殼聚糖緩釋微球疫苗佐劑研究進(jìn)展

劉 巖，呂志強(qiáng)

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所,浙江杭州 310021）

殼聚糖緩釋微球疫苗佐劑研究進(jìn)展

劉 巖，呂志強(qiáng)

（浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶桑研究所,浙江杭州 310021）

殼聚糖高分子材料具有良好的生物和理化特性,用其制備的微球疫苗是目前緩釋疫苗佐劑的研究熱點(diǎn)之一。微球佐劑能保護(hù)抗原、實(shí)現(xiàn)緩釋作用,提高抗原利用度,促進(jìn)機(jī)體免疫反應(yīng)。本文圍繞殼聚糖微球的研究和應(yīng)用近況進(jìn)行綜述。

殼聚糖；微球；緩釋；疫苗佐劑

佐劑是指能增強(qiáng)機(jī)體抗原免疫應(yīng)答或改變免疫應(yīng)答類型的物質(zhì)。它主要通過免疫調(diào)節(jié)（細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的修飾）、抗原遞呈（抗原構(gòu)象的維持）、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（CTL）誘導(dǎo)、抗原靶向和儲(chǔ)存等方式誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生長期、高效的免疫反應(yīng),提高機(jī)體保護(hù)能力,同時(shí)又減少免疫物質(zhì)的用量,降低疫苗生產(chǎn)成本［1］。傳統(tǒng)疫苗多為病原體或其裂解物,免疫原性強(qiáng)。但隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展,基因工程亞單位疫苗、合成肽疫苗、DNA疫苗等新型疫苗抗原的純度越來越高,免疫原性卻通常較弱,需要使用佐劑來提高對(duì)抗原的保護(hù)作用［2］。研究安全、高效、穩(wěn)定的佐劑成為學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn),而其中緩釋微球包裹技術(shù)是近年來的研究熱點(diǎn)。

緩釋微球包裹技術(shù)開始于20世紀(jì)50年代,首先應(yīng)用于藥物釋放系統(tǒng)的研究。直到1979年, Morris等［3］才首次將這項(xiàng)技術(shù)應(yīng)用在免疫學(xué)研究,在制備微球疫苗免疫小鼠時(shí)發(fā)現(xiàn),該系統(tǒng)可以持續(xù)釋放抗原,刺激抗體產(chǎn)生,而不會(huì)誘發(fā)免疫耐受,微球佐劑也才開始引起人們極大的關(guān)注。微球佐劑作為抗原的一個(gè)穩(wěn)定的隔離載體,發(fā)揮著保護(hù)抗原蛋白的作用,使抗原在體內(nèi)免受溫度、酸堿、滲透強(qiáng)度、消化液等因素的破壞,而且微球抗原還能避免母源抗體的中和作用,實(shí)現(xiàn)抗原可控制釋放,產(chǎn)生相當(dāng)于常規(guī)疫苗多次接種激發(fā)的免疫效果,從而延長疫苗免疫期,減少免疫次數(shù)。目前,常用的微球載體高分子材料主要有殼聚糖、透明質(zhì)酸以及海藻酸鈉等。其中,殼聚糖來源廣泛、價(jià)格低廉,體內(nèi)不積蓄,無抗原免疫性,生物相容性優(yōu)良等特點(diǎn),使其成為一種理想的疫苗佐劑載體［4］,本文圍繞殼聚糖作為疫苗遞呈佐劑的研究和應(yīng)用情況進(jìn)行綜述。

1 殼聚糖的理化特征

殼聚糖是由葡糖胺和N-乙?；咸前方M成的多糖,是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物。殼聚糖廣泛存在于蟹、蝦等低等動(dòng)物以及藻類、真菌等低等植物中,含量極其豐富,是僅次于纖維素的第2大多糖［5］。殼聚糖分子基團(tuán)具有1個(gè)氨基和2個(gè)羥基, pKa值約6.5,帶正電荷,不同脫乙酰度殼聚糖的分子量、黏度等有所不同。

殼聚糖主要來源于甲殼綱動(dòng)物和真菌的菌絲體,以及蘑菇、藻類、酵母等。動(dòng)物來源殼聚糖易受季節(jié)等波動(dòng),穩(wěn)定性有不足之處［6］。菌菇來源的殼聚糖具有四季可控、穩(wěn)定生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì),物理提取殼聚糖與生產(chǎn)培養(yǎng)的基質(zhì)密切相關(guān)。從生物安全和保健角度考慮,菌菇源的殼聚糖更優(yōu)于甲殼動(dòng)物來源［7］。根據(jù)來源和制備方法的不同,殼聚糖脫乙酰度在60%～100%,分子量300～1 000 ku。低聚殼聚糖可通過特定的酶或試劑降解殼聚糖制備而得［8］。

殼聚糖理化特征很難預(yù)測(cè),通常需要先制備產(chǎn)品,再進(jìn)行組分和特征的鑒定。作為一種天然成分,不同批次、來源的殼聚糖混合的有機(jī)和無機(jī)雜質(zhì)各有不同,所以一般生產(chǎn)商側(cè)重介紹產(chǎn)品的黏度,而不是分子量；這也與殼聚糖僅溶于酸性溶液,很多項(xiàng)目的分析測(cè)試難以開展有關(guān)。殼聚糖的脫乙酰度常用pH電位滴定法,紅外光譜,核磁共振譜,紫外光譜,膠體滴定法和酶法降解測(cè)定［9］,分子質(zhì)量則常用黏度法或色譜法測(cè)定［5］。

2 殼聚糖作為生物材料的作用特征

殼聚糖的氨基葡萄糖殘基帶正電荷,可以與唾液中帶負(fù)電荷的黏蛋白的糖蛋白結(jié)合,實(shí)現(xiàn)黏膜黏附作用。脫乙酰度越高,黏附作用越強(qiáng),這也與殼聚糖脫乙酰后正電荷數(shù)量的增加,從而改進(jìn)了黏膜黏附性能有關(guān)［10］。再者,由于殼聚糖帶正電荷,可以與細(xì)胞膜負(fù)電荷相互作用,細(xì)胞間緊密連接被打開,增加了多聚物的滲透性。這種滲透能力也隨著殼聚糖脫乙酰度的增加而增加［11］。

殼聚糖還具有抗菌活性,一種觀點(diǎn)認(rèn)為是帶正電荷的殼聚糖可以與細(xì)胞表面負(fù)電基團(tuán)相互作用后改變細(xì)胞通透性,阻礙重要物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞,和/或?qū)е录?xì)胞必須生長物質(zhì)的缺失。也有提出是細(xì)胞DNA與殼聚糖相（主要通過質(zhì)子化氨基基團(tuán)）結(jié)合,抑制了微生物RNA的合成［12］。此外,殼聚糖還具有抗凝血［13］、鎮(zhèn)痛作用［14］。

殼聚糖富含易斷裂的糖苷鍵,在體內(nèi)可被多種蛋白酶降解,特別是溶菌酶［15-16］。殼聚糖聚合物的結(jié)晶度與生物降解動(dòng)力學(xué)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系。殼聚糖脫乙酰度下降至60%左右,結(jié)晶度降低而生物降解速率增加；同時(shí),殼聚糖的乙?；鶜埢矔?huì)影響它的結(jié)晶度；殼聚糖糖鏈越短,越易被降解。降解后的殼聚糖生成無毒低聚糖,經(jīng)代謝后排出體外。殼聚糖的降解速率主要與脫乙酰度有關(guān),也與N-乙酰氨基葡萄糖殘基的分布和殼聚糖分子量有關(guān)［17］。

鑒于殼聚糖所具有的良好生物降解性、降解產(chǎn)物無毒副作用、體內(nèi)不積蓄、生物相容性優(yōu)良等特點(diǎn),美國食品藥品管理局已批準(zhǔn)殼聚糖用于傷口縫合線。這些特點(diǎn)也決定了殼聚糖在醫(yī)藥、免疫學(xué)等領(lǐng)域的重要應(yīng)用價(jià)值。

3 殼聚糖遞呈疫苗研究

殼聚糖微球聚合體可保護(hù)抗原免受外界不良因素（如有機(jī)溶劑,較低或較高的pH環(huán)境,蛋白酶等）的影響或破壞,為疫苗提供可靠的保障［18］。殼聚糖微球疫苗具有無毒、生物相容性和可降解性,可改變和控制抗原的釋放,提高抗原生物利用度,以及增加抗原局部滯留性等優(yōu)點(diǎn)［19］。

殼聚糖微球可以通過乳化交聯(lián)［20］、噴霧干燥［21］、沉淀/凝聚［22］等方法制備。通過人為調(diào)控微孔大小可以控制抗原釋放的速率。一次性注射后,抗原在機(jī)體內(nèi)可連續(xù)緩釋數(shù)周甚至數(shù)月,刺激機(jī)體產(chǎn)生持續(xù)高效抗體。

殼聚糖微球疫苗中的殼聚糖具有免疫佐劑功能和載體功能,可誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞產(chǎn)生相當(dāng)水平的IL2［23］,增加腸道淋巴細(xì)胞中IgA、IgG的水平［24］,激活補(bǔ)體、刺激巨噬細(xì)胞活化,增強(qiáng)吞噬能力,促進(jìn)黏膜中抗原遞呈細(xì)胞對(duì)抗原的攝?。?5］。殼聚糖皮下接種可以增強(qiáng)體液、細(xì)胞免疫反應(yīng)［26］和黏膜免疫［27-28］,具有良好的開發(fā)潛力。

3.1 殼聚糖微球佐劑

3.1.1 殼聚糖DNA微球疫苗

殼聚糖的正電荷通過與DNA的負(fù)電荷相互作用,使進(jìn)入體內(nèi)的重組質(zhì)粒DNA被Peyer集合淋巴結(jié)的M細(xì)胞捕獲,促進(jìn)免疫反應(yīng)的發(fā)生。殼聚糖DNA聚合物還可以保護(hù)DNA在生理鹽水或乙酸溶液中免受核酸酶降解［29-30］；而且制備安全、儲(chǔ)存穩(wěn)定［31］。殼聚糖首次被用于遞呈質(zhì)粒是在Mumper等［32］的研究報(bào)道中,Tian等［33］將魚淋巴囊腫病毒病的衣殼蛋白MCP基因的pDNA,通過乳化交聯(lián)與殼聚糖形成微球,直徑小于10μm。Soane等［34］研究發(fā)現(xiàn),殼聚糖包封基因后,其半衰期由15 min延長到43 min。Rejesh Kumar等［35］制備殼聚糖包封弧菌DNA的微球疫苗能刺激石斑魚產(chǎn)生對(duì)弧菌的中等抵抗力。

3.1.2 殼聚糖蛋白微球疫苗

殼聚糖包裹蛋白類疫苗時(shí),其包封率和載藥量均很高。Van der Lubben等［36］利用殼聚糖微囊包被,制備殼聚糖微球大小（4.3±0.7）μm,載藥量超過40%。4 h內(nèi)超過90%仍保存在微囊內(nèi)。孫慶申等［37］通過吸附法制備載牛冠狀病毒N蛋白殼聚糖微球,結(jié)果微球形態(tài)好、表面光滑、分散性較好,平均粒徑為（6.50±1.77）μm,在體內(nèi)具有一定的緩釋作用。Sui等［38］用殼聚糖作為佐劑,將E.coli表達(dá)純化的M1蛋白免疫BALB/c鼠（滴鼻）,結(jié)果顯示殼聚糖蛋白混合物不僅能保護(hù)機(jī)體免受H9N2病毒的攻擊,還能保護(hù)免受70%的H1N1和30%的H5N1病毒的攻擊。

3.1.3 殼聚糖與疫苗聯(lián)合使用

殼聚糖白喉、破傷風(fēng)疫苗免疫,對(duì)體液和細(xì)胞免疫均有顯著增強(qiáng)反應(yīng)［39-40］。Rauw等［41］將新城疫疫苗與殼聚糖結(jié)合,免疫后將雞處死,取脾臟研磨,用PMA刺激細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)脾淋巴細(xì)胞增殖活性明顯增強(qiáng),且IFNγ的表達(dá)量也大幅增加,外周的細(xì)胞免疫發(fā)生的時(shí)間更早、更強(qiáng)烈,而消化道內(nèi)局部的細(xì)胞免疫相對(duì)弱一些,表明殼聚糖作為佐劑可誘導(dǎo)Th1型免疫反應(yīng),增強(qiáng)免疫效果。徐懷英等［20］利用殼聚糖為囊材制備新城疫微球疫苗,免疫試驗(yàn)證實(shí)有較強(qiáng)的細(xì)胞免疫和體液免疫［20］。常海艷等［42］將殼聚糖與疫苗混合經(jīng)腹腔注射免疫BALB/c小鼠,間隔3周,免疫2次；免疫后取血清,檢測(cè)血清中所產(chǎn)生的IgG,IgG1,IgG2a等抗體水平,同時(shí)取小鼠鼻洗液檢測(cè)IgA抗體；加強(qiáng)免疫后1周,用致死量流感病毒AP/R/8/34（H1N1）攻擊小鼠；結(jié)果表明殼聚糖作佐劑能顯著增強(qiáng)血清抗體IgG1和IgG2a含量,并提高小鼠抗病毒攻擊的能力,作為流感病毒滅活疫苗的新型佐劑,可以增強(qiáng)疫苗的抗體反應(yīng)。謝勇等［43］研究表明,以殼聚糖為佐劑的幽門螺桿菌（Hp）疫苗對(duì)Hp感染具有免疫保護(hù)作用,并可成功誘導(dǎo)黏膜局部的特異性體液免疫應(yīng)答,這可能在其免疫防御中起作用；而且可促進(jìn)Thl和Th2的混合免疫反應(yīng),逆轉(zhuǎn)Hp感染所致Th2反應(yīng)的抑制、使Thl和Th2反應(yīng)達(dá)到平衡,從而發(fā)揮其免疫保護(hù)作用。

3.2 殼聚糖復(fù)合緩釋微球

由于殼聚糖本身的親水性、酸溶脹性等特點(diǎn),單純殼聚糖形成球囊往往韌性差、降解快,作為藥用輔料效果不是非常理想［44-45］,因此,將殼聚糖與其他生物材料共混來制備微球成為該領(lǐng)域的新趨勢(shì)。

3.2.1 殼聚糖/海藻酸鈉

海藻酸鈉為天然高分子多糖,是一種陰離子型的共聚物,可生物降解,生物相容性好,并且具有一定的免疫佐劑作用。海藻酸鈉易與二價(jià)陽離子交聯(lián)固化,利用這一特性,可通過噴霧干燥和離子交聯(lián)法制備海藻酸鈉微球［46］。由于殼聚糖分子鏈上有大量的氨基,海藻酸鈉分子鏈上有大量的羧基,所以殼聚糖和海藻酸鈉可通過正、負(fù)電荷吸引形成聚電解質(zhì)膜,從而提高微囊的穩(wěn)定性和載藥量,并可調(diào)節(jié)藥物釋放速度［47］。王毅超等［48］以殼聚糖、海藻酸鈉為主要材料包裹Hp全菌超聲蛋白抗原,制備新型Hp疫苗制劑,所制備的微球形態(tài)規(guī)則,平均粒徑3.33μm,蛋白包封率約為64.8%,微球呈顯著緩釋模式,緩釋時(shí)間可達(dá)6 d。Ma等［49］通過殼聚糖-海藻酸鈉-CaCl2系統(tǒng)制備噬菌體Felix O1微囊,體外模擬胃液、膽汁鹽環(huán)境,Felix O1在pH值低于3.7下5 min即被降解；相反,微囊包被組在pH值2.4胃酸條件下處理1 h,也僅僅降低2.58個(gè)對(duì)數(shù)單位；在1%和2%膽汁溶液中處理3 h分別降低1.29和1.67個(gè)對(duì)數(shù)單位；干燥微囊貯存6周后,噬菌體仍有12.6%的存活率,這為今后胃腸道免疫應(yīng)用提供了方便。

3.2.2 殼聚糖/聚乙丙交酯

聚乙丙交酯（PLGA）是由乳酸（lactic acid, LA）與羥基乙酸（glycolic acid,GA）共聚合而成。降解時(shí)酯鍵發(fā)生水解,大分子鏈逐漸斷裂成低分子聚合物,最終經(jīng)GA、LA生成CO2和H2O等產(chǎn)物。PLGA有很好的穩(wěn)定性和安全性,易于被吞噬細(xì)胞攝取,可通過在顆粒表面吸附相應(yīng)的配體定位到特定的組織或器官。但PLGA微球包封藥物突釋現(xiàn)象明顯,這與藥物主要分布在微球表面有關(guān)。由于殼聚糖有效的緩沖作用,研究者制備PLGA/ CS復(fù)合微球可避免PLGA微球引起的pH值的下降,減輕微球突釋現(xiàn)象［50］。Wang等［51］通過PLGA/CS形成復(fù)合微球,發(fā)現(xiàn)CS涂層是一種有效控制PLGA微球初始突發(fā)釋放蛋白質(zhì)的方法,也有助于克服了酸性蛋白加載PLGA微球,因此研究人員嘗試通過涂層防止藥物-聚合物過早分離。

3.2.3 殼聚糖/絲素蛋白復(fù)合微囊

絲素蛋白是家蠶幼蟲產(chǎn)生的,由18種氨基酸組成,無毒、無刺激,具有良好的物理、化學(xué)、生物學(xué)性能,它沒有免疫反應(yīng),具有良好的血液、組織相容性和抗凝血性。絲素蛋白膠凝凍結(jié)棚架評(píng)估微結(jié)構(gòu)形態(tài)與掃描電子顯微鏡揭示相對(duì)均勻的孔結(jié)構(gòu)和良好的互聯(lián)互通性［52］。Yeo等［53］利用spray dryer方法制備絲素微球。絲素中含有豐富的酰胺基和少量羥基,絲素蛋白的羧基在pH值4.2以上帶負(fù)電荷［54-55］,可與殼聚糖形成氫鍵,破壞殼聚糖鏈本身之間的復(fù)合凝聚,在共混膜方面已有研究報(bào)道［56］。Deveci等［57］利用復(fù)凝聚法制備絲素蛋白與殼聚糖的復(fù)合微囊,兩者比例為5時(shí)能形成表面光滑的微球。比例大于14時(shí),微球有2層結(jié)構(gòu),內(nèi)層致密,外層多孔。劉純等［58］以絲素蛋白、殼聚糖為載體材料,雙氯芬酸鈉為模型藥物,制備微球并考察其性質(zhì)及體外釋放；載藥微球平均粒徑（26.54±1.39）μm,且大小在20～30μm的微球占總數(shù)的81.47%。釋放時(shí)間可以持續(xù)200 h,緩釋效果較單一的殼聚糖微球好。來水利等［59］以胰島素為目標(biāo)藥物,以絲素（SF）和羥丙基殼聚糖（HPCS）為包藥材料,用復(fù)凝聚法制備SF-HPCS載藥微球；平均粒徑22.4μm,48 h內(nèi)釋藥率92.2%。Chung等［60］利用CS和SF在TPP作用下,采用spray-diried方法制備多孔微囊用于藥物緩釋。作者實(shí)驗(yàn)室利用殼聚糖、絲素蛋白2種材料,首次制備了荷載IBDV多聚蛋白基因的復(fù)合微囊,經(jīng)動(dòng)物試驗(yàn)對(duì)防治雞傳染性法氏囊病有較好的免疫效果,為疫苗佐劑的開發(fā)提供了新的參考。

此外,張燦等［61］將具有肝靶向作用的半乳糖和殼聚糖偶聯(lián),制備N-乳糖?；瘹ぞ厶?并對(duì)其性能進(jìn)行了研究,認(rèn)為該復(fù)合制劑有望成為新型的肝靶向藥物載體。Sun等［62］報(bào)道,發(fā)現(xiàn)殼聚糖/脂質(zhì)體包封質(zhì)粒DNA后的拷貝數(shù)增加更明顯。Zheng等［63］用海藻酸-殼聚糖共混后,再與PLGA制備3層復(fù)合微球,發(fā)現(xiàn)復(fù)合微球承載能力是常規(guī)PLGA微球的7倍多,復(fù)合微球疫苗誘導(dǎo)更強(qiáng)的免疫功能。

4 展望

殼聚糖具有特殊的生物、理化性質(zhì),是一種極有潛力的新型疫苗佐劑,近年來對(duì)它的研究取得了很大進(jìn)展。但是從應(yīng)用程度來講,多數(shù)仍停留在實(shí)驗(yàn)室階段。今后,如何改善殼聚糖親水性、選擇安全適合的改性材料、減少制備工藝對(duì)疫苗穩(wěn)定性的影響、實(shí)現(xiàn)制備工藝的重現(xiàn)性和放大生產(chǎn)等等,這些問題都有待于進(jìn)一步的研究解決?？傊?隨著微球佐劑研究的不斷深入,以及相關(guān)學(xué)科技術(shù)的不斷發(fā)展完善,可以相信在不久的將來,殼聚糖等微球疫苗佐劑必將在疫病防治中發(fā)揮重要的功效。

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（責(zé)任編輯：張才德）

S 88

A

0528-9017（2014）03-0416-05

文獻(xiàn)著錄格式：劉巖,呂志強(qiáng).殼聚糖緩釋微球疫苗佐劑研究進(jìn)展［J］.浙江農(nóng)業(yè)科學(xué),2014（3）：416-420,424.

2013-12-09

浙江省自然科學(xué)基金（Y3110544）；浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放課題

劉 巖（1976-）,女,河南焦作人,副研究員,博士,從事桑蠶基礎(chǔ)研究工作。