基于實時細胞分析的化合物48／80誘導(dǎo)肥大細胞脫顆粒評價研究

王 曼，莊朋偉，周會芳，王詩羽，崔廣智，張艷軍

（天津中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，天津 300193）

藥物引起的過敏／類過敏反應(yīng)是臨床常見的不良反應(yīng)之一。傳統(tǒng)的過敏／類過敏反應(yīng)評價方法多選用豚鼠，通過考察給藥后豚鼠出現(xiàn)的噴嚏、抓鼻、呼吸困難、抽搐昏倒或死亡等現(xiàn)象，以判斷藥物是否可以引起過敏／類過敏反應(yīng)［1］，存在實驗周期性長、靈敏度低、誤差大等缺點。大量研究表明［2］，藥物作用于肥大細胞，激活并釋放活性介質(zhì)是引發(fā)過敏／類過敏反應(yīng)的直接原因。因此，體外檢測肥大細胞脫顆?？梢苑从乘幬锸欠窨梢砸疬^敏／類過敏反應(yīng)。

嗜堿性白血病細胞（RBL-2H3）具有肥大細胞的許多生物學(xué)特性，RBL-2H3被認為是體外檢測脫顆粒反應(yīng)的最佳模型［3］。

傳統(tǒng)脫顆粒檢測方法多需輔助外界染色劑或標記物來檢測肥大細胞脫顆粒釋放的物質(zhì)［4－6］，且很難在活細胞的狀態(tài)下觀察脫顆?，F(xiàn)象。細胞脫顆粒時伴隨細胞形態(tài)的改變，xCELLigence實時細胞分析系統(tǒng)（real-time cell electronic sensing，RT-CES），可以檢測到電極板中細胞形態(tài)的變化，以細胞指數(shù)（cell index，CI）的形式顯示［7］。本研究利用 RTCES系統(tǒng)，實時、快速、敏感的監(jiān)測細胞發(fā)生脫顆粒的過程，初步建立了一種新的肥大細胞脫顆粒體外檢測技術(shù)，為體外類過敏反應(yīng)快速評價提供了一種新的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 細胞 RBL-2H3，購自于中國科學(xué)院細胞庫，DMEM常規(guī)培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑及儀器 DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國，批號：8112118），胎牛血清（天津市中奧天原生物制品有限公司），0.25%胰酶（吉諾生物醫(yī)藥有限公司，批號：07121103），Compound 48／80（Sigma，美國，批號：1002340712），甲苯胺藍（Sigma，美國，批號：1002341392），5%CO2恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo Scientific Cytoperm公司），倒置相差顯微鏡（德國XD-101 98010），E-Plate 16電極板、xCELLigence實時細胞分析系統(tǒng)（RT－CES，美國艾森公司）。

1.2 細胞培養(yǎng) RBL-2H3細胞用DMEM培養(yǎng)基（含15%胎牛血清），培養(yǎng)于37℃，飽和濕度，5%CO2培養(yǎng)箱中。RBL-2H3細胞為貼壁生長，當細胞生長鋪滿約80%培養(yǎng)瓶底面積時，可進行傳代。傳代比例為1∶3，4 d傳代1次。

1．3 實時監(jiān)測不同濃度Compound 48／80對RBL-2H3的影響 選擇合適密度的RBL-2H3細胞，接種于E-Plate 16電極板，每孔100μl，監(jiān)測24 h，待細胞增長穩(wěn)定后，加入不同濃度 Compound 48／80，使終濃度達分別為 2.5、5、10、20、40、80 mg·L－1，并設(shè)置空白對照，每次監(jiān)測間隔時間為5 min，監(jiān)測48 h，檢測CI值變化。

1.4 甲苯胺藍染色 選擇適宜密度的RBL-2H3細胞，接種于12孔板培養(yǎng)，待24 h細胞貼壁后，加入不同濃度Compound 48／80（5、10、20 mg·L－1），空白組加入等體積培養(yǎng)基，于37℃孵育1 h后，每孔加入0.5%的甲苯胺藍染液進行染色，倒置相差顯微鏡下觀察細胞脫顆粒形態(tài)的變化。

2 結(jié)果

2．1 不同濃度Compound 48／80對肥大細胞的影響 以合適的細胞密度接種于電極板中，穩(wěn)定培養(yǎng)24 h，加入不同濃度Compound 48／80，RT-CES實時監(jiān)測24 h。與空白對照組比較，Compound 48／80濃度為 20 mg·L－1時 Compound 48／80有明顯改變肥大細胞正常增長規(guī)律，CI值在加藥后30 min內(nèi)呈現(xiàn)下降趨勢，30 min～60 min CI值轉(zhuǎn)為上升，60 min后又下降。結(jié)果提示，20 mg·L－1Compound 48／80引起的肥大細胞脫顆粒、變形，在RT-CES實時檢測系統(tǒng)中表現(xiàn)出了特異性變化。濃度低于5 mg·L－1時對肥大細胞的生長曲線無明顯影響；濃度高于40 mg·L－1時CI值明顯下降，至48 h接近0點，說明此濃度明顯抑制RBL-2H3生長。

2.2 甲苯胺藍染色 甲苯胺藍染色可檢測肥大細胞脫顆粒的形態(tài)變化，為驗證Compound 48／80引起RBL-2H3細胞在RT-CES系統(tǒng)中特征性曲線變化與脫顆粒的關(guān)系，本實驗基于RT-CES系統(tǒng)曲線特異性變化，利用甲苯胺藍染色方法，考察了 Compound 48／80不同濃度（5、10、20 mg·L－1）和不同作用時間（5、30、60 min）對RBL-2H3細胞脫顆粒的影響?？瞻讓φ战M細胞生長良好，呈梭形或多形性，細胞核清晰可見，細胞質(zhì)飽滿，染成深藍色；Compound 48／80濃度為5 mg·L－1組細胞狀態(tài)與空白對照組類似，無明顯變化；10 mg·L－1組細胞梭形逐漸變圓，細胞膜外有散在的顆粒；20 mg·L－1組的細胞梭形基本消失，細胞變圓或成蝌蚪狀，細胞膜外有大量明顯的顆粒。結(jié)果提示，RT-CES系統(tǒng)曲線特異性變化與RBL-2H3細胞變形、脫顆粒密切相關(guān)，RT-CES系統(tǒng)特異性曲線可以在一定程度上反映細胞脫顆粒現(xiàn)象。

3 討論

本研究采用實時細胞分析系統(tǒng)，基于細胞形態(tài)的變化，可以實時檢測藥物引起的細胞狀態(tài)的改變。通過實時檢測傳感器表面的電阻抗信號，以CI值來反映細胞生長狀態(tài)，其中包括細胞數(shù)量、細胞黏附、細胞活力和細胞形態(tài)及細胞骨架動力學(xué)變化［8－9］。

Compound 48／80是引起肥大細胞脫顆粒反應(yīng)的的工具藥［10］，運用RT-CES系統(tǒng)實時檢測不同濃度Compound 48／80引起RBL-2H3脫顆粒的變化，可發(fā)現(xiàn)60 min內(nèi)，不同濃度的CI值曲線都有變化，以20 mg·L－1組的變化最明顯，這是細胞脫顆粒及形態(tài)變化產(chǎn)生的，在甲苯胺藍染色實驗中得到了驗證。此方法實現(xiàn)了實時、敏感監(jiān)測肥大細胞脫顆粒且不損傷細胞。

本實驗初步探討了基于RT-CES系統(tǒng)的體外肥大細胞脫顆粒檢測方法。RT-CES特異性曲線變化可以在一定程度反映肥大細胞脫顆?，F(xiàn)象。但由于此方法的初步建立，尚未考察肥大細胞脫顆粒具體量化標準，如CI值在哪個具體數(shù)值時肥大細胞開始發(fā)生脫顆粒，CI值的變化與炎性介質(zhì)釋放的關(guān)系等問題，均有待進一步深入研究。

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