冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙動(dòng)物模型建立的方法及評(píng)析

蘇立碩，王賢良，毛靜遠(yuǎn)

天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院心血管科，天津300193

冠狀動(dòng)脈微血栓形成或血栓栓塞是冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙的重要原因，建立理想的冠狀動(dòng)脈微血栓形成或血栓栓塞動(dòng)物模型，是探討冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙發(fā)生、發(fā)展和藥效、藥理的有價(jià)值研究平臺(tái)。人類(lèi)疾病動(dòng)物模型的設(shè)計(jì)，應(yīng)遵循相似性、重復(fù)性、可靠性、適用性、可控性、易行性和經(jīng)濟(jì)性的原則［1］。復(fù)制冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型目前多選用豬、犬和大鼠等，其中犬血液循環(huán)系統(tǒng)發(fā)達(dá)，豬的心血管系統(tǒng)與人類(lèi)相似，但兩者價(jià)格較高，故不常選用;而大鼠體型較小，易獲得，且價(jià)格較低，相對(duì)較為理想［2］。在造模方法上，目前常用的主要有機(jī)械性栓塞和化學(xué)性損傷栓塞兩種，前者主要包括冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射微栓塞球法、自體微血栓法，后者主要指冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射月桂酸鈉。本文分析和總結(jié)了常用冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙動(dòng)物模型建立方法的技術(shù)要點(diǎn)和優(yōu)缺點(diǎn)。

冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射微栓塞球法

應(yīng)用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物多為豬、犬等大動(dòng)物，即導(dǎo)管直接從前降支或回旋支注入制備好的微栓塞球，以造成冠狀動(dòng)脈微栓塞，導(dǎo)致冠脈微循環(huán)障礙［3-5］。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為12周齡的健康小型家豬，體重25～30 kg，雌雄不限。實(shí)驗(yàn)材料包括手術(shù)臺(tái)、紫外燈、手術(shù)器械、針線等1套，3%戊巴比妥鈉、氯胺酮、地西泮、肝素、6F動(dòng)脈鞘、DSA血管造影機(jī)、超導(dǎo)磁共振成像儀、6F指引導(dǎo)管和3.0/2.8F微導(dǎo)管。

實(shí)驗(yàn)步驟

微栓塞球制備:取直徑為42 μm的微栓塞球原液(Dyno公司，挪威)30 μl于1.5 ml的EP管中，加入0.9%NaCl液1.5 ml，充分吹打混勻，用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板于100×顯微鏡下計(jì)數(shù)，連續(xù)計(jì)數(shù)5次，求平均值，后分裝出12萬(wàn)個(gè)微栓塞球于60 ml離心管內(nèi)，加入0.9%NaCl液至30 ml，再次計(jì)數(shù)核查。

麻醉:以20 mg/kg氯胺酮和地西泮2 mg/kg肌內(nèi)注射誘導(dǎo)麻醉，3%戊巴比妥鈉靜脈推注維持麻醉。術(shù)中維持動(dòng)物體溫在37～38℃。

插管造影:分離右側(cè)股動(dòng)脈，植入6F動(dòng)脈鞘，經(jīng)鞘注入肝素200 U/kg達(dá)肝素化，后以100 U/(kg·h)維持。行冠狀動(dòng)脈造影，并經(jīng)指引導(dǎo)管送入微導(dǎo)管(3.0/2.8F Cordis Inc.)至左前降支分出第1對(duì)角支后的遠(yuǎn)端。

注射:使用前充分振蕩微栓塞球液，用60 ml注射器抽出，再用5 ml 0.9%NaCl液沖洗2次離心管，抽入60 ml注射器中，后經(jīng)微導(dǎo)管在40 min內(nèi)注入左前降支冠狀動(dòng)脈內(nèi)［4］，后以10 ml 0.9%NaCl液沖洗微導(dǎo)管。術(shù)后給予青霉素8萬(wàn)U肌注3 d預(yù)防感染。

相關(guān)檢測(cè)評(píng)價(jià)指標(biāo)陳章煒等［3］采用此方法造模后2 h血清轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(trans-forming growth factor-β1，TGF-β1)升高，6 h達(dá)到高峰，1周時(shí)下降，心肌病理切片可見(jiàn)微小梗死灶。此外還有研究顯示，通過(guò)此方法造模后1周，模型組心肌大體切片NBT染色可見(jiàn)微小梗死灶，證明通過(guò)該方法可以建立冠狀動(dòng)脈微栓塞模型，形成冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙［5］。

優(yōu)缺點(diǎn)分析冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射微栓塞球法主要通過(guò)機(jī)械性阻塞冠狀動(dòng)脈遠(yuǎn)端微血管，造成微循環(huán)障礙，其機(jī)制與冠狀動(dòng)脈再通術(shù)后血栓、斑塊碎片等隨血流阻塞遠(yuǎn)端微血管相似。優(yōu)點(diǎn)是不需要開(kāi)胸、損傷小、動(dòng)物死亡率低、可靠性高。主要缺點(diǎn)是栓塞的微球與實(shí)際冠狀動(dòng)脈斑塊破裂后釋出的富含血小板、纖維蛋白、紅細(xì)胞等成分的血栓栓子不同，其不為血中纖溶物質(zhì)所溶解，不能實(shí)現(xiàn)再通，而且微球?qū)植拷M織釋放的血管活性物質(zhì)的反應(yīng)同真正的微血栓也存在差別［6］，不能引起血管收縮、凝血改變、局部炎癥反應(yīng)等微環(huán)境改變，與臨床病理生理不符，對(duì)藥物治療的研究應(yīng)用價(jià)值較小，且實(shí)驗(yàn)成本較高，操作復(fù)雜，易行性較差。

自體微血栓法

采用大鼠自身血凝固成血栓后研磨成的顆粒狀栓塞劑，注入主動(dòng)脈根部或者左心室，引起冠狀動(dòng)脈微血管堵塞，造成冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙［7-8］。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為清潔級(jí)大鼠，體重約250～300 g。實(shí)驗(yàn)材料包括小動(dòng)物呼吸機(jī)、手術(shù)臺(tái)、紫外燈、手術(shù)器械、氣管插管、針線等1套，1%戊巴比妥鈉。

實(shí)驗(yàn)步驟

自體血栓制備:大鼠剪尾取血約1 ml，體外自凝成血凝塊。研磨成均勻顆粒懸液備用。

麻醉:1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉后仰臥位固定。

輔助通氣:頸部備皮后切開(kāi)皮膚，暴露氣管。經(jīng)口氣管插管后接小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，有氧正壓通氣，潮氣量2～3 ml，吸呼比1∶2，呼吸頻率60次/min。

開(kāi)胸:經(jīng)左側(cè)胸壁第2肋間逐層開(kāi)胸，暴露心臟后撕開(kāi)心包，露出主動(dòng)脈根部。

注射:用小動(dòng)脈夾鉗夾升主動(dòng)脈，使用0.5 mm胰島素注射器刺入主動(dòng)脈根部，分2次注入自體血栓0.2 ml，約10 s后松開(kāi)鉗夾，壓迫止血后關(guān)胸復(fù)蘇。術(shù)后給予青霉素8萬(wàn)U肌注3 d預(yù)防感染。

相關(guān)檢測(cè)評(píng)價(jià)指標(biāo)可通過(guò)觀察心臟病理切片予以評(píng)價(jià)。有研究發(fā)現(xiàn)，心臟HE染色顯示模型組小冠狀動(dòng)脈栓塞數(shù)量明顯多于假手術(shù)組和正常對(duì)照組，MSB染色顯示模型組纖維蛋白染色陽(yáng)性的微動(dòng)脈數(shù)量明顯多于假手術(shù)組和正常對(duì)照組，Sirius-Red染色顯示模型組心肌膠原纖維面積百分比明顯高于假手術(shù)組和正常對(duì)照組，提示進(jìn)入冠狀動(dòng)脈的血栓微粒阻塞了微小冠狀動(dòng)脈，造成冠狀動(dòng)脈微栓塞、微循環(huán)障礙［7］。

優(yōu)缺點(diǎn)分析該模型制備的機(jī)制為機(jī)械性堵塞，堵塞材料為自身血栓，成分與臨床冠狀動(dòng)脈微血栓成分接近，但是無(wú)內(nèi)皮損傷和微血管病變因素。優(yōu)點(diǎn)為血栓來(lái)源于自身，且富含血小板、纖維蛋白、紅細(xì)胞等，可以成功誘發(fā)大鼠冠狀動(dòng)脈微栓塞，且模型相對(duì)更符合冠狀動(dòng)脈微栓塞時(shí)病理的改變。此外，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物可選用大鼠，較冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射微栓塞球法可明顯降低實(shí)驗(yàn)成本［6］。主要缺點(diǎn)是該模型為非原位血栓形成，不以血管內(nèi)皮損傷為起始病因［9］，無(wú)臨床冠狀動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷表現(xiàn)，且血栓制備復(fù)雜，需要多次注入血栓微粒，開(kāi)胸時(shí)間較長(zhǎng)，損傷大，對(duì)呼吸和循環(huán)影響大，動(dòng)物死亡率高。

化學(xué)損傷法

多采用心尖部或主動(dòng)脈根部注射月桂酸鈉，造成冠狀動(dòng)脈微血管的損傷和栓塞，形成冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙［10］。

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為清潔級(jí)大鼠，體重約250～300 g。實(shí)驗(yàn)材料為小動(dòng)物呼吸機(jī)、手術(shù)臺(tái)、紫外燈、手術(shù)器械、氣管插管、針線等1套，1%戊巴比妥鈉、月桂酸鈉 (20 mg/ml)。

實(shí)驗(yàn)步驟

麻醉:1%戊巴比妥鈉50 mg/kg腹腔內(nèi)注射麻醉后仰臥位固定。

輔助通氣:頸部備皮后切開(kāi)皮膚，暴露氣管。經(jīng)口氣管插管后接小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，有氧正壓通氣，潮氣量2～3 ml，吸呼比1∶2，呼吸頻率60次/min。

開(kāi)胸:經(jīng)左側(cè)胸壁第2肋間逐層開(kāi)胸，橫斷胸骨，暴露心臟后撕開(kāi)心包，露出主動(dòng)脈根部。

注射:用小動(dòng)脈夾鉗夾升主動(dòng)脈，使用0.5 mm胰島素注射器刺入主動(dòng)脈根部注入月桂酸1.0 mg/kg(濃度10 mg/ml)，約10 s后松開(kāi)鉗夾，壓迫止血后關(guān)胸復(fù)蘇。術(shù)后給予青霉素8萬(wàn)U肌注3 d預(yù)防感染。

相關(guān)檢測(cè)評(píng)價(jià)指標(biāo)可通過(guò)觀察微血管內(nèi)皮損傷情況、微栓塞形成情況和檢測(cè)血管內(nèi)皮損傷相關(guān)因子檢測(cè)和評(píng)價(jià)該方法。有研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ徒M出現(xiàn)微動(dòng)脈血管內(nèi)皮損傷及微栓塞形成，對(duì)照組則未出現(xiàn)。Nagar-Olsen染色可見(jiàn)模型組心肌缺血，對(duì)照組無(wú)心肌缺血，提示該方法可以誘導(dǎo)冠狀動(dòng)脈微血栓形成，造成冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙［10］。此外有研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，模型組一氧化氮 (nitrogen monoxide，NO)水平明顯下降，內(nèi)皮素-1(endothelin-1，ET-1)和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 (vascular endothelial growth factor，VEGF)水平明顯上升，提示該方法可導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈微血管內(nèi)皮損傷和 (或)內(nèi)皮功能障礙［9］。

優(yōu)缺點(diǎn)分析該方法通過(guò)化學(xué)藥物造成微血管內(nèi)皮損傷，引起微血管病變，誘發(fā)血小板黏附聚集、促進(jìn)微血管栓塞的形成。優(yōu)點(diǎn)是用月桂酸鈉1 h左右可見(jiàn)冠狀動(dòng)脈微動(dòng)脈發(fā)生內(nèi)皮損傷，誘發(fā)微血栓，而較大動(dòng)脈內(nèi)無(wú)明顯血栓形成［6，10-12］，病理組織學(xué)損害與冠狀動(dòng)脈微栓塞相同，伴局灶心肌低氧［10］、心功能下降、心臟結(jié)構(gòu)改變［13］，HE染色示血管內(nèi)皮損傷以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)的程度明顯高于微球注射組［11］，且實(shí)驗(yàn)成本較低，是合適的冠狀動(dòng)脈微血管內(nèi)皮損傷致微循環(huán)障礙模型。主要缺點(diǎn)為需要開(kāi)胸操作，損傷大，對(duì)呼吸和循環(huán)影響大，動(dòng)物死亡率相對(duì)較高［14］，如果采用小動(dòng)物呼吸機(jī)輔助呼吸，可降低死亡率。

總之，目前冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙主要發(fā)病機(jī)制包括血管內(nèi)皮功能異常、炎癥反應(yīng)、微血管病變、血流動(dòng)力學(xué)異常等，臨床主要表現(xiàn)為再通后無(wú)復(fù)流、慢血流和X綜合征。冠狀動(dòng)脈內(nèi)注射微栓塞球法和自體微血栓法為機(jī)械性栓塞，其產(chǎn)生栓塞的機(jī)理與血管堵塞造成心肌毛細(xì)血管阻力增加導(dǎo)致的冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙相似，不影響血管內(nèi)皮功能，不會(huì)引起炎癥反應(yīng)和微血管病變，也不能反映臨床上的多種發(fā)病機(jī)制?；瘜W(xué)損傷法通過(guò)化學(xué)損傷方法造成血管內(nèi)皮功能異常，可引起炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致冠狀動(dòng)脈微循環(huán)總阻力增加，其形成的微栓子機(jī)制和成分都與臨床非常相似。故通過(guò)化學(xué)損傷法建立的動(dòng)物模型與臨床冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙特點(diǎn)更為接近，適用于不同發(fā)病機(jī)制導(dǎo)致的冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙實(shí)驗(yàn)研究，有利于冠狀動(dòng)脈微循環(huán)障礙形成機(jī)制和治療的進(jìn)一步研究。

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