60Co-γ輻射對蘿卜種子萌發(fā)和幼苗生長的影響

熊秋芳，陳玉霞，張雪清，張小康

(1．湖北省武漢市蔬菜科學(xué)研究所，湖北武漢 430345;2．湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所，湖北武漢 430064)

蘿卜 (Raphanus sativusL．)又名萊菔、蘆菔，為十字花科蘿卜屬的一、二生生草本植物。蘿卜富含碳水化合物、維生素和磷、鐵、硫等無機鹽、淀粉酶和氧化酶等酶類以及芥子油。常吃蘿卜有促進胃腸蠕動、消食除脹、增強免疫功能、預(yù)防癌癥的作用，故而栽培歷史悠久。蘿卜是我國第2大蔬菜種植作物，品種繁多，在栽培上一般依收獲季節(jié)分為冬蘿卜、春蘿卜、夏秋蘿卜和四季蘿卜等4類。采用60CO-γ射線輻射處理植物的種子、花粉、枝條、植株等，誘使遺傳物質(zhì)發(fā)生改變或重新組合，導(dǎo)致有關(guān)性狀的變異，具有較高的突變率。據(jù)聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織和國際原子能機構(gòu)不完全統(tǒng)計，至1989年已有51個國家將輻射技術(shù)應(yīng)用于1 330種作物的育種中，并選出了大批優(yōu)良品種，這些新品種在當(dāng)前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上發(fā)揮了很大作用［1－4］。但目前輻射技術(shù)在蘿卜上的應(yīng)用僅有少量報道。王天龍等［5］用60CO-γ射線照射蘿卜種子，結(jié)果顯示劑量在20～60 Gy有利于蘿卜種子發(fā)芽，60～150 Gy有利于蘿卜幼苗生長。聶啟軍［6］在用60CO-γ射線照射蘿卜種子篩選抗黑斑病突變體中，篩選出了幾個抗性株系。本試驗利用60CO-γ射線對短葉13蘿卜種子進行不同劑量輻照處理，對種子發(fā)芽率、種子細(xì)胞膜、種子活力、幼苗生長量等進行了研究，探明了蘿卜種子有效的輻射誘變劑量，旨在為今后進一步篩選耐熱型蘿卜突變體提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試品種為短葉13蘿卜，為武漢市蔬菜科學(xué)研究所十字花科研究室自留高代自交系。種子凈度≥98.0%。處理時凈種子平均含水量為8.0%。

1.2 處理設(shè)計

將蘿卜種子裝入牛皮紙袋內(nèi)，于2011年9月在湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工與核農(nóng)技術(shù)研究所輻照中心進行輻射處理，共設(shè)18個輻照劑量處理，處理1為0 Gy未輻射種子為對照 (CK)，處理2為900 Gy，處理3為1 100 Gy，處理4為1 300 Gy，處理5為1 500 Gy，處理6為1 700 Gy，處理7為1 900 Gy，處理8為2 500 Gy，處理9為3 000 Gy，處理10為3 500 Gy，處理11為4 000 Gy，處理12為5 000 Gy，處理13為6 000 Gy，處理14為7 000 Gy，處理15為8 000 Gy，處理16為9 000 Gy，處理17為10 000 Gy和處理18為20 000 Gy。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 發(fā)芽率及生長量測定

參照國家農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程發(fā)芽試驗標(biāo)準(zhǔn)，將濾紙置于培養(yǎng)皿中作為發(fā)芽床，25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)發(fā)芽。每處理100粒種子，3次重復(fù)。種子萌發(fā)后以上下胚軸達(dá)到或超過種子長度為標(biāo)準(zhǔn)記載發(fā)芽數(shù)。培養(yǎng)24 h開始計算發(fā)芽率，72 h調(diào)查發(fā)芽勢，統(tǒng)計144 h發(fā)芽率，測胚根長、幼株生長量，分別計算不同處理種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、發(fā)芽指數(shù)等相關(guān)指標(biāo)。

發(fā)芽勢/%=規(guī)定天數(shù)內(nèi)發(fā)芽種子數(shù)/試驗種子總數(shù)×100;發(fā)芽率/%=發(fā)芽總粒數(shù)/試驗總粒數(shù)×100;發(fā)芽指數(shù)=Σ種子發(fā)芽數(shù)/相對應(yīng)的種子發(fā)芽天數(shù)。

1.3.2 種子活力測定

不同處理的50粒種子完全吸漲后，切開露胚，取帶胚的一半種子放入培養(yǎng)皿，加入濃度為0.5%的2，3，5-氯化三苯四氮唑 (TTC)溶液，完全淹沒種子，加蓋并在35℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)黑暗條件染色3 h，用清水沖洗并在解剖鏡下觀察，判斷種子生活力。胚全部或大部分被染成紅色的即為有活力的種子，胚不被染色的為死種子，胚中非關(guān)鍵性部位 (如子葉的一部分)被染色，而胚根或胚芽的尖端不染色，屬于不能正常發(fā)芽無活力的種子。

取正常染色的胚30個，蒸餾水沖洗3次，用濾紙吸干胚表面水分并移入50 mL離心管中，加10 mL無水酒精，加塞置35℃培養(yǎng)箱黑暗浸提24 h，在485和490 nm處分別測提取液的D值，重復(fù)3次。計算TTC還原強度。

1.3.3 細(xì)胞膜透性測定

取不同輻射處理的凈種子，用自來水洗凈種子表面，蒸餾水和超純水各沖洗2遍，將60粒種子放入潔凈的100 mL燒杯中，加入60 mL超純水，于25℃下浸泡24 h，用 HANNA instruments HI 98304型精密電導(dǎo)儀測定浸出液的電導(dǎo)值，再將種子及浸出液沸水浴30 min，冷卻至25℃后測定總電導(dǎo)值，重復(fù)3次。相對電導(dǎo)率/%=24 h浸泡液電導(dǎo)值÷總電導(dǎo)值×100。

1.4 統(tǒng)計方法

用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及相關(guān)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子萌發(fā)

不同的輻照劑量不同程度地影響了蘿卜種子的萌發(fā) (圖1)。萌發(fā)24 h內(nèi)，不同處理的種子受抑制作用明顯，隨著輻照劑量的增大，種子發(fā)芽進程明顯延遲，發(fā)芽率急劇下降，1 500 Gy(處理5)發(fā)芽率只有對照的50%，3 500 Gy(處理10)發(fā)芽率接近0;發(fā)芽時間增加，48和72 h發(fā)芽率逐漸提高;萌發(fā)時間達(dá)到144 h，3 500～4 000 Gy的輻照劑量處理對種子的最終發(fā)芽率沒有影響。隨著劑量的繼續(xù)加大，發(fā)芽率開始急劇下降，到20 000 Gy(處理18)種子萌發(fā)完全受到抑制，發(fā)芽率為0。

圖1 輻照處理對蘿卜種子發(fā)芽進程的影響

2.2 種子細(xì)胞膜

輻照處理不僅能引起細(xì)胞核中DNA產(chǎn)生變異，同時還會引起膜損傷，膜透性會明顯改變，表現(xiàn)出種子浸出液電導(dǎo)率增加。對輻照處理后蘿卜種子24 h浸出液電導(dǎo)率及相對電導(dǎo)率測定結(jié)果見圖2。輻照劑量低于1 300 Gy(處理4)，2種電導(dǎo)率變化均小，說明細(xì)胞膜透性變化小，細(xì)胞膜損傷不嚴(yán)重;當(dāng)劑量超過1 500 Gy，細(xì)胞滲出液濃度隨著輻照劑量的加大而增加。電導(dǎo)率越大，膜透性越大，細(xì)胞受損傷程度越大。蘿卜種子的24 h電導(dǎo)率和相對電導(dǎo)率變化趨勢一致。

2.3 種子活力

圖3和1表明，隨著輻照劑量的增加，蘿卜種子各種活力指標(biāo)均表現(xiàn)下降的趨勢。其中，24 h發(fā)芽率和72 h發(fā)芽指數(shù)的變化臨界點在3 500(處理10)～4 000 Gy(處理11);當(dāng)輻照劑量超過20 000 Gy，24 h發(fā)芽率、72 h發(fā)芽勢、72 h發(fā)芽指數(shù)指標(biāo)均為0，種子活力完全喪失。

圖2 輻照處理對蘿卜種子細(xì)胞膜透性的影響

圖3 輻照處理對蘿卜種子活力 (72 h)的影響

四唑測定技術(shù) (TTC)是《國際種子檢驗規(guī)程》中用于測定發(fā)芽緩慢或有休眠種子的生活力、快速判斷種子潛在發(fā)芽能力的一種有效方法，應(yīng)用廣泛。圖4顯示，與發(fā)芽法144 h測定的結(jié)果基本一致。當(dāng)輻照劑量達(dá)到3 500 Gy，有生活力的種子高達(dá)80%以上，蘿卜種子的生活力仍很強，隨著劑量的增加，種子生活力開始降低，到10 000 Gy(處理17)，種子生活力降到50%以下，到20 000 Gy，生活力最終喪失，說明該劑量的輻照對種子已經(jīng)產(chǎn)生了極強的抑制效應(yīng)。

圖4 輻照處理對蘿卜種子生活力的影響

2.4 幼苗根系生長

蘿卜幼苗根系對輻照極為敏感 (圖5)。受輻照種子的胚根生長較慢，毛狀細(xì)根發(fā)生明顯受到抑制，隨著劑量的增大，細(xì)根的發(fā)生從濃密到幾乎不發(fā)生。測定144 h幼苗的根長，表明輻射對根系生長產(chǎn)生不同程度的抑制，劑量越大，抑制效果越明顯，達(dá)到10 000 Gy時，幾乎沒有胚根生成。

圖5 輻射處理對蘿卜幼苗根長的影響

2.5 幼苗生長量

蘿卜幼苗受輻照后，子葉和下胚軸生長緩慢，萌發(fā)144 h后，受不同劑量輻照的蘿卜幼苗損傷差異明顯。高劑量處理中大部分植株和子葉黃化，逐漸死亡。生長量的變化同樣反映出輻照的劑量效應(yīng)，隨著輻照劑量增加，生長量減少，3 500 Gy以上劑量處理的幼苗生長量比未輻射的幼苗生長量少50%以上 (圖6)。

圖6 輻射處理對蘿卜幼苗生長量的影響

2.6 種子活力指數(shù)間的相關(guān)關(guān)系

蘿卜種子活力指數(shù)間的相關(guān)關(guān)系分析結(jié)果(表1)表明，蘿卜種子5項活力指數(shù)間均表現(xiàn)出極顯著相關(guān)關(guān)系。其中幼苗生長量與其他4項指標(biāo)相關(guān)關(guān)系都很高，發(fā)芽后幼苗的根長和生長量存在極顯著相關(guān)關(guān)系。24 h電導(dǎo)率與其余4項活力指標(biāo)均存在極顯著關(guān)系。

表1 蘿卜種子活力指數(shù)間的相關(guān)關(guān)系

輻照處理劑量對根和生長量的影響作用均為負(fù)相關(guān)，所以根長和生長量可作為評價蘿卜種子輻射處理后種子活力和早期生長表現(xiàn)的直觀指標(biāo)。

2.7 半致死劑量

受輻照的種子萌發(fā)后，幼苗逐漸表現(xiàn)出生長受到抑制，根系停止生長，子葉邊緣發(fā)黑、黃化、畸形、分叉等情形 (圖7)，畸形植株最后出現(xiàn)萎蔫至枯死。以發(fā)芽試驗和田間輔助播種試驗數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，由SPSS軟件計算出半致死劑量為1 494.662 Gy。

圖7 蘿卜輻照種子幼苗受害情況

3 小結(jié)與討論

60Co-γ輻射不同程度地影響了蘿卜種子萌發(fā)及幼苗生長進程。24 h電導(dǎo)率與其余4項活力指數(shù)均存在極顯著的相關(guān)關(guān)系，可作為快速測定蘿卜種子活力的有效指標(biāo)。

隨著發(fā)芽時間的增加，較低的輻照劑量對蘿卜種子的最終發(fā)芽率沒有影響，直到輻照劑量為10 000 Gy時，蘿卜的發(fā)芽率還可以達(dá)到30%，這可能與蘿卜種子里面含有大量的芥子堿有關(guān)。芥子堿廣泛存在于十字花科植物中，是一種非常有價值的天然抗氧化劑，芥子堿在輻射和活性氧攻擊中不僅可以防止堿基損傷，而且能夠有效地減少DNA鏈的斷裂［7］，在蘿卜種子受到輻射的時候，能夠進行自身的修復(fù)，以至于在高輻射劑量下仍然能正常發(fā)芽。但24 h內(nèi)，3 500 Gy是一個臨界點，因此24 h發(fā)芽率可作為輻射敏感性的指標(biāo)。

根長和幼苗生長量廣泛用于植物對輻射敏感程度的度量，在蘿卜上也很好地反映了此一效應(yīng)，3 500 Gy是嚴(yán)重?fù)p傷的劑量，極大地抑制了根、莖生長。從輻射對蘿卜種子萌發(fā)進程、活力變化及早期幼苗生長的影響來看，可選擇臨界劑量和半致死劑量即1 300～1 500 Gy，作為短葉13蘿卜種子誘變處理的最佳輻射劑量范圍，有望產(chǎn)生較多的突變體。

［1］溫賢芳．中國核農(nóng)學(xué)現(xiàn)狀與21世紀(jì)初的發(fā)展［J］．核科學(xué)與工程，2000(3):332－338．

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