問號鉤端螺旋體重要蛋白研究進(jìn)展

曹志強，蔣秀高，張翠彩

鉤端螺旋體病(leptospirosis，簡稱鉤體病)是由致病性鉤端螺旋體(簡稱鉤體)感染引起的全球性人獸共患傳染病，流行范圍廣，危害大[1]。在我國，多發(fā)生于水稻種植區(qū)域，也是洪澇災(zāi)害時重點監(jiān)控的傳染病之一。數(shù)十年來通過鉤體全菌體疫苗的應(yīng)用, 對控制該病起到了重要作用。國內(nèi)外均采用當(dāng)?shù)亓餍械你^體血清群、型來制備多價鉤體疫苗菌苗，但副作用較大，交叉免疫保護(hù)作用微弱[2]。目前，許多國內(nèi)外學(xué)者致力于鉤體外膜蛋白的研究。外膜蛋白(outer membrane proteins，OMPs)位于鉤體表面，與宿主細(xì)胞直接接觸，是抗體和補體的作用部位，在鉤體與宿主相互作用的過程中發(fā)揮著重要作用。OMPs尤其是不同鉤體血清群、型均具有的OMPs是近幾年研究的熱點領(lǐng)域之一[3]，對抗原結(jié)構(gòu)的分析和屬特異性疫苗的研究具有理論指導(dǎo)的意義，對研制通用型鉤體疫苗及檢測試劑盒中有重要應(yīng)用價值和現(xiàn)實意義。近年來，隨著分子生物學(xué)手段、DNA測序技術(shù)及生物信息學(xué)分析水平的提高，對外膜蛋白的作用機制也不斷加深，本文就鉤體幾種重要蛋白的有關(guān)研究成果進(jìn)行綜述。

OMPs按照結(jié)構(gòu)和在細(xì)胞的分布可分為3類：第1類為含量較少的跨膜脂蛋白，如OmpL1；第2類為外膜脂蛋白，具有脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，是鉤體中含量最多的蛋白；第3類也為外膜蛋白，但是沒有跨膜結(jié)構(gòu)和脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，如: OmpA家族蛋白和熱休克蛋白。這3類蛋白具有許多共同的特點：都位于細(xì)胞膜表面；多數(shù)存在于致病性鉤體中，不存在非致病性鉤體中；核苷酸序列及蛋白質(zhì)序列高度保守。許多鉤體外膜蛋白是研究的熱點，如LipL41、LipL32、LipL36、LigA、LipL21、及Loa22等均被克隆及研究[4-8]。

1 跨膜蛋白

鉤體OmpL1是在致病性鉤端螺旋體中第一個被發(fā)現(xiàn)的跨膜蛋白，由320個氨基酸組成，分子量31 kDa。免疫電鏡證實:OmpL1定位于鉤端螺旋體表面。利用平面脂雙層試驗證實:OmpL1是一種外膜微孔蛋白，并發(fā)現(xiàn)OmpL1編碼基因以單拷貝形式存在于所有致病性鉤體的基因組中，而非致病性鉤體卻沒有,表明OmpL1蛋白質(zhì)可能與致病有關(guān)。目前認(rèn)為，OmpL1基因至少包括3種基因型OmpL1/1、OmpL1/2和OmpL1/3。具有OmpL1/1基因型的鉤體包括了秋季群和流感傷寒群, 具有OmpL1/2基因型的鉤體包括了黃疸出血群、犬群、澳洲群、波摩那群和七日熱群[9]，均為我國人群中流行最廣的鉤體血清群,而具有OmpL1/3基因型的鉤體均為國內(nèi)非主要流行的鉤體血清群。因此OmpL1/1和OmpL1/2較OmpL1/3基因型更為適合于研制鉤體屬特異性疫苗。MAT是在暗視野顯微鏡下，用活鉤體與相應(yīng)抗體進(jìn)行的免疫凝集實驗，其保護(hù)性抗體效價在1∶2以上即有可能有保護(hù)作用。Western blot結(jié)果表明,兔抗重組OmpL1/1和OmpL1/2血清均能與15群15型中國參考標(biāo)準(zhǔn)株鉤體及2群2型雙曲鉤體國際參考標(biāo)準(zhǔn)株鉤體發(fā)生凝集反應(yīng),MAT效價為1∶2～1∶32，1∶2～1∶16[10]，提示重組OmpL1/1和OmpL1/2為屬特異性蛋白抗原并有良好的免疫反應(yīng)性及抗原性。OmpL1核苷酸測序表明，該基因具有很高的穩(wěn)定性。不同基因型之間的核苷酸序列差異較大，氨基酸序列分析也與核苷酸分析相符。OmpL1作為一種跨膜蛋白，具有屬特異性表面膜蛋白免疫及診斷的特點。免疫印跡試驗提示重組OmpL1具有良好的抗原性，ELISA表明: 重組OmpL1可與感染同型鉤體的血清發(fā)生強烈反應(yīng)。Maneewatch等[11]，設(shè)計了問號鉤體黃疸出血群哥本哈型OmpL1的重組質(zhì)粒DNA疫苗，在對哺乳動物的實驗中發(fā)現(xiàn)，該疫苗加強了倉鼠免疫問號鉤體波摩那群波摩那型能力，但是效果并不理想。單獨使用該重組DNA疫苗的效果有待提高，聯(lián)合其它屬特異性疫苗肯效果更好。提示該蛋白可做為廣普疫苗和免疫診斷抗原的候選者[12]。

2 外膜脂蛋白

外膜脂蛋白在鉤體OMPs中含量最豐富，位于細(xì)胞膜上，在鉤體粘附、致病和免疫中起著十分重要的作用。類似于其他細(xì)菌的外膜脂蛋白，通過N-末端半胱氨酸與脂肪酸共價結(jié)合，錨定于外膜外側(cè)或外膜的胞質(zhì)側(cè)。鉤端螺旋體外膜脂蛋的名稱命名根據(jù)其大致分子量，如LipL21表示大致分子量為21 kDa的一類外膜脂蛋白。具有種屬特異性的主要包括LipL32、LipL41、LipL21、LipL36等。

2.1LipL41 LipL41是Shang等首先報道的問號鉤體屬特異性表面脂蛋白抗原之一, 該脂蛋白序列較為保守, 分子量約41 kDa[13]。我國15群15株問號鉤體參考標(biāo)準(zhǔn)株有LipL41/1和LipL41/2兩個基因型,前者包括了我國流行最廣的血清群[14]。

阮萍等[15]構(gòu)建了ltBlipL41/1和ctB-liL41/1兩種融合基因的原核表達(dá)系統(tǒng), 所表達(dá)的重組蛋白具有良好的免疫原性，但上述表達(dá)系統(tǒng)目的蛋白的產(chǎn)量均約為細(xì)菌總蛋白10%,有必要進(jìn)一步研究以提高表達(dá)產(chǎn)量。

免疫應(yīng)答過程中，T細(xì)胞和B細(xì)胞所識別的抗原表位具有不同特點，分別被稱為T細(xì)胞表位和B細(xì)胞表位。病原微生物感染時,但T細(xì)胞在產(chǎn)生高效價抗體過程中的輔助作用不可或缺。因此，若從制作抗原表位的多抗原肽(multiple antigenic peptide, MAP)疫苗角度考慮,采用T/B聯(lián)合表位更為合理和有效。姜久昆等[16]采用生物信息學(xué)方法，預(yù)測LipL41/1和LipL41/2基因型中T細(xì)胞和B細(xì)胞聯(lián)合抗原表位，認(rèn)為LipL41/1-30和LipL41/1-233的聯(lián)合抗原表位與不同抗血清的免疫雜交性反應(yīng)信號較強較穩(wěn)定，提示這兩個聯(lián)合表位可能是制作鉤體MAP疫苗的首選抗原表位。

2.2LipL32 LipL32的分子量為32 kDa，由272個氨基酸組成，是夠體中含量最多的OMPs。鉤體外膜脂蛋白LipL32只存在于致病性鉤體中，在非致病性鉤體中未發(fā)現(xiàn)[17]。LipL32較其他外膜蛋白在各血清群中保守性高，基因同源性為93.15%～99.16%[18], 蛋白質(zhì)一級序列同源性為95.12%～99.16%[17]。Seixas等[19]，用表達(dá)LipL32的重組卡介苗免疫倉鼠，再用致死劑量的問號鉤體哥本哈根型攻擊，尸檢和組織學(xué)檢查表明，接種重組卡介苗后，在注射了鉤體的動物體內(nèi)沒有找到發(fā)生鉤體病的證據(jù)，進(jìn)一步證實了LipL32的免疫保護(hù)效應(yīng)。此外，還有文獻(xiàn)報道[20]，抗LipL32的單克隆抗體可抑制體外鉤體的生長，也間接表明LipL32可誘導(dǎo)免疫保護(hù)作。

研究表明，LipL32的N端是由19個氨基酸組成的脂蛋白信號肽及其切割位點, 剪切后可得到成熟功能蛋白,比對GenBank中黃疸出血熱群、波莫那群和犬群的3株鉤體LipL32的氨基酸一級序列,順序完全相同[21-22], 說明LipL32的N端高度保守。Hauk等[23]將致病性鉤體哥本哈根群FiocruzL1-130株的LipL32 蛋白分成4個片段,包括全長、N端(21～92aa)、中部肽段(93～184aa)和C端(185～272aa),將這4個片段分別克隆到大腸桿菌表達(dá)載體中表達(dá), 發(fā)現(xiàn)全長蛋白可以檢出患者的IgM和IgG抗體,C端肽段可以檢出絕大部分患者的IgM和IgG抗體,中部肽段可以檢出IgG抗體, 而N端則不能檢出IgM和IgG抗體,表明LipL32蛋白的主要抗原表位可能集中在中部肽段和C端。同時研究表達(dá)了相對分子質(zhì)量為32 kD的重組LipL32蛋白, 結(jié)果顯示其具有良好的抗體結(jié)合能力,并且與我國存在的15個血清群的致病鉤體抗體均有很好的交叉反應(yīng)，提示重組LipL32有可能成為良好的血清學(xué)檢測抗原，應(yīng)用于屬范圍內(nèi)鉤體病的抗體初篩。

2.3LipL21 LipL21分子量為21 kDa，由186個氨基酸組成，含量僅次于LipL32。Cullen等(2003年)首先報告了問號鉤體黃疸出血群賴型具有LipL21脂蛋白基因,并認(rèn)為所有致病性鉤體均具有該基因及其表達(dá)產(chǎn)物。部分研究[24]表明，15群15型問號鉤體參考標(biāo)準(zhǔn)株均存在序列高度保守LipL21基因,其核苷酸和氨基酸序列相似性分別為98.75%～99.82%和99.46%～100%，提示LipL21基因序列高度保守。LipL21基因表達(dá)產(chǎn)物與其它外膜蛋白組分比較，其表達(dá)量并不高，按大腸桿菌偏愛密碼子改造該基因并進(jìn)一步優(yōu)化表達(dá)條件，有可能明顯提高其產(chǎn)量。Western blot結(jié)果表明，LipL21重組蛋白免疫家兔后，能有效地誘導(dǎo)動物產(chǎn)生LipL21重組蛋白特異性抗體并與之特異性結(jié)合，提示LipL21重組蛋白有良好的抗原性和免疫反應(yīng)性。MAT結(jié)果證實，兔抗LipL21重組蛋白血清均能與我國15群15型鉤體參考標(biāo)準(zhǔn)株發(fā)生效價為1∶16～1∶128的MAT凝集反應(yīng)，表明LipL21是鉤體自然狀態(tài)下表達(dá)、位于鉤體細(xì)胞表面的重要蛋白抗原。

2.4LipL36 lipl36基因在問號鉤體不同菌株中的變異較大，陽性檢測率為0%～90.91%[25]。提示LipL36的保守性不好。LipL36僅分布在外膜上， LipL36在地鼠體內(nèi)的表達(dá)與感染鉤體時鉤體的狀態(tài)有關(guān)，感染適應(yīng)了培養(yǎng)條件的鉤體時大量表達(dá)，而感染適應(yīng)了宿主條件的鉤體時不表達(dá)，且當(dāng)?shù)厥鬁囟冗_(dá)到37 ℃時也不表達(dá)。在體外培養(yǎng)過程中的表達(dá)量也不同：在對數(shù)生長早期表達(dá)量最大，在對數(shù)生長中期就開始下降。這可能與鉤體病的慢性感染機制有關(guān)，鉤體菌通過下調(diào)外膜蛋白表達(dá)量，逃避宿主的免疫反應(yīng)，從而在宿主體內(nèi)長期存活[26]。

2.5外膜脂蛋白小結(jié) 穿膜蛋白OMPL1、脂蛋白LipL32、LipL41和LipL21均是鉤體表面的蛋白抗原。與其它三種蛋白均具有不同基因型相比，脂蛋白LipL21只有一種基因型。OmpL1、Lip32或Lip41各自不同的基因型型表達(dá)產(chǎn)物間均存在相似的MHC-Ⅱ類分子結(jié)合肽和B細(xì)胞表位。

最新的研究[27]提出，問號鉤體賴株感染人單核細(xì)胞后，LipL21、LipL32、LipL41 基因mRNA水平迅速并持續(xù)下降(P<0．01)，GroEL、mce、loa22、ligB基因mRNA水平瞬時迅速升高(P<0．01)。問號鉤體賴株感染人巨噬細(xì)胞后主要OMPs抗原表達(dá)水平發(fā)生明顯變化。問號鉤體賴株染色體中存在一組調(diào)控外膜蛋白表達(dá)及組氨酸激酶的基因，其主要功能可能是下調(diào)感染過程中部分OMPs抗原表達(dá)水平。

3 其它的外膜蛋白

3.1OmpA家族蛋白 OmpA是一種在革蘭陰性菌中高度保守的外膜蛋白, 能誘導(dǎo)特異性的體液免疫和細(xì)胞免疫, 刺激樹突細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌[28]，還能輔助其他抗原內(nèi)化和交叉呈遞以及細(xì)胞黏附作用[29]。OmpA家族蛋白，在細(xì)胞侵襲、黏附及維持菌體外膜完整性上起著重要作用。具有良好的抗原性和保守性，并且能在鉤體感染的過程中刺激機體產(chǎn)生相應(yīng)的抗體。

鉤體賴株基因組中共有8個具有OmpA相關(guān)結(jié)構(gòu)域的基因，分別為：LA0056、LA0222、LA0301、LA2215、LA3615、LA3685、LA4337、LB328。其中Koizumi等[30]利用堿性磷酸酶啟動子融合表達(dá)系統(tǒng)和免疫雜交的方法，從L.manilaeUP-MMC株中篩選出一個編碼OmpA蛋白Loa22的基因(gi：LA0222)，并通過免疫印記證實該基因產(chǎn)物可能是致病性鉤體中所特有的新型毒力因子，驗證Loa22基因可能在鉤體感染過程中發(fā)揮重要的作用；Omp52(gi：LA3615)也被證實是位于外膜的具有良好免疫原性的抗原。Yang等[31]預(yù)測上述的8個基因中的LA0222、LA0301、LA3615和LB328可作為疫苗的候選基因。這4個基因均具有較好的抗原性和保守性。

3.2鉤體免疫球蛋白樣蛋白 鉤體免疫球樣(Leptospiral Ig-like,Lig)蛋白，含有一串約90個氨基酸的串連重復(fù)序列同源性分析表明，Lig蛋白的重復(fù)區(qū)域與多種細(xì)菌Ig蛋白類似。目前，共發(fā)現(xiàn)ligA、ligB及1igC 3種基因，均編碼10或11個似Ig的重復(fù)序列，其中LigA僅含Ig樣區(qū)域，LigB在C末端還有一獨特非重復(fù)區(qū)域，1igC變異較多，為假基因。LigA重組抗原均能檢測出國內(nèi)鉤體主要流行菌株15群15型免疫兔血清[32]，Lig基因僅存在于各種致病性鉤體，非致病性鉤體則沒有。用免疫細(xì)胞化學(xué)電子顯微鏡可觀察LigA、LigB位于菌體表面，是表面膜蛋白。

鉤體在28 ℃～30 ℃人工培養(yǎng)時幾乎不表達(dá)Lig，而在動物感染時可在體內(nèi)大量表達(dá)。免疫印跡證實Lig是急性鉤體感染時的主要抗原。Kirshneri鉤體和問號狀鉤體減毒后不表達(dá)Lig mRNA和Lig蛋白[33]，提示Lig蛋白與毒力有關(guān)。

Lig蛋白重復(fù)區(qū)域類似于細(xì)菌毒力因子(如粘附素和侵襲素)的lg樣蛋白重復(fù)域。Choy等[34]，發(fā)現(xiàn)Lig蛋白與鉤體黏附宿主相關(guān)，可能參與了鉤體病發(fā)病過程中鉤體的最初定植和體內(nèi)擴(kuò)散。鉤體入侵哺乳動物，Lig蛋白表達(dá)增強;不同血清群鉤體的病人血清均可與Lig蛋白反應(yīng);在鉤體豚鼠模型中，Lig蛋白可以誘導(dǎo)針對同源馬尼拉型和異源黃疸出血型的保護(hù)性免疫反應(yīng)，這些結(jié)果提示，Lig蛋白尤其是LigA可以誘導(dǎo)不同血清型鉤體的保護(hù)性免疫反應(yīng)。研究表明[35]，ligA DNA疫苗可產(chǎn)生明顯的免疫保護(hù)作用，該保護(hù)作用有體液免疫的參與和細(xì)胞免疫的介導(dǎo)。Foster KM等[36]制作了LigB DNA疫苗，與對照組倉鼠感染鉤體全部死亡相比，實驗組的保護(hù)率為62.5%，P<0.01，提示該疫苗有一定程度的保護(hù)作用。

3.3熱休克蛋白 熱休克蛋白是指細(xì)胞在應(yīng)激原特別是環(huán)境高溫誘導(dǎo)下所生成的一組蛋白質(zhì)，在生物界中高度保守、普遍存在。在感染、發(fā)炎等外界壓力下，微生物通過增加熱休克蛋白合成對其自身產(chǎn)生保護(hù)作用，同時可以誘導(dǎo)感染對象強烈的體液和細(xì)胞免疫反應(yīng)。

鉤體GroEL蛋白是熱休克蛋白家族中的一員，15群15型中國參考標(biāo)準(zhǔn)株鉤體中g(shù)roEL基因且其序列高度保守。問號鉤體GroEL位于鉤體外膜表面，是誘導(dǎo)宿主體液免疫反應(yīng)的主要抗原，鉤體病病人血清中可檢出GroEL抗體。蛋白分子結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明，GroEL為外膜蛋白，其96.9%(17/546) 序列位于菌體外。鉤體的最適生長溫度為30 ℃，而宿主的溫度為37 ℃，發(fā)熱階段可高達(dá)39 ℃，可能與熱休克蛋白的作用有關(guān)。

以往的一些研究認(rèn)為，GroEL是人和動物感染期的一個主要免疫原，但無免疫保護(hù)作用。最近的研究認(rèn)為，問號鉤體賴株感染巨噬細(xì)胞后，LipL21、LipL32、LipL41等外膜蛋白表達(dá)水平顯著下降,但GroEL表達(dá)水平顯著升高[27,38]。金地鼠是致病性鉤體的易感動物。國內(nèi)進(jìn)行了重組GroEL蛋白對金地鼠的免疫保護(hù)作用的研究，結(jié)果顯示100 μg與200 μg重組GroEL免疫的金地鼠存活率分別為50.0%和75.0%。重組GroEL免疫金地鼠血清對實驗中8群8株問號鉤體的MAT效價為1∶50～1∶400[37]。綜上所述，GroEL是序列保守、分布廣泛、抗原性較強的蛋白抗原，具備用于研制通用型鉤體基因工程疫苗的前景。

4 展 望

2001年10月,我國首先完成了鉤端螺旋體黃疸出血型賴株的全部基因組DNA測序和初步功能研究。應(yīng)用生物信息學(xué)推測, 在賴株的基因組中有百余個OMPs編碼基因，基因高度保守具有良好免疫原性的OMPs是鉤體的重要蛋白，也是當(dāng)下研究的熱門。國內(nèi)外均采用當(dāng)?shù)亓餍械你^體血清群、型來制備多價鉤體疫苗菌苗，但副作用較大，交叉免疫保護(hù)作用微弱。許多鉤體外膜蛋白或外膜脂蛋白具有良好的抗原性和保守性，其抗體具有廣泛的交叉凝集作用，多種蛋白抗原聯(lián)合應(yīng)用效果可能更好。外膜疫苗正在研究當(dāng)中，有些已證實具有良好的免疫原性和保護(hù)作用，但迄今還沒有大規(guī)模的進(jìn)行人體免疫接種。隨著社會經(jīng)濟(jì)的不斷發(fā)展，衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)學(xué)的研究進(jìn)展，我們越來越需要更加安全、高效、成本低的鉤體疫苗。隨生物技術(shù)的不斷進(jìn)步，在基因和蛋白分子水平對鉤體重要蛋白的研究也會更加深入。

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