腫瘤壞死因子-α在膿毒癥大鼠心肌損害中的表達及作用機制

張文偉 魏 威 曹 紅 金 輝

(遼寧醫(yī)學院附屬第三醫(yī)院心血管內(nèi)科，遼寧 錦州 121000)

膿毒癥病情發(fā)展異常迅猛，易快速進展為嚴重的膿毒血癥，甚至感染性休克，研究表明心肌抑制和對兒茶酚胺耐藥的低血壓是嚴重膿毒血癥的兩種主要死亡原因〔1〕。一旦出現(xiàn)心肌抑制導致的心肌損害，患者的心肌功能會持續(xù)惡化，其病死率可上升至60%～90%。本研究觀察腫瘤壞死因子(TNF)-α在盲腸結(jié)扎穿孔法制造膿毒癥大鼠心肌中的表達強度及作用機制。

1 材料與方法

1.1動物模型建立及分組 清潔級健康雄性Wistar大鼠40只，體質(zhì)量(123±12)g，由山東大學醫(yī)學院實驗動物中心提供。隨機分為對照組(20只)、膿毒癥組(20只)。實驗動物均可自由飲水，但要禁食12 h，膿毒癥組參照并改進陳輝等〔2，3〕的方法進行造模，按300 mg/kg應用10%的水合氯醛注射于腹腔內(nèi)麻醉后將大鼠固定于簡易手術(shù)臺上，腹部備皮，消毒鋪巾后沿腹正中線作長約2 cm的切口，探查并找到盲腸，將盲腸內(nèi)的糞便輕輕向遠端擠，于距離回盲端60%處用4號線環(huán)形結(jié)扎盲腸，用20 ml注射器針頭穿透盲腸，擠出少量糞便，并留置細橡皮條貫通盲腸防止針道閉合，還納盲腸回腹腔，逐層關(guān)閉切口，術(shù)后按30 ml/kg給予股部皮下注射9%氯化鈉預防休克發(fā)生，術(shù)后常規(guī)進水。對照組僅開腹翻動盲腸。

1.2取材及標本處理 在造模術(shù)后20 h，所有大鼠以麻醉法處死后立即取出心臟，生理鹽水沖洗后，切取心尖部分(包含部分室間隔前部與左心室心肌約100 mg)，置入4%的甲醛中固定72 h，脫水、石蠟包埋、病理切片、HE和免疫組化染色。光學顯微鏡下觀察并照相。

1.3膿毒癥所致心肌損害的病理分級 參照Rone評價標準〔4〕將心肌損害的病理改變分為0級：無病變；Ⅰ級：心內(nèi)膜下小局灶性病變；Ⅱ級：心肌大范圍的灶性病變，心肌纖維出現(xiàn)腫脹斷裂；Ⅲ級：心肌內(nèi)廣泛的融合性病變；Ⅳ級：心肌出現(xiàn)壞死、變性。

1.4電鏡觀察心肌切片白細胞浸潤程度分級〔5〕按電鏡高倍視野下所見目測評估，0級：間質(zhì)間無白細胞浸潤；Ⅰ級：間質(zhì)間有極少量白細胞浸潤；Ⅱ級：間質(zhì)間有少量白細胞浸潤；Ⅲ級：間質(zhì)間有大量白細胞浸潤。

1.5TNF-α表達強度染色結(jié)果評價標準〔6〕SP試劑盒及抗TNF-α單抗均由廣東中山生物科技有限公司生產(chǎn)。心肌細胞中TNF-α染色為細胞膜和細胞質(zhì)著色，而細胞核不著色。按照染色的強度分為：①強陽性() 呈棕黃色：②陽性()呈黃色；③弱陽性(+)呈淺黃色：④陰性(-)不著色。

1.6統(tǒng)計方法 采用非參數(shù)統(tǒng)計方法的Ridit分析。

2 結(jié) 果

2.1電鏡下觀察心肌損害程度對比結(jié)果 術(shù)后膿毒癥組大鼠一般情況逐漸惡化，表現(xiàn)為嗜睡、精神萎靡、活動減少、刺激反應低、寒戰(zhàn)甚至腹瀉、豎毛、呼吸急促，剖腹探查見惡臭、血性腹水、盲腸結(jié)扎穿刺處腫脹顏色變黑，粘連并出現(xiàn)壞疽，小腸腸管擴張充血、腸脹氣，肝、腎充血水腫；提示造模成功。對照組心肌病理切片電鏡下觀察見心肌纖維束形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，排列整齊，閏盤顯示清晰，所見心肌細胞結(jié)構(gòu)無異常，心肌間質(zhì)未見充血、水腫，無炎性細胞，Rone病理分級均為0級：無病損。膿毒癥組可見心肌纖維廣泛的斷裂、纖維束結(jié)構(gòu)排列紊亂，可見心肌細胞腫脹、空泡變性、皺縮；心肌間質(zhì)充血、水腫，大量炎癥細胞浸潤。膿毒癥組心肌Rone病理分級(心肌損傷程度Ⅱ級4只、Ⅲ級10只、Ⅳ級6只)及白細胞浸潤程度(Ⅱ級2只，Ⅲ級18只)均明顯高于對照組(均為0級20只)(P=0.007 20、0.000 12)。

2.2TNF-α的表達強度免疫組化染色結(jié)果 膿毒癥組TNF-α表達強度(6只、14只)明顯強于對照組(-19只，+1只)(P=0.002 9)。

2.3膿毒癥組心肌中TNF-α表達的強度與病理分級及白細胞浸潤程度的關(guān)系 病理Ⅳ級，TNF-α表達呈，白細胞浸潤程度為Ⅲ級>病理Ⅲ級，TNF-α表達呈～，白細胞浸潤程度為Ⅱ～Ⅲ級>病理Ⅰ～Ⅱ級，TNF-α表達呈，白細胞浸潤程度為Ⅰ級>病理0級，TNF-α表達呈-或+，白細胞浸潤程度0級，心肌TNF-α表達強度與心肌的損傷程度、心肌白細胞的浸潤程度呈正相關(guān)。

3 討 論

盲腸結(jié)扎穿刺術(shù)建立的膿毒癥模型，已廣泛用于膿毒癥的研究。臨床上發(fā)現(xiàn)近70%的膿毒癥患者會并發(fā)心肌損害 (在新生兒敗血癥中尤其常見，其心肌損害的發(fā)病率及病死率均較高)，一般認為于膿毒癥發(fā)生后5 h就存在心肌損傷，可稱之為早發(fā)型，此型最初是心臟自身功能障礙，而心肌形態(tài)學正常，表現(xiàn)為可逆的動力學障礙，即血壓在正常范圍內(nèi)出現(xiàn)心肌收縮功能抑制，這常演變?yōu)殡y治性休克的前兆，心肌損害發(fā)生的越早，病情就越重，病死率也越高；膿毒癥休克時出現(xiàn)的心肌損害稱為晚發(fā)型(即低血流動力期型)，易控制，預后較早發(fā)型好〔7〕。膿毒癥發(fā)生心肌損害的概率非常高，臨床一旦懷疑膿毒癥，應及早采取有效措施預防或減輕心肌損害。

目前研究認為炎癥反應在膿毒癥心肌損害的發(fā)生機制中占主導地位〔8〕。膿毒癥主要由革蘭陰性菌細胞壁脂多糖(LPS)進入血液導致，LPS黏附于單核-巨噬細胞等免疫細胞的表面，與細胞膜上的TLR4-MD2/CD14復合體結(jié)合，結(jié)合體將LPS承載的信號傳入心肌細胞內(nèi)，從而引起TNF-α等炎癥介質(zhì)釋放〔9〕。心肌組織產(chǎn)生炎癥細胞因子用來抵抗致病物質(zhì)的侵襲，如果產(chǎn)生過量，反而會加重膿毒癥患者的心肌損害〔10〕。目前普遍認為心肌組織及循環(huán)中產(chǎn)生的炎癥細胞因子在膿毒癥的心肌損害病理變化過程中起關(guān)鍵作用，尤其體現(xiàn)在早發(fā)型心肌損害中〔11〕。

TNF-α在膿毒癥心肌損害中的作用機制，目前為止尚無確切定論，可能與下述兩種因素相關(guān)：①趨化并激活白細胞〔12〕。TNF-α作為一種炎癥因子可引起白細胞趨化、集聚，同時釋放化學物質(zhì)導致組織損害，TNF-α首先作用于損害部位的血管內(nèi)皮細胞，將其表面的白細胞黏附趨化因子激活，這種因子會誘導白細胞聚集并黏附于損傷的心肌細胞上，白細胞釋放出一系列化學物質(zhì)從而導致心肌組織損傷。②通過壞死方式來誘導心肌細胞凋亡。研究〔13〕證實人心肌細胞的表面擁有可表達TNF的特異性受體TNF-R1、R2的受體蛋白和mRNA，說明TNF-α可直接與心肌細胞膜的特異性受體結(jié)合而發(fā)揮其抑制效應，從而抑制心肌收縮功能或直接損害心肌組織。

本研究印證了膿毒癥心肌損害確與TNF-α有密切的關(guān)系，呈正相關(guān)性，也就是說心肌損害越重，心肌中TNF-α表達越強，反之亦然。TNF-α的表達與炎性反應密切相關(guān)。TNF-α介導的炎癥反應是導致膿毒癥心肌損害的重要機制之一。及早干預阻斷炎癥傳導的信號通路對治療膿毒癥心肌損害及降低病死率至關(guān)重要。

4 參考文獻

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