牙骨質(zhì)附著蛋白在牙周組織再生中的作用

潘文波 林 鵬 鄭文娥 姜艷華 (吉林大學(xué)第二臨床醫(yī)院檢驗科，吉林 長春 300)

牙周病是一種常見的口腔疾病，在老年人中發(fā)病率高。牙骨質(zhì)為覆蓋在牙根表面的一層硬組織，維持著牙周組織的穩(wěn)定與健康。新生牙骨質(zhì)的形成對于牙周組織再生具有重要意義，與老年人牙周病的治療密切相關(guān)。牙骨質(zhì)附著蛋白(CAP)是牙骨質(zhì)中的一種特異性蛋白〔1〕，具有促進(jìn)牙骨質(zhì)形成的作用〔2〕，因此CAP在牙周組織再生中發(fā)揮著重要作用。CAP的發(fā)現(xiàn)是牙周組織再生機(jī)制的一個重要補(bǔ)充，為老年人牙周病的治療提供了新思路。

1 CAP的分子生物學(xué)特性

早在1987年，Miki等〔3〕發(fā)現(xiàn)新鮮人牙骨質(zhì)提取物具有刺激牙齦成纖維細(xì)胞有絲分裂及DNA合成的作用，其中分子量55×103的蛋白活性最高，能顯著促進(jìn)牙周韌帶細(xì)胞和牙齦成纖維細(xì)胞等對牙根的附著，由此被命名。Arzate等〔4〕首先制備了針對這一蛋白的鼠源性抗體H166;隨后Saito等〔5〕從牛牙骨質(zhì)中提取CAP并制備了單克隆抗體——3G9，借助這一抗體，陸續(xù)證實CAP只在牙骨質(zhì)細(xì)胞、成牙骨質(zhì)細(xì)胞(CB)及間充質(zhì)干細(xì)胞中表達(dá)，提示CAP在牙骨質(zhì)的形成中發(fā)揮著重要作用。對CAP的結(jié)構(gòu)分析顯示CAP含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)序列，具備典型黏附蛋白的特征。GenBank數(shù)據(jù)庫顯示編碼人CAP的基因是PTPLA，并收錄了其編碼基因序列(Gen-Bank登記號為AY455942)，但該編碼序列并未見諸學(xué)術(shù)報道，其可靠性有待研究〔6〕。CAP是與牙骨質(zhì)表面已發(fā)現(xiàn)的、與其他膠原分子及附著蛋白無關(guān)的牙骨質(zhì)特異性蛋白〔7〕。因為CAP上述獨特的組織學(xué)表達(dá)特點，目前被認(rèn)作是CB及牙骨質(zhì)的分子標(biāo)志物〔8〕，并建立了多種分離提純的方法〔9〕。

2 CAP的生物活性及作用機(jī)制

2.1 生物活性 CAP具備典型黏附蛋白的特征，對牙骨質(zhì)表面的黏附性優(yōu)于牙本質(zhì)表面，對羥磷灰石的親和力高于膠原蛋白〔10〕。CAP可以選擇性地促進(jìn)牙周組織中具有成骨表型細(xì)胞的黏附及增殖，例如人牙囊細(xì)胞(hHDFCs)、牙周韌帶細(xì)胞(hPDLSCs)、牙齦成纖維細(xì)胞(HGFs)、牙槽骨細(xì)胞(hHABCs)，但CAP對這些細(xì)胞的伸展并無顯著影響〔9〕。CAP對上述細(xì)胞的促增殖作用呈濃度和時間依賴性，例如0.5～2.0 μg/ml的CAP能顯著促進(jìn) hPDLCs增殖〔11〕。CAP還可促進(jìn)骨髓基質(zhì)細(xì)胞(BMSCs)增殖，但對細(xì)胞礦化無明顯作用。CAP內(nèi)的RGD序列可以通過整合素 α5β1與成纖維細(xì)胞相結(jié)合〔12，13〕，增強(qiáng)其細(xì)胞黏附性，且細(xì)胞黏附不為抗纖維連接蛋白和抗層黏連蛋白等抗體阻斷〔11〕。同時CAP可以影響人牙囊細(xì)胞內(nèi)源性骨涎蛋白(BSP)基因的表達(dá)，該作用具有劑量效應(yīng)和時間效應(yīng):CAP濃度越大，表達(dá)量越強(qiáng)，但是劑量效應(yīng)還受到時間效應(yīng)的制約，即使CAP濃度高達(dá)10 mg/L，3 d也未觀察到BSP mRNA表達(dá)。體外實驗顯示CAP在高濃度時可增強(qiáng)人牙囊細(xì)胞的堿性磷酸酶(ALP)活性〔14〕，促使其黏附并向CB分化，刺激其分泌礦化基質(zhì)，從而形成早期的牙骨質(zhì)和骨組織;另有實驗證明能強(qiáng)烈結(jié)合CAP的細(xì)胞可以形成牙骨質(zhì)樣結(jié)構(gòu)〔7〕。

上述研究表明CAP能選擇性地促進(jìn)CB前體細(xì)胞對牙根表面的移行黏附〔2〕，并促進(jìn)這些前體細(xì)胞向CB系分化，增強(qiáng)其成骨活性〔14〕;CAP是新生牙骨質(zhì)及牙周再生的趨化因子，并參與牙周新附著的形成。

2.2 CAP的作用機(jī)制 Francisco等〔15〕發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外調(diào)節(jié)激酶(ERK)的增量調(diào)節(jié)是牙骨質(zhì)形成的關(guān)鍵，Ca(OH)2使胞外鈣水平提高，通過ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑促進(jìn)牙周膜中CB分化，當(dāng)鈣通道阻斷后，ERK磷酸化被阻止，CAP則無法釋放，提示ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與CAP形成。而CAP介導(dǎo)的成纖維細(xì)胞伸展過程則有MEK/MAPK信號傳導(dǎo)途徑參與，Kamoki等〔16〕發(fā)現(xiàn)ERK在成纖維細(xì)胞附著發(fā)生15 min后被激活，3 h后達(dá)到頂峰水平，激酶活性至少可維持12 h以上;而MAPK激酶抑制劑PD98059可顯著抑制細(xì)胞附著后激發(fā)的激酶活性水平，明顯抑制成纖維細(xì)胞的進(jìn)一步伸展。

Saito等〔17〕研究人成纖維細(xì)胞附著于 CAP過程所引發(fā)的信號反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)該過程可激發(fā)MAPK激酶活性、引發(fā)c-fos mRNA的表達(dá)及蛋白酪氨酸磷酸化反應(yīng)，提示CAP介導(dǎo)的細(xì)胞附著過程可引發(fā)與纖維連接蛋白(FN)等其他黏附分子類似的典型信號活動，從而在病理狀態(tài)下選擇性募集間充質(zhì)細(xì)胞遷徙、附著，并調(diào)節(jié)細(xì)胞的特異性生物功能的發(fā)揮。整合素α5β1亞單位是CAP介導(dǎo)細(xì)胞附著的主要受體，Ivanovski等〔18〕發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的附著行為可被抗α5及抗β1抗體所抑制，而不受抗α2及抗α3抗體的影響。CAP通過影響cyclins D1及E對細(xì)胞周期進(jìn)行調(diào)節(jié)，Yokokoji等〔19〕在研究cyclins D1及E與成纖維細(xì)胞結(jié)合CAP后細(xì)胞周期變化的關(guān)系時，發(fā)現(xiàn)雖然CAP與成纖維細(xì)胞結(jié)合后，cyclins D1及E水平都顯著升高。Pan等〔20〕發(fā)現(xiàn)Runx2作為成骨細(xì)胞及成牙骨質(zhì)細(xì)胞增殖早期重要的轉(zhuǎn)錄因子，可以促進(jìn)CAP的分泌，并且與CAP促進(jìn)CB增殖的功能密切相關(guān)，提示Runx2參與CAP促進(jìn)成骨表型細(xì)胞增殖的過程。

3 CAP與牙周組織再生

新生牙骨質(zhì)的形成對牙周組織再生意義重大，CB在牙骨質(zhì)形成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。CB的功能包括表達(dá)礦化相關(guān)蛋白如骨鈣素(OCN)、BSP、CAP等，分泌礦化基質(zhì)形成鈣化結(jié)節(jié)，進(jìn)而形成牙骨質(zhì);CB表達(dá)的OCN、BSP和CAP等在牙骨質(zhì)形成和細(xì)胞黏附過程中起重要作用。上皮根鞘(HERS)是牙根發(fā)育中的重要且唯一的上皮性結(jié)構(gòu)，在牙根發(fā)育中發(fā)揮著重要作用。Jimin等〔21〕發(fā)現(xiàn)上皮根鞘細(xì)胞不僅分泌釉基質(zhì)蛋白，也分泌CAP參與牙骨質(zhì)形成。

CAP可作為鑒別CB及牙骨質(zhì)的分子標(biāo)志物〔22〕。同時眾多實驗證實〔23～25〕:牙囊細(xì)胞、牙周韌帶細(xì)胞等具有分化為CB潛能的間充質(zhì)細(xì)胞在分化過程中同樣表達(dá)CAP，因此CAP亦可作為鑒別牙周韌帶中具有分化為CB潛能的間充質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志;而細(xì)胞ALP表達(dá)可以作為牙骨質(zhì)形成過程中CB分化早期的標(biāo)志;礦化組織的形成則可作為CB分化末期的指標(biāo)。Handa等〔26〕將牛牙囊細(xì)胞與羥基磷灰石復(fù)合后植入免疫缺陷小鼠體內(nèi)，4 w后發(fā)現(xiàn)形成纖維組織和類牙骨質(zhì)樣基質(zhì)，CAP染色陽性;而植入的牙槽骨細(xì)胞生成的是骨樣結(jié)構(gòu)，CAP染色陰性。Wen等〔27〕發(fā)現(xiàn)在經(jīng)含牙本質(zhì)非膠原蛋白的牙囊細(xì)胞培養(yǎng)液處理后，脂肪干細(xì)胞由成纖維樣細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)槌裳拦琴|(zhì)樣細(xì)胞，細(xì)胞表達(dá)CAP mRNA。周彬等〔23〕發(fā)現(xiàn)在純鈦表面生長的hPDLCs能高度表達(dá)CAP，提示體外培養(yǎng)的hPDLCs中存在牙骨質(zhì)細(xì)胞表型，具有向CB表型分化的潛能。Song等〔2〕利用hPDLCs探討根面原位保留的牙骨質(zhì)對其分化的影響，以期進(jìn)一步揭示牙骨質(zhì)的功能，并為臨床應(yīng)用中根面保留牙骨質(zhì)提供理論依據(jù)，研究表明在同樣條件下生長的hPDLCs，在牙骨質(zhì)表面生長的hPDLCs顯著表達(dá)CAP，證明根面保留的牙骨質(zhì)能促進(jìn)hPDLC向CB分化，從而有利于牙周組織再生。Bo等〔22〕發(fā)現(xiàn)牙本質(zhì)基質(zhì)(TDM)可以促進(jìn)牙囊細(xì)胞分化為牙髓牙本質(zhì)樣組織及牙骨質(zhì)-牙周復(fù)合體，CAP作為牙骨質(zhì)形成的標(biāo)志物之一用于鑒定所形成的牙骨質(zhì)結(jié)構(gòu)。

目前，普遍觀點認(rèn)為釉基質(zhì)蛋白(EMPs)可以促進(jìn)牙周膜細(xì)胞(hPDLF)的增殖及礦化相關(guān)蛋白如 BSP和骨橋蛋白(OPN)的表達(dá)〔28〕，而黃曉山等〔29〕發(fā)現(xiàn) EMPs還可通過增強(qiáng) hPDLF中CAP的表達(dá)從而促進(jìn)hPDLF向CB分化，進(jìn)而促進(jìn)牙周組織再生。骨形成蛋白(BMP)是啟動間充質(zhì)干細(xì)胞向成骨細(xì)胞分化的初始信號分子，刺激牙槽骨及牙骨質(zhì)再生從而促進(jìn)牙周組織修復(fù);而BMP-2促進(jìn)牙骨質(zhì)再生的機(jī)制之一是BMP-2能夠通過增強(qiáng)CAP的表達(dá)來調(diào)節(jié)CB分化。Pitaru等〔30〕研究了BMP-2對不同牙周韌帶前體細(xì)胞克隆的分化及CAP表達(dá)的影響，發(fā)現(xiàn)礦化組織形成細(xì)胞系有較高的CAP結(jié)合力，未被BMP-2處理的成纖維細(xì)胞系對CAP結(jié)合力較低，經(jīng)BMP-2處理后上述兩種細(xì)胞系的CAP結(jié)合力均有所提高。隨后Zhao等〔25〕、Hidefumi等〔31〕陸續(xù)證實:BMP-2、7 和 EMPs可以刺激HDFC分化為CB，并表達(dá) CB標(biāo)志物 CAP。Carmona-Rodríguez等〔32〕發(fā)現(xiàn)經(jīng)牙骨質(zhì)蛋白(CEMP)-1轉(zhuǎn)染的人類牙齦成纖維細(xì)胞(HGF)表達(dá)CAP mRNA，提示CEMP-1促進(jìn)礦化及牙骨質(zhì)形成的機(jī)制與促進(jìn)CAP的表達(dá)有關(guān)。

綜上，CAP在牙骨質(zhì)的形成中發(fā)揮著重要作用，是牙周組織再生中的重要趨化蛋白，這為老年人牙周病的治療提供了新的思路。但目前只獲得了抗人或牛的CAP抗體-3G9〔5〕，研究所用的實驗動物往往受到CAP抗體的限制，同時CAP的作用機(jī)制尚未完理解透徹，需要進(jìn)一步的探索。

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