中草藥抗巨細(xì)胞病毒作用的研究進(jìn)展

陳 恬，蘭婉瑩，王永洪，袁溯陽(yáng)，譚予釩，呂益飛

(1.成都醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610500；2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，山西 太谷 030801)

人巨細(xì)胞病毒(Human cytomegalovirus, HCMV)屬于β皰疹病毒亞科，人巨細(xì)胞病毒感染在我國(guó)較為廣泛，一般人群HCMV抗體陽(yáng)性率為86%～96%，而在孕婦可高達(dá)95%左右。HCMV是一種條件致病因子，當(dāng)感染生理性或病理性免疫抑制個(gè)體時(shí)，易引起播散性疾病或單一器官損害[1]。該病毒一旦侵入機(jī)體可在體內(nèi)長(zhǎng)期潛伏，主要潛伏于唾液腺、乳腺、腎臟、外周血的單核細(xì)胞和淋巴細(xì)胞之中，機(jī)體免疫力下降時(shí)可被重新激活導(dǎo)致疾病發(fā)生。HCMV是母嬰宮內(nèi)和產(chǎn)后感染最常見的病原體之一，妊娠時(shí)激活病毒，引起流產(chǎn)、死胎、胎兒畸形、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育遲緩、聽力和視力障礙、血液系統(tǒng)病變和嬰兒肝炎等嚴(yán)重疾病[2]。同時(shí)，HCMV感染也是免疫功能低下的人群如器官移植和AIDS患者并發(fā)感染死亡的常見原因之一[3]。

目前用于治療HCMV感染的藥物主要有更昔洛韋、膦甲酸、西多福韋等，但大多具有較強(qiáng)的毒副作用，動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)更昔洛韋具有致癌和致畸的潛能，且已有耐藥株產(chǎn)生[4]。其它關(guān)于抗HCMV藥物的研究主要還有疫苗、抗體和中草藥等方面。由于HCMV具有結(jié)構(gòu)復(fù)雜、編碼蛋白種類多、致病性強(qiáng)等特點(diǎn)，各種候選疫苗又有各自的缺點(diǎn)，以致現(xiàn)在還沒有一種HCMV疫苗獲準(zhǔn)上市[5]。在抗體類藥物研究中主要問題是制備技術(shù)難度高、抗體的獲取量少和穩(wěn)定性差[6]。中草藥具有較強(qiáng)的抗病毒作用，如SARS病毒、艾滋病病毒、流感病毒等，在臨床上被廣泛用于治療多種病毒性疾病[7]。因此，進(jìn)行中草藥抗HCMV研究有很大的前景，但目前國(guó)內(nèi)外在中草藥抗HCMV方面的研究不多且不深入。

1 復(fù)方制劑抗CMV作用的研究

1.1 金葉敗毒制劑 金葉敗毒制劑又名熱毒清(主要成分為魚腥草、金銀花、大青葉、蒲公英等)。該藥已經(jīng)過長(zhǎng)期的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用，證實(shí)其具有抗病毒和提高機(jī)體免疫力的作用，且臨床使用前的毒性實(shí)驗(yàn)和安全性實(shí)驗(yàn)均為陰性。洪艷麗等[8]研究發(fā)現(xiàn)，由于HCMV需要利用宿主細(xì)胞內(nèi)的物質(zhì)進(jìn)行復(fù)制，所以在病毒感染早期，病毒會(huì)通過自身抗凋亡基因以阻止細(xì)胞凋亡，但在病毒感染后期，HCMV則通過誘導(dǎo)宿主細(xì)胞凋亡而發(fā)揮致病效應(yīng)，處在S期和G2/M期細(xì)胞的阻滯使細(xì)胞出現(xiàn)非整倍體和染色體結(jié)構(gòu)的改變，這可能是HCMV感染導(dǎo)致細(xì)胞及胚胎發(fā)育異常的重要原因。金葉敗毒制劑能明顯抑制HCMV感染誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，同時(shí)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期，減少S和G2/M期細(xì)胞，增加G0/G1期細(xì)胞。金葉敗毒制劑將細(xì)胞阻滯于G0/G1期，有利于阻止病毒利用宿主細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行DNA復(fù)制與晚期蛋白的合成，這可能是金葉敗毒制劑抗病毒的作用機(jī)制之一。

HCMV感染孕絨毛組織可引起絨毛滋養(yǎng)層細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)的病理改變并且影響孕期絨毛組織的hCG的分泌，導(dǎo)致不良妊娠[9]。金葉敗毒制劑可作為治療和預(yù)防HCMV宮內(nèi)感染的藥物，對(duì)胎盤組織無毒性作用，能明顯增加HCMV感染后hCG的分泌，可通過抑制HCMV的IE基因轉(zhuǎn)錄和蛋白合成達(dá)到抗病毒效應(yīng)。具體機(jī)制可能是由于金葉敗毒制劑使磷酸化ERK1/2表達(dá)降低，對(duì)ERK1的抑制作用在感染后10 min出現(xiàn)，30 min達(dá)到高峰，對(duì)ERK2的抑制作用在感染后10 min出現(xiàn)，60 min達(dá)到高峰，而更昔洛韋對(duì)ERK1/2無明顯的抑制作用[10]。由此認(rèn)為金葉敗毒制劑可能通過調(diào)節(jié)MAPK/ERK通路而抑制HCMV基因的表達(dá)和復(fù)制，從而發(fā)揮部分抗病毒作用。目前臨床一線藥在治療HCMV感染宮內(nèi)感染方面存在較大安全問題，因此對(duì)金葉敗毒制劑的研究有重要意義。

另外，崔文華等[11]用金葉敗毒制劑對(duì)感染鼠巨細(xì)胞病毒(MCMV)的小鼠進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，通過檢測(cè)細(xì)胞病變及熱休克蛋白70(HSP70)的表達(dá)，得出金葉敗毒制劑能抑制感染MCMV小鼠細(xì)胞病變的結(jié)論，且作用時(shí)間長(zhǎng)于更昔洛韋，并能促進(jìn)小鼠細(xì)胞表達(dá)HSP70抑制細(xì)胞病變。提示金葉敗毒制劑可增強(qiáng)病毒感染細(xì)胞中HSP70表達(dá)，這可能是其抗MCMV的分子機(jī)制之一。因?yàn)槿司藜?xì)胞病毒的唯一宿主是人，所以研究者用感染鼠巨細(xì)胞病毒的小鼠進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，其研究結(jié)果具有一定的借鑒性。

1.2 雙黃連 雙黃連(主要成分為金銀花、黃苓、連翹)是臨床常用的中成藥。吳建軍等[12]用HCMV感染免疫力低下的小鼠建立HCMV病毒肝炎模型，并用不同劑量的雙黃連粉針劑治療，發(fā)現(xiàn)HCMV的DNA載量明顯降低，肝臟病理?yè)p傷明顯減輕，血清轉(zhuǎn)氨酶下降，其可能的機(jī)制是雙黃連粉針劑能抑制病毒復(fù)制，清除脂質(zhì)過氧化物及自由基，從而在HCMV感染中保護(hù)肝臟免遭損傷。雙黃連對(duì)HCMV的具體作用機(jī)制尚不明確，但具有保肝的功效。

1.3 茵梔黃口服液 茵梔黃口服液是由茵陳、梔子的提取物、黃芩的有效成分黃芩苷以及金銀花配制而成，是目前中藥制劑中治療HCMV肝炎的有效制劑。曹美玲等[13]對(duì)茵梔黃口服液治療HCMV肝炎的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，主要是用茵梔黃口服液聯(lián)合更昔洛韋治療新生兒巨細(xì)胞病毒肝炎，并觀察其對(duì)血清腫瘤壞死因子 (TNF)和干擾素(IFN)的影響。在治療后，茵梔黃口服液聯(lián)合更昔洛韋組和更昔洛韋組的TNF-α均較治療前降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且茵梔黃治療組治療后TNF-α下降更顯著。兩組治療后IFN-γ較治療前略有升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示茵梔黃口服液可以通過調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能治療HCMV肝炎，可用于臨床輔助治療HCMV肝炎。

2 中草藥粗提物抗CMV作用的研究

2.1 白菊花 菊花所含的葡糖醛酸苷等黃酮類化合物具有抗人類免疫缺陷病毒(HIV)的作用[14]。彭春仙[15]等人用不同濃度的白菊花提取物(主要有效成分為小白菊內(nèi)酯醇)處理HCMV感染的人胚肺成纖維細(xì)胞(HEL)，用MTT法和流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)細(xì)胞的存活率與凋亡率。結(jié)果表明在一定范圍內(nèi)隨白菊花提取物濃度增加細(xì)胞的存活率增加，凋亡率減少。用Western blot檢測(cè)顯示白菊花提取物能降低Caspase-3、6、7、9和NF-KB的蛋白表達(dá)，且隨濃度升高，蛋白的表達(dá)量有逐漸減少的趨勢(shì)。白菊花提取物對(duì)HCMV誘導(dǎo)的HEL細(xì)胞凋亡有不同程度的抑制作用，其機(jī)制可能與抑制細(xì)胞中凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3、6、7、9和NF-KB信號(hào)傳導(dǎo)通路激活有關(guān)。

2.2 白穎苔草 白穎苔草提取物可抗HSV、HCMV和甲、乙型流感病毒[16]。李廣云等[17]在白穎苔草提取物抗HCMV作用的機(jī)制研究中，利用HCMV轉(zhuǎn)錄表達(dá)呈級(jí)聯(lián)方式的特點(diǎn)，用RT-PCR檢測(cè)病毒即刻早期基因UL122、早期基因UL44、晚期基因UL86 mRNA的轉(zhuǎn)錄表達(dá)量，反映出白穎苔草提取物發(fā)揮抗HCMV作用的時(shí)間段。結(jié)果顯示白穎苔草提取物不是在病毒的吸附、穿入階段起作用，不影響HCMV的IE基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。但是白穎苔草提取物能抑制UL32和UL86的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，表明白穎苔草抑制HCMV復(fù)制靶點(diǎn)位于復(fù)制周期的晚期UL32轉(zhuǎn)錄表達(dá)之前。

2.3 冬蟲夏草 冬蟲夏草是中國(guó)非常名貴的中藥材，目前仍無法人工培養(yǎng)，但具有多種重要的藥理作用，如抗腫瘤、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等，尤其可以增強(qiáng)NK細(xì)胞的殺傷能力和激活巨噬細(xì)胞[18]。王茂水[19]的研究表明，冬蟲夏草水提取物可以有效抑制人巨細(xì)胞病毒的復(fù)制，其最大無毒濃度為0.5 mg/mL，半數(shù)抑制濃度(IC50)為0.17 mg/mL，且在0.4 mg/mL時(shí)具有很強(qiáng)的抗人巨細(xì)胞病毒的活性。用免疫印跡分析冬蟲夏草水提取物抗人巨細(xì)胞病毒的作用靶位時(shí)，發(fā)現(xiàn)冬蟲夏草水提取物可以輕度抑制IE1的表達(dá)，阻斷IE2、UL84的表達(dá)至檢測(cè)限下。由此可初步推測(cè)冬蟲夏草水提取物抑制人巨細(xì)胞病毒的復(fù)制靶點(diǎn)為IE1/IE2和UL84。

2.4 穿心蓮 張丹丹等[20]的研究顯示，穿心蓮提取物具有抗HCMV的效果，其抗病毒作用高于金銀花、魚腥草、大青葉；細(xì)胞毒性與金銀花相同、略高于魚腥草、大青葉，遠(yuǎn)低于更昔洛韋。穿心蓮治療指數(shù)高于金銀花和更昔洛韋，與魚腥草、大青葉相同，具有潛在的臨床應(yīng)用前景，值得深入研究其作用機(jī)制。

2.5 其它 何超蔓等研究表明[21]，板藍(lán)根、路邊青在體外都有一定的抗HCMV作用。通過實(shí)驗(yàn)得到更昔洛韋、板藍(lán)根、路邊青的治療指數(shù)分別是8，3.41，3.54。雖然板藍(lán)根注射液和路邊青注射液抗HCMV的效果低于更昔洛韋，但它們具有藥源充足，經(jīng)濟(jì)方便，毒副作用小，患者易接受等優(yōu)點(diǎn)。目前存在的問題是這幾種中草藥的有效成分和具體作用機(jī)制尚不清楚，所以還有待繼續(xù)研究以便指導(dǎo)臨床用藥。此外，土茯苓也具有抗HCMV的作用，其細(xì)胞毒性略低于金葉敗毒，大大低于更昔洛韋；抗HCMV效果與金葉敗毒相同，略低于更昔洛韋[22]。三者中土茯苓治療指數(shù)最高，有可能成為治療HCMV活動(dòng)性感染的藥物,但目前還未對(duì)其作用機(jī)制進(jìn)行深入地研究。

3 中草藥單體成分抗CMV作用的研究

3.1 大蒜新素 大蒜新素(又名大蒜素)是大蒜的有效成分之一，首先由國(guó)內(nèi)學(xué)者發(fā)現(xiàn)大蒜新素在體外能有效抑制HCMV增殖。甄宏等[23]的研究中用不同濃度大蒜新素均能使HCMV的IE72和IE86表達(dá)強(qiáng)度下降，對(duì)IE86表達(dá)的抑制率為IE72的2倍左右。與更昔洛韋相比，大蒜新素對(duì)IE72的抑制率低于更昔洛韋，而對(duì)IE86的抑制效應(yīng)高于更昔洛韋。由此可見，大蒜新素能抑制HCMV的IE72和IE86的表達(dá)，這可能是大蒜新素抑制HCMV增值的關(guān)鍵環(huán)節(jié)之一。周華等[24]對(duì)大蒜新素進(jìn)行小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)小鼠感染MCMV后，TGF-β1和IL-10分泌均顯著增高，并呈現(xiàn)出急慢性期兩次高峰的特點(diǎn)。MCMV感染鼠在使用大蒜新素治療后，各時(shí)間點(diǎn)TGF-β1水平均有下調(diào)，慢性期的IL-10分泌顯著下調(diào)。最后得出的結(jié)論是大蒜新素能顯著抑制MCMV感染后小鼠TGF-β1和IL-10的分泌，進(jìn)而增強(qiáng)機(jī)體細(xì)胞免疫功能而有利于清除MCMV，這可能是大蒜新素抗MCMV的一個(gè)重要機(jī)制。提示大蒜新素既可以直接作用于HCMV又能通過提高機(jī)體免疫力清除體內(nèi)病毒，所以具有較強(qiáng)的抗病毒作用。

此外，葛海霞等[25]對(duì)大蒜新素治療鼠巨細(xì)胞病毒感染小鼠的內(nèi)臟病理改變進(jìn)行研究。研究者通過對(duì)大蒜新素治療組進(jìn)行肝、肺、腎和心肌的病理評(píng)分發(fā)現(xiàn)，肝組織的病理評(píng)分在治療后第14天即顯著降低，以后差異逐漸增大；肺組織病理評(píng)分在治療后第28天顯著下降，以后差異逐漸增大；腎組織和心肌組織的病理評(píng)分在治療后14d 有明顯降低,在90d差異更顯著。同時(shí)，在同一模型上用RT-PCR方法定量檢測(cè)大蒜新素治療組和安慰藥組病毒DNA，結(jié)果和病理評(píng)分相一致。提示大蒜新素在鼠巨細(xì)胞病毒感染的急性期可能主要通過降低臟器組織內(nèi)的病毒滴度,使臟器的病理?yè)p傷得以修復(fù)。

3.2 苦參堿 蘭安杰[26]的研究中表明苦參堿具有抗HCMV的作用，并通過不同的加藥方式，得出苦參堿的作用機(jī)制可能是作用于病毒吸附后的增殖階段這一結(jié)論。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示苦參堿可抑制HCMV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，并可明顯抑制HCMV在HEL細(xì)胞內(nèi)增殖，在MTC范圍內(nèi)成劑量依賴性的趨勢(shì)。另外，體內(nèi)實(shí)驗(yàn)表明，苦參堿能明顯減輕MCMV對(duì)小鼠組織的損害，降低小鼠組織內(nèi)MCMV病毒DNA的負(fù)荷量，其治療效果與更昔洛韋對(duì)照組無顯著差異。

3.3 黃芩素 有研究表明，在體外絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞感染人巨細(xì)胞病毒后，黃芩素能影響絨毛外滋養(yǎng)層細(xì)胞中血管活性腸肽(VIP)的表達(dá)[27]。研究者通過檢測(cè)病毒的抗原，感染細(xì)胞的病毒DNA載量和感染的滋養(yǎng)層細(xì)胞中VIP的mRNA和蛋白含量，最后得出的結(jié)果為，在滋養(yǎng)層細(xì)胞感染病毒48小時(shí)后可發(fā)現(xiàn)HCMV的pp65抗原，第6天達(dá)到最高峰。黃芩素治療后，感染的滋養(yǎng)層細(xì)胞病毒DNA載量明顯降低(P<0.05)，VIP的mRNA和蛋白表達(dá)量提高到正常水平(P>0.05)。在母胎界面，黃芩素對(duì)人巨細(xì)胞病毒感染的滋養(yǎng)層細(xì)胞VIP的表達(dá)有積極影響。

3.4 金絲桃素 金絲桃素、苦味葉下珠水溶液浸出物及茵陳水溶性提取物的溶液分別在6.25、10、3.2 mg/mL濃度下均表現(xiàn)出對(duì)病毒引起的細(xì)胞病變的有較強(qiáng)抑制作用，且隨藥物濃度升高抑制作用增強(qiáng)。三者的治療指數(shù)(TI)分別為10.23、6.06、4.64。3種中藥抗HCMV的作用均較更昔洛韋弱，但金絲桃素抗HCMV的效應(yīng)最近接更昔洛韋[28]。所以金絲桃素具有深入研究的價(jià)值，應(yīng)繼續(xù)進(jìn)行抗病毒的作用機(jī)理和動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)等方面的研究，以便該藥可推廣到臨床。

3.5 綠原酸 綠原酸是金銀花的主要有效成分，具有抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、清除氧自由基等多種功效[29]。陳娟娟等[30]研究顯示，綠原酸的細(xì)胞毒性略高于金葉敗毒制劑和金銀花，但低于更昔洛韋；并且綠原酸抗病毒作用最強(qiáng)，其治療指數(shù)為更昔洛韋的10倍，為金葉敗毒制劑的300倍，為金銀花的3 000倍。因此，綠原酸具有抗HCMV的潛在優(yōu)越性，有望成為治療孕期活動(dòng)性感染和阻斷HCMV宮內(nèi)傳播的藥物。

3.6 槲皮素 張丹丹等[31]進(jìn)行了槲皮素體外抗HCMV的研究，并與連翹和更昔洛韋作對(duì)比。研究結(jié)果顯示更昔洛韋、連翹和槲皮素的治療指數(shù)分別為1、1、10。槲皮素抗HCMV效果大大高于更昔洛韋和連翹，細(xì)胞毒性與連翹相同，比更昔洛韋低。提示槲皮素具有良好的抗HCMV效果，且細(xì)胞毒性較低。

3.7 姜黃素 姜黃素是從姜科植物的根莖中提取的一種植物多酚，多存在于中藥姜黃和郁金中，也較多存在于咖喱中[32]。呂亞麗等[33]進(jìn)行了姜黃素體外抗HCMV作用的研究，實(shí)驗(yàn)用更昔洛韋作為陽(yáng)性對(duì)照，通過用細(xì)胞病變法和MTT法，得到了更昔洛韋和姜黃素的治療指數(shù)，分別為16.57和102.42。結(jié)果顯示姜黃素在體外有顯著的抗HCMV作用。目前尚未有姜黃素抗HCMV的作用機(jī)制研究報(bào)道。

3.8 黃芩苷 黃芩苷是由黃芩素與一分子葡萄糖醛酸結(jié)合形成的苷類化合物，二者在黃芩中同時(shí)存在。黃芩苷可以減少HCMV誘導(dǎo)HEL細(xì)胞凋亡的數(shù)量，主要是通過抑制凋亡執(zhí)行基因pro-caspase-3的激活，表現(xiàn)出較強(qiáng)的細(xì)胞保護(hù)作用[34]。黃永建[35]用中效劑量黃芩苷腹腔注射治療MCMV播散感染模型小鼠達(dá)14 d，在整體水平證實(shí)，黃芩苷能顯著減輕MCMV 感染所致肝組織病理?yè)p害，促進(jìn)sALT 恢復(fù)正常，減少機(jī)體組織內(nèi)感染性病毒的數(shù)量。表明黃芩苷在體內(nèi)有抗MCMV效應(yīng)，并對(duì)MCMV 肝炎有治療作用。通過檢測(cè)MCMV感染小鼠的Th1類細(xì)胞因子IFN-γ和Th2類細(xì)胞因子IL-4表達(dá)水平，以及Th1/Th2類細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子TBX21 /GATA3蛋白表達(dá)水平，證明黃芩苷在MCMV急性感染早期可明顯上調(diào)TBX21蛋白進(jìn)而促進(jìn)Th1細(xì)胞免疫應(yīng)答而有利于機(jī)體清除病毒，并對(duì)MCMV誘導(dǎo)的Th1/Th2細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)改變有一定調(diào)節(jié)作用。

4 展望

中草藥提取物和復(fù)方制劑可通過多種途徑發(fā)揮抗HCMV作用，其中比較重要的有調(diào)節(jié)信號(hào)通路、抑制病毒復(fù)制和增強(qiáng)機(jī)體免疫力。相對(duì)于臨床常用西藥，中草藥一般毒副作用較小，多數(shù)有抗病毒作用，并且還具有價(jià)格低廉，來源廣泛的優(yōu)勢(shì)，所以中草藥抗HCMV具有較好的研究?jī)r(jià)值。但是目前國(guó)外對(duì)此的研究報(bào)道還比較少，國(guó)內(nèi)大多數(shù)的研究都只停留于中草藥抗HCMV治療指數(shù)的研究上，對(duì)機(jī)制的研究比較缺乏，這會(huì)影響具有抗HCMV作用的中草藥在臨床上的應(yīng)用，因此，中草藥抗HCMV作用的機(jī)制應(yīng)全面深入地研究，而且還應(yīng)注意體外和體內(nèi)研究相結(jié)合，以免出現(xiàn)藥物在體外實(shí)驗(yàn)有效而在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)無效的現(xiàn)象，但目前關(guān)于HCMV的動(dòng)物模型尚不成熟,這是限制抗HCMV藥物研究的重要因素[36]。除此之外，在復(fù)方制劑、中草藥粗提物以及單體成分中的研究中，中草藥單體成分的研究由于較容易明確具體的有效成分及相關(guān)的作用機(jī)制，所以更有發(fā)展前景，但同時(shí)也面臨篩選單體成分困難和提純花費(fèi)大等問題。目前已有部分復(fù)方制劑應(yīng)用于臨床，但由于其有效成分和作用機(jī)制不完全明確，在臨床應(yīng)用中受到一定的限制。從中草藥抗HCMV作用的研究到相應(yīng)的藥物應(yīng)用于臨床還需要更多研究者的努力。

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