)記憶和認(rèn)知功能障礙。如果一種模型能同時符合以上3個方面的特征，那將是一種完美的AD動物模型。目前AD動物模型的種類有很多，但大多只模擬出AD的一部分特征，難以完全模擬出AD所有特征。本文主要綜述了AD的動物模型，以期為該類疾病研究和診治提供新思路。

1 以衰老為基礎(chǔ)的AD動物模型

衰老可能與氧自由基對細(xì)胞的損害有關(guān)，也可能是細(xì)胞線粒體功能障礙引起能量障礙所致，還有可能與某個控制衰老的基因有關(guān)。如果能了解衰老的機制，那也就從另一方面了解到衰老促使AD更容易發(fā)生的機制了。此類模型就是以衰老作為AD的發(fā)病基礎(chǔ)，通過各種方法促進(jìn)動物衰老(包括自然衰老)來達(dá)到制作AD動物模型的目的。

1.1自然衰老認(rèn)知障礙動物模型 通過動物本身的自然衰老來獲得的AD動物模型，包括老齡大鼠、小鼠及猴等。這類模型的認(rèn)知障礙等改變是自然發(fā)生的，較其他動物模型更貼近AD的真實病理生理改變。但老齡動物難以大量獲得，容易死亡，并不能保證每一只老齡動物都具備AD的特征。

1.2快速老化小鼠(SAM)模型 竹田俊男〔1〕通過對AKR/J自然變異小鼠進(jìn)行近交延代培養(yǎng)得到一種自然快速老化小鼠。該家族諸多品系中的SAM P/8和SAM P/10表現(xiàn)出明顯的學(xué)習(xí)記憶功能減退、神經(jīng)遞質(zhì)和自由基代謝改變等，常用于AD動物模型。

1.3D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性衰老模型 采用D-半乳糖注射大鼠或小鼠誘導(dǎo)其亞急性衰老。動物表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶力障礙、毛發(fā)稀疏、行動遲緩等老化征象。大腦中神經(jīng)元丟失，神經(jīng)元中細(xì)胞器減少，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)脫顆粒，蛋白質(zhì)合成減少，線粒體增大呈現(xiàn)空泡樣變性，這些病理變化與自然衰老動物的表現(xiàn)相似〔2〕。

2 以膽堿能學(xué)說為基礎(chǔ)的AD動物模型

在哺乳動物腦內(nèi)，基底前腦Meynert 基底核(NBM)是膽堿能神經(jīng)元存在的主要部位，大腦皮質(zhì)和海馬中的膽堿能投射纖維70%來自于NBM。根據(jù)AD發(fā)病的膽堿能損傷學(xué)說，參照動物腦立體定位圖譜，通過定位注射損毀此區(qū)域來制備基底前腦膽堿能系統(tǒng)損傷的AD模型。

2.1電損毀、外科損毀 通過對動物進(jìn)行手術(shù)，用電灼傷的方法損毀NBM，外科手術(shù)切斷海馬穹隆傘。手術(shù)后動物出現(xiàn)了學(xué)習(xí)和記憶功能障礙，但病理上未出現(xiàn)SP和NFT，且這種方法損毀范圍較大，目前已基本不采用〔3〕。

2.2化學(xué)損毀 通過立體定位注射的方法，將興奮性氨基酸如鵝膏蕈氨酸(IBO)、海仁酸(KA)、使君子酸(QA)和谷氨酸等注入動物的基底前腦NBM，建立膽堿能損傷的AD模型，動物有記憶功能障礙，但并不出現(xiàn)SP和NFT病理改變〔4〕。

3 以AD發(fā)病的遺傳學(xué)為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)基因動物模型

人們發(fā)現(xiàn)FAD基因突變的同時，便開始借助新出現(xiàn)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將人類突變的外源性基因轉(zhuǎn)入動物體內(nèi)來制備轉(zhuǎn)基因動物模型，這已成為AD動物模型制作中一個比較常用的方法。該方法將FAD相關(guān)的突變基因轉(zhuǎn)入動物中，并使外源性基因穩(wěn)定遺傳，改變動物遺傳學(xué)性狀，達(dá)到在動物體內(nèi)模擬人類FAD遺傳學(xué)特征的目的。

轉(zhuǎn)基因動物可在體內(nèi)研究某一特定致病基因的作用，是研究AD獨特而重要的模型。轉(zhuǎn)基因動物分為兩類：第一類是含有無效基因的小鼠-基因敲除鼠，通常用于了解敲除的基因在AD發(fā)病中的功能，與此同時可以再插入相關(guān)的人類突變型基因，以避免內(nèi)源性小鼠基因可能的干擾作用；第二類是AD轉(zhuǎn)基因小鼠，能表達(dá)AD的突變基因，表現(xiàn)出相關(guān)AD表型的病理學(xué)特征，通過對已存在的AD轉(zhuǎn)基因小鼠相互雜交，可以附加額外的基因來創(chuàng)造轉(zhuǎn)雙基因或轉(zhuǎn)多基因小鼠?；谶z傳背景、繁殖能力、操作難度、經(jīng)濟方面等考慮，轉(zhuǎn)基因動物多選用小鼠?，F(xiàn)有多種轉(zhuǎn)基因小鼠均可表達(dá)與AD發(fā)病相關(guān)的基因，如APP、PS1、PS2等。

3.1轉(zhuǎn)APP和PS基因小鼠 FAD中已發(fā)現(xiàn)了3個基因的突變能導(dǎo)致AD，即APP、PS1和PS2基因。該類模型是在建立FAD基因突變導(dǎo)致AD發(fā)病的遺傳學(xué)基礎(chǔ)上，將外源性APP和PS基因(野生或突變型)導(dǎo)入，使其在染色體基因組中穩(wěn)定表達(dá)，并遺傳給后代。動物過多地表達(dá)APP和PS基因或其突變基因產(chǎn)物，會引起Aβ沉積等相關(guān)病理損害和行為學(xué)上的改變。AD轉(zhuǎn)基因動物模型發(fā)展非常迅速，各種報道層出不窮，其主要特征有以下幾個方面。

3.1.1Aβ沉積 轉(zhuǎn)基因小鼠過度表達(dá)FAD的APP、PS1和PS2等位基因能提高大腦Aβ水平。表達(dá)FAD突變型APP基因的轉(zhuǎn)基因鼠系已建立，能產(chǎn)生纖維淀粉特性的SP。過度表達(dá)PS1突變型基因小鼠大腦中的Aβ42的水平大約比表達(dá)PS1野生型小鼠的Aβ42要高30%，而Aβ40水平卻沒有顯著性差異。這些數(shù)據(jù)與PS1突變的FAD中觀察到的Aβ42水平增加的結(jié)果相吻合〔5〕。轉(zhuǎn)突變型PS2基因的小鼠大腦Aβ42水平也比轉(zhuǎn)野生型PS2基因的小鼠更高。然而，在轉(zhuǎn)PS1和PS2突變型基因小鼠中卻沒有出現(xiàn)關(guān)于Aβ沉積的報道，這可能歸因于在這些小鼠中產(chǎn)生的Aβ(小鼠內(nèi)源性Aβ)與人類Aβ在第3氨基酸殘基不同，嚙齒類動物Aβ在體外不像人類Aβ那樣具有淀粉源性，并且轉(zhuǎn)基因小鼠過多的制造鼠源Aβ顯示出與人類Aβ共同的免疫反應(yīng)而當(dāng)成彌散性沉積。為檢測突變型PS1基因?qū)D(zhuǎn)基因鼠中人類APP代謝的影響，幾個研究小組建立轉(zhuǎn)雙基因小鼠，同時表達(dá)PS1和APP基因的小鼠顯示出加速的淀粉樣沉積〔6，7〕。這些體內(nèi)實驗結(jié)果證實突變型PS1能影響APP的代謝過程，與體外轉(zhuǎn)基因細(xì)胞實驗結(jié)果相一致。這些研究表明，轉(zhuǎn)突變型PS基因鼠和轉(zhuǎn) APP基因鼠相雜交生成的轉(zhuǎn)雙基鼠提供了腦內(nèi)Aβ沉積最快形成的途徑。

3.1.2膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生 膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生已在一些小鼠模型中報道。在轉(zhuǎn)APP基因小鼠中報道膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)染色陽性的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生，用細(xì)胞形態(tài)學(xué)方法檢測到小膠質(zhì)細(xì)胞增生以及軸突的異常改變，但僅僅是在那些含有剛果紅染色陽性斑的小鼠才檢測到炎性反應(yīng)。在PS1和APP雙轉(zhuǎn)基因小鼠中，使用針對GFAP的抗體能檢測到反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞包圍著Aβ沉積。以上研究表明膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性增生似乎與Aβ沉積相關(guān)。

3.1.3記憶障礙 小鼠的行為學(xué)研究中，Morris 水迷宮經(jīng)常用于檢測小鼠空間參考記憶，Y迷宮常用于檢測空間近期記憶，而放射狀迷宮常用于檢測空間工作記憶。采用這些測試方法，在轉(zhuǎn)APP基因小鼠上發(fā)現(xiàn)其有學(xué)習(xí)和記憶障礙。Tg257小鼠在10月齡時，與對照的非轉(zhuǎn)基因小鼠相比，在Y迷宮和Morris水迷宮測試中顯示出成績明顯下降，行為學(xué)障礙在6～12月齡時變得明顯起來〔8〕。表明認(rèn)知的損害是由于APP的過度表達(dá)所引起，而此時卻沒有出現(xiàn)淀粉樣沉積。這表明轉(zhuǎn)基因小鼠在Morris水迷宮和Y迷宮所表現(xiàn)出的認(rèn)知功能下降發(fā)生在淀粉樣沉積病理以前。

3.1.4其他病理改變 神經(jīng)元和突觸的丟失是AD的主要病理特征之一。神經(jīng)元的丟失可發(fā)生在SP附近區(qū)域，這已在PDAPP小鼠中報道過。然而對18月齡PDAPP小鼠的立體測量學(xué)研究表明，其皮質(zhì)、海馬等有老年斑的區(qū)域沒有顯示出明顯的神經(jīng)元丟失，突觸素、MAP-2、細(xì)胞色素氧化酶-2和細(xì)胞色素氧化酶-4的水平?jīng)]有減少，而GFAP水平卻明顯增加〔9〕。對9、12月齡的轉(zhuǎn)PS1基因小鼠的研究表明，其皮質(zhì)和海馬的神經(jīng)元數(shù)量沒有明顯的減少。至今沒有報道表明轉(zhuǎn)PS1和APP雙基因小鼠中出現(xiàn)有神經(jīng)元丟失的病理改變。在過度表達(dá)PS1和APP基因小鼠中，采用銀染的方法對轉(zhuǎn)基因小鼠已存在的神經(jīng)纖維進(jìn)行分析，沒有檢測到NFT的病理改變。

3.2轉(zhuǎn)tau基因動物模型 AD中由tau聚集形成的NFT在一些情況下與那些普通神經(jīng)變性疾病中的NFT難以區(qū)別，NFT也存在于一些不含SP的神經(jīng)退行性疾病，如Pick病、漸進(jìn)性核上性麻痹、皮質(zhì)基底退行性疾病和17號染色體相聯(lián)帕金森額顳葉癡呆(FTDP-17)。這些疾病中的NFT分布有自己的特點，不像AD中的NFT只發(fā)生于神經(jīng)元內(nèi)，這些疾病中的NFT還分布于膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)。到目前為止，在AD病人中并未發(fā)現(xiàn)tau基因的異常改變，而在FTDP-17中卻發(fā)現(xiàn)了具有致病的tau基因突變。已發(fā)現(xiàn)與FTDP-17發(fā)病相關(guān)的tau基因有3個突變位點，它們分別是P301L、V337M和G272V。

將人類FTDP-17突變tau基因?qū)胄∈笾?，進(jìn)行表達(dá)制作轉(zhuǎn)基因小鼠。人類tau基因與突變型tau基因在鼠PrP啟動子控制下，在JNPL3鼠系中得到表達(dá)。該小鼠生長到10月齡大時，90%的小鼠產(chǎn)生了運動和行為學(xué)紊亂，出現(xiàn)延遲的翻正反應(yīng)并且不能進(jìn)入直立狀態(tài)。在出現(xiàn)癥狀2 w以內(nèi)，衰退擴展到所有的肢體，JNPL3小鼠幾乎不能移動，出現(xiàn)張力障礙性體態(tài)。這些小鼠體重減輕，梳理、發(fā)音和睜眼變得困難起來。而這些運動障礙使得這些小鼠不能在Morris游泳航行實驗中進(jìn)行測試。腦干、端腦和間腦中出現(xiàn)膠質(zhì)細(xì)胞增生，脊髓有48%的運動神經(jīng)元減少。通過剛果紅、Bielschowsky和Bodian銀染方法，在腦干、間腦、小腦和脊髓證實有NFT的形成〔10〕。

4 以AD發(fā)病的環(huán)境因素為基礎(chǔ)的動物模型

散發(fā)性AD患者在遺傳學(xué)上找不到任何線索，外界環(huán)境危險因素在AD發(fā)病中起重要作用。目前只有鋁元素與AD發(fā)病的關(guān)系研究比較多，并以此建立了鋁元素慢性中毒的AD動物模型。錢亦華等〔11〕用AlCl3灌胃大鼠3個月建立AD大鼠模型，通過免疫組化的方法，發(fā)現(xiàn)其背海馬結(jié)構(gòu)內(nèi)各部分均可見較多Aβ樣免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元，雖未有SP的形成，已說明鋁引起Aβ在神經(jīng)元內(nèi)產(chǎn)生增多。鋁引起Aβ在神經(jīng)元內(nèi)沉積的機制可能與鋁元素引起APP過度表達(dá)、Aβ過多的產(chǎn)生及鋁元素促進(jìn)糖基與Aβ定位連接有關(guān)。

多重復(fù)制AD模型，是在現(xiàn)有模型的基礎(chǔ)上，綜合兩種或兩種以上模型方法獲得的一種復(fù)合模型。這類模型可以綜合獲得各種已有模型的特點，符合AD的多因素發(fā)病機制。本實驗室采用D-半乳糖和AlCl3合并制備AD小鼠模型，該模型呈現(xiàn)了整體衰老、學(xué)習(xí)記憶功能下降、膽堿能系統(tǒng)功能減退、腦組織APP、PS1、BACE基因表達(dá)明顯增強，腦組織出現(xiàn)Aβ沉積并有類SP形成，成功地模擬了AD的發(fā)病及病理特征〔12〕。該模型的制作方法簡單，造價低廉，適合大規(guī)模藥物篩選。就現(xiàn)有的AD動物模型而言，由于沒有一個完全模擬出所有AD特征的動物模型，單一模型只模擬出AD部分病理改變。通過各種單一模型制作方法相復(fù)合的方法，模擬AD復(fù)雜病因，綜合各種模型的特征，制作多重復(fù)制AD模型是一個比較實際而又省力的途徑。

5 腎虛型AD動物模型

宋彩梅等〔13〕通過皮下注射氫化可的松15 mg/kg，注射30 d造成腎虛證小鼠模型；再通過皮下注射氫化可的松15 mg/kg復(fù)合側(cè)腦室注射Aβ25～356 μg/只，在側(cè)腦室注射后10 d和20 d時均可造成腎虛型老年癡呆小鼠模型。

6 其他模擬出AD部分特征的動物模型

岡田酸(OA)損害模型：OA可以選擇性抑制絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酯酶1A和2A，能引起大鼠腦內(nèi)出現(xiàn)類似AD雙螺旋絲樣磷酸化tau病理改變〔14〕。

Aβ?lián)p害模型：該模型基于Aβ的神經(jīng)毒性作用，采用立體定位注射的方法。20世紀(jì)90年代起不斷有報道將Aβ注射入動物大腦可引起神經(jīng)毒性反應(yīng)，產(chǎn)生記憶受損和行為學(xué)障礙〔15〕。楊曉娟等〔16〕采用大鼠側(cè)腦室內(nèi)一次性注射5 μl聚集態(tài)Aβ25～35，建立復(fù)合式AD大鼠模型。

腦缺血動物模型：人腦的供氧系統(tǒng)對大腦有著重要的保護作用，缺血缺氧首先影響腦的正常功能，此時極易出現(xiàn)智力障礙。通常老年動物的腦血流量較成年動物減少20%以上。制作老年動物慢性腦缺血的模型，可以產(chǎn)生類似AD的病理生理改變〔17〕。

羅煥敏等〔18〕選用NIH小鼠，腹腔注射D-半乳糖120 mg/kg和亞硝酸鈉90 mg/kg，每天1次，連續(xù)60 d，制備AD動物模型。

7 結(jié) 語

綜上所述，AD動物模型可分非轉(zhuǎn)基因模型和轉(zhuǎn)基因模型兩大類。非轉(zhuǎn)基因模型中，大部分AD模型只針對疾病某一方面的因素來制作AD模型，種類比較多，表現(xiàn)有空間學(xué)習(xí)記憶功能的衰退，大多針對AD病理的某一方面，相比AD錯綜復(fù)雜的病理過程來說有一定的差距，更重要的是缺乏AD腦內(nèi)特征性的病理改變。非轉(zhuǎn)基因模型的優(yōu)點是其制作方法相對簡單，成本低廉，重復(fù)性和穩(wěn)定性較好，適合大規(guī)模藥物篩選，多重復(fù)制AD模型能更好地模擬出AD多病因的綜合作用，基本具備了AD的病理特征，是一個較好的AD模型。

轉(zhuǎn)基因動物模型是AD模型中的一個熱點〔19〕，小鼠中構(gòu)建AD致病基因的轉(zhuǎn)基因動物在AD動物模型研究方面前進(jìn)了一大步。轉(zhuǎn)基因小鼠在遺傳學(xué)上模擬了AD的發(fā)病，出現(xiàn)了許多AD病理學(xué)特征的改變，包括細(xì)胞外Aβ的沉積、SP和NFT等，部分轉(zhuǎn)基因小鼠還出現(xiàn)了炎性反應(yīng)的改變。盡管疾病的一些重要標(biāo)志物，如Aβ沉積和老年斑已在AD小鼠中出現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因小鼠也不能完全模擬出人類AD中觀察到的所有特征。現(xiàn)在仍有爭論是否這些小鼠能顯示出AD其他的一些明顯而重要的特征，包括突觸數(shù)量的減少和神經(jīng)元的丟失。這是由于AD的進(jìn)程中可能包括各種不同病理途徑的復(fù)雜相互作用，而非單一致病基因影響。APP的過度表達(dá)產(chǎn)生的作用可能在轉(zhuǎn)基因鼠中是一個模糊的部分，因為在一些APP基因過度表達(dá)的小鼠中缺乏神經(jīng)元丟失的特征，其原因可能是由于增加的APP，APP及其他代謝產(chǎn)物同樣有生理或病理作用，如導(dǎo)致有神經(jīng)營養(yǎng)作用的sAPPα生片的增加。產(chǎn)生的APPα能阻止細(xì)胞的死亡。另外，轉(zhuǎn)APP基因小鼠中NFT的缺乏、受限或者沒有神經(jīng)元、突觸的丟失也不能正確反映AD大腦中所發(fā)生的病理。因此，可制作新的AD轉(zhuǎn)基因小鼠，如通過雜交使小鼠具備AD各種各樣的基因突變。可以將轉(zhuǎn)APP基因鼠與轉(zhuǎn)FTDP-17的突變型tau基因鼠進(jìn)行雜交，以獲得同時具備SP和NFT兩種特征的AD模型。FTDP-17在tau基因上發(fā)現(xiàn)了突變，值得注意的是FTDP-17病人的大腦并不出現(xiàn)Aβ沉積，但表現(xiàn)出tau的各種病理形式，包括主要的tau病理改變-NFT。由于多數(shù)AD患者是散發(fā)性的，并沒有出現(xiàn)遺傳學(xué)上的基因突變，只有不到10%的AD患者具有家族性，而其中一些病人也未能發(fā)現(xiàn)基因突變，轉(zhuǎn)基因動物模型能模擬出AD發(fā)病的遺傳學(xué)因素，不能代表人類AD的其他發(fā)病類型，特別是晚期發(fā)病的AD形式。

發(fā)現(xiàn)有效治療AD的化合物必須依賴一個可靠而精確的、能最大限度模擬AD特征的動物模型。遺傳學(xué)研究提供了AD致病基因而使其能設(shè)計和制造新的轉(zhuǎn)基因小鼠。將兩種轉(zhuǎn)基因動物模型雜交制備一個既有SP又有NFT特征的動物模型或在轉(zhuǎn)基因動物模型的基礎(chǔ)上用藥物的方法去產(chǎn)生某一方面的病理變化而產(chǎn)生的模型將是模型研究的良好方向。APP/PS突變小鼠與tau突變小鼠雜交所出現(xiàn)的表型將是一個具備兩大病理特征的模型，或許有良好的前景。除了使用轉(zhuǎn)多基因的小鼠來加速和增加模型小鼠的病理改變外，其他提高和改善AD轉(zhuǎn)基因動物模型的策略包括使用藥物或特殊神經(jīng)解剖損傷來加重或削弱某個神經(jīng)病理特征，或?qū)⒁恍┓寝D(zhuǎn)基因模型中使用的干擾因素加入到轉(zhuǎn)基因模型中，可能會改善和提高轉(zhuǎn)基因動物模型。另外，一些轉(zhuǎn)基因制作時的實驗參數(shù)，如基因構(gòu)建和鼠系的差異同樣也影響轉(zhuǎn)基因鼠的表型。轉(zhuǎn)同樣基因的小鼠，不同的鼠系影響其表型，鼠系的背景對于每一個在研的轉(zhuǎn)基因小鼠都應(yīng)仔細(xì)研究。通過不同實驗室的努力和合作，使鼠系恢復(fù)到同一標(biāo)準(zhǔn)的基因背景下，并采用相同的方法分析，建立一個標(biāo)準(zhǔn)的轉(zhuǎn)基因動物模型，以避免鼠遺傳背景對其表型的影響。在更可靠、更精確的動物模型出現(xiàn)以前，就現(xiàn)有AD動物模型而言，用一種或兩種比較接近AD的動物模型同時進(jìn)行藥物篩選或許比用單一模型來篩選藥物更具說服力，也更進(jìn)一步證實藥物的有效性。不同的單一模型雖只模擬部分病理改變，但可以根據(jù)模型發(fā)生的病理改變來針對不同作用靶標(biāo)和機制進(jìn)行藥物篩選，更快地找到有效藥物，這樣能較快將藥物推向臨床。

總之，有效而完善的AD動物模型將有助于AD的研究，將極大提高藥物篩選的有效性。由于人和動物之間存在著差異，即便某個AD動物模型完全具備了人類AD的所有特征，最大限度模擬了AD，采用AD模型篩選到的有效藥物是否對AD病人有治療作用，最終要通過臨床試驗予以確認(rèn)，才能予以應(yīng)用。

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