蚓激酶的研究進(jìn)展

呂 飛王春雷孫晉民

（1.中國醫(yī)科大學(xué)96期臨床醫(yī)學(xué)系，沈陽 110001；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院；3.中國醫(yī)科大學(xué)實驗技術(shù)中心一部）

蚓激酶的研究進(jìn)展

呂 飛1王春雷2孫晉民3

（1.中國醫(yī)科大學(xué)96期臨床醫(yī)學(xué)系，沈陽 110001；2.中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院；3.中國醫(yī)科大學(xué)實驗技術(shù)中心一部）

文章綜述蚓激酶抗血栓、調(diào)節(jié)血脂、抗腫瘤等方面的研究進(jìn)展。

蚓激酶；研究；進(jìn)展

蚓激酶（Lumbrokinase, LK），又稱作蚯蚓纖溶酶（earthworm plasminogen activator, EPA），是從蚯蚓體內(nèi)提取的一種具有纖溶活性的蛋白水解酶。蚓激酶作為纖溶藥物已有近20年的使用歷史，近年來則證實蚓激酶還具有抗腫瘤等作用。本文從蚓激酶的基本性質(zhì)以及應(yīng)用等方面對蚓激酶加以綜述。

1 基本性質(zhì)

1.1 研究歷史及命名 自古以來人們對蚯蚓（中藥地龍）就深有研究，在我國傳統(tǒng)醫(yī)藥學(xué)中蚯蚓作為中藥具有解熱、定驚、利尿、降壓等功效，蚯蚓提取物中含有纖溶成分在我國古代醫(yī)藥文獻(xiàn)中早已有記載，在李時珍編寫的《本草綱目》中，將地龍曬干磨粉用于血栓疾病的治療[1]。在20世紀(jì)20年代，F(xiàn)rederice就報道了蚯蚓溶解纖維蛋白的作用。1983年，日本宮崎醫(yī)科大學(xué)Mihara等從粉正蚓蛋白粗提物中分離到了來自≥4種不同基因的6種蛋白水解酶，將這些酶均具有纖溶活性，共同命名為lumbrokinase（LK），即蚓激酶，亦稱蚯蚓纖溶酶（EPA）[2]。我國學(xué)者路英華、饒育雄等在蚓激酶成分提取中做出了早期貢獻(xiàn)。時至今日，百奧、降寧、儒展等多家公司已研發(fā)出腸溶片、腸溶膠囊、注射藥等劑的蚓激酶藥物，用于血栓性疾病的治療.

1.2 理化性質(zhì) 國外有學(xué)者研究指出，這6種蚓激酶是最適溫度為50℃，最適pH值為4～12，等電點pI為4.33，N-端前20～22個氨基酸殘基序列具有高度同源性的同工酶，這些具有纖溶活性的酶主要來自蚯蚓體前部的消化管上皮細(xì)胞中，特別是靠近生殖環(huán)處[2-6]。根據(jù)底物特異性，這些蚓激酶均屬絲氨酸蛋白酶，可分為胰蛋白酶類型、胰凝乳蛋白酶類型、彈性蛋白酶和胰蛋白酶類型。酶在熱穩(wěn)定性和酸穩(wěn)定性上具有一定的共性，熱穩(wěn)定性：該酶在＜55℃放置1 h活力基本不變；＞60℃時，酶活力迅速下降；當(dāng)溫度到達(dá)70℃時，酶已完全失活。酸穩(wěn)定性：酶在pH值4～11之間活力變化很??；pH值8～9時，該酶穩(wěn)定性最好，活力較高。而這些酶在聚合性、含糖量上又表現(xiàn)出特異性，并認(rèn)為蚓激酶的糖鏈可能在保護(hù)蚓激酶被胰蛋白酶的降解和蚓激酶的纖溶活性上有一定的作用。關(guān)于蚓激酶的基因研究方面，目前在Genebank中登錄的Earthworm Fibrinolytie Enzyme或Lumbrokinase基因有21個，蛋白質(zhì)序列有31條，這21個蚓激酶基因來自Eisenia fetida、Lumbricus bimastus、Lumbricusrubellus三個蚓種或人工合成。蚓激酶干粉的制作工藝也會影響到活性，Wang等[7]研究顯示，LK的活性除了受溫度、pH值的影響外，金屬離子Na+、K+、Mg2+對此酶有一定的抑制作用，Hg2+對其有強烈抑制作用，Ca2+可提高此酶活力。劉向輝等[8]研究顯示，改變飼養(yǎng)條件（牛糞餌料、含砷餌料）和抽提條件（酒精抽提）可提高蚓激酶的提取活性。Fu等[9]研究顯示，冷凍干燥制得的蚓激酶干

粉較陽光干燥的蚓激酶干粉有更高的纖溶活性。

2 抗血栓作用

何執(zhí)中等[10]研究顯示，蚓激酶具有抗凝纖溶抗血栓作用，而且其效果要優(yōu)于尿激酶、葡激酶、蛇毒纖溶酶原激活劑等傳統(tǒng)藥物，其具體機制包括：與纖維蛋白和纖維蛋白原有特殊的親和力，并能降解纖維蛋白和纖維蛋白原，激活纖溶酶原形成纖溶酶，增強纖溶激活因子t-PA并抑制其抑制物PAI-I，抗血小板聚集作用。以往蚓激酶抗血栓作用研究中常用的指標(biāo)包括：白陶土部分活酶時間（KPTT）、凝血酶原時間（PT）、優(yōu)球蛋白溶解時間（ELT），KPTT和PT延長說明蚓激酶可作用于內(nèi)源性和外源性凝血途徑，而PT縮短則說明蚓激酶可作用于纖溶系統(tǒng)。近年來的研究則對蚓激酶抗凝纖溶機制做出了補充：Ji等[11]研究顯示，蚓激酶通過AC-cAMP-Ca2+途徑減弱糖蛋白ⅡA/ⅢB和血小板選擇蛋白的表達(dá)，實現(xiàn)抗血小板作用；畢輝等[12]通過大鼠體外實驗顯示，蚓激酶能夠抑制大鼠血小板胞漿[Ca2+]i升高和JNK1的磷酸化，同時也能抑制血小板Ps（P-選擇素，又稱顆粒膜蛋白）的表達(dá)水平的升高，從而起到抗血小板活化作用；許超千等[13]通過動靜脈旁路血栓模型研究顯示，蚓激酶降低血小板聚集率和黏附率，而對血小板數(shù)無影響。

蚓激酶作為抗血栓藥物自1995年以來便被臨床使用。腦梗死，又稱為卒中、中風(fēng)，是頸內(nèi)動脈虹吸部或大腦中動脈起始部動脈粥樣硬化后血栓形成引起的神經(jīng)功能失常。除抗凝溶栓作用外，蚓激酶還具有神經(jīng)修復(fù)功能，其具體機制包括：王莉安等[14]以大鼠為研究對象證實，蚓激酶可以從轉(zhuǎn)錄翻譯水平增加腦組織的JAK1蛋白（抗神經(jīng)細(xì)胞凋亡）表達(dá)而降低STAT1蛋白（活化caspase蛋白，促進(jìn)神經(jīng)細(xì)胞凋亡）；Huang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，蚓激酶可以通過抑制具有促炎作用的NFκB/iNOS/ COX-2通路減輕側(cè)流煙氣導(dǎo)致的倉鼠海馬系統(tǒng)的損傷?？鼓芩ㄗ饔煤蜕窠?jīng)修復(fù)作用使得蚓激酶成為腦梗死的理想藥物[16]。同樣，蚓激酶也可用于其他部位的血栓性疾病：如可以治療冠脈粥樣硬化后血栓引起的心絞痛，增加缺血心肌的血流灌注。孫宏麗等[17]通過大鼠急性心肌缺血模型研究發(fā)現(xiàn)，蚓激酶抑制ICa-L及下調(diào)[Ca2+]i發(fā)揮心肌保護(hù)作用；Zhang等[18]通過大鼠研究證實，蚓激酶可降低對心肌缺血有促進(jìn)作用的P,E-選擇素表達(dá)，從而發(fā)揮心肌保護(hù)作用；蚓激酶還可治療內(nèi)耳微循環(huán)變化迷路血栓形成導(dǎo)致的突發(fā)性耳聾，改善耳鳴、眩暈、耳堵塞感等自覺癥狀[19]；也被用于治療視網(wǎng)膜中央靜脈阻塞所致眼底病。

3 調(diào)節(jié)血脂

蚓激酶還可以通過多種途徑控制血脂，調(diào)節(jié)血液黏滯度，從而控制血栓。徐晟等[20]研究顯示，蚓激酶既能延緩大鼠高脂血癥的形成，又對高脂血癥有一定的治療作用，其具體機制包括：①降低脂肪酶活性，減少甘油三脂和膽固醇的吸收，從根源上降低血脂[21]。②活化膽固醇7a-羥化酶，促進(jìn)由腸道排泄出膽固醇；調(diào)節(jié)脂蛋白的新陳代謝，降低低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）的濃度水平，增加高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）的濃度水平，最終起到控制大鼠血漿膽固醇濃度的作用。③加速甘油三酯水解為甘油和脂肪酸。④清除肝臟中脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生的自由基，提高肝臟超氧化物歧化酶（SOD）活性，減少肝臟氧化損傷[22]。蚓激酶抗氧化作用對多種損傷有保護(hù)作用，Zhang等[23]研究顯示，蚓激酶等蚯蚓提取物能通過抗氧化作用促進(jìn)二級燒傷傷口恢復(fù)。⑤保護(hù)肝細(xì)胞的質(zhì)膜、線粒體膜，既保持細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整性，又避免級聯(lián)損傷。⑥減少肝臟血管內(nèi)皮細(xì)胞ICAM-1的表達(dá)，抑制炎癥反應(yīng)對肝臟的損傷[24]。蚓激酶對血液流變學(xué)也會產(chǎn)生變化。血液黏滯度取決于血液中的紅細(xì)胞、纖維蛋白原、甘油三酯、膽固醇等，因此蚓激酶抗凝溶栓降血脂作用后有改善血液黏滯度的作用。血脂和血液黏滯度的升高可直接導(dǎo)致高脂血癥和高黏血癥，還可以促進(jìn)一些疾病的發(fā)展，如腦梗死、心絞痛等心腦血管疾病及其并發(fā)癥，腎病綜合征并發(fā)的血栓栓塞癥，糖尿病眼病、腎病等，因此蚓激酶也用于腎病、糖尿病的治療[25-26]。

4 抗腫瘤

在20世紀(jì)初就發(fā)現(xiàn)蚯蚓提取物“地龍2號”有抑制腫瘤、延長壽命的作用。也有多項實驗證明了蚓激酶體腔分泌物和白細(xì)胞在體內(nèi)體外的抗腫瘤作用[27]。蚓激酶與多種腫瘤的增殖、凋亡均有關(guān)系。陳洪等[28-31]以裸鼠為實驗動物，研究顯示，蚓激酶從轉(zhuǎn)錄翻譯水平下調(diào)與癌轉(zhuǎn)移相關(guān)因子CD44v6（v區(qū)變異性剪接外顯子，在轉(zhuǎn)移性癌細(xì)胞中高表達(dá)）、β1-整合素、黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK，屬于整合素作用通路中的信號分子，與整合素共同介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞侵襲，轉(zhuǎn)移）以及基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）家族的表達(dá)，從而抑制人肝癌SMMC-7721在裸鼠中的原位腫瘤、肝內(nèi)播散、腹腔轉(zhuǎn)移、肺內(nèi)轉(zhuǎn)移和皮下移植瘤；通過將細(xì)胞阻滯

在G0～G1期，使細(xì)胞進(jìn)入S期減少，以及促進(jìn)胃癌MGC803細(xì)胞凋亡，并增加胃癌細(xì)胞對放射線的敏感性，以發(fā)揮抑癌作用。余玲俐等[32]通過離體環(huán)境下研究人肺癌MGC803細(xì)胞顯示，蚓激酶通過上調(diào)p53基因表達(dá)，通過p53蛋白阻滯細(xì)胞周期于S期，從而發(fā)揮抑制肺癌MGC803增殖作用。李洪燕等[33]通過離體和裸鼠體內(nèi)研究人胃癌和乳腺癌細(xì)胞顯示，蚓激酶通過增強免疫功能在體內(nèi)抑制移植性胃癌BGC823、乳腺癌B37細(xì)胞的生長。季紅等[34]通過體外離體實驗和小鼠的體內(nèi)試驗研究顯示，蚓激酶通過轉(zhuǎn)錄翻譯水平下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，抑制肝癌細(xì)胞生長、促進(jìn)凋亡，同時蚓激酶與另一種可促進(jìn)蚓激酶腸吸收的抑瘤成分殼聚糖有相加或協(xié)同作用，聯(lián)合抑癌作用優(yōu)于單藥的治療效果。

5 吸收途徑及副作用

蚓激酶藥物的傳統(tǒng)劑型是腸溶片、腸溶膠囊，而近年來有注射劑型問世，F(xiàn)an等[35]研究顯示，整分子蚓激酶EFE-Ⅲ-1可從腸腔經(jīng)由腸上皮細(xì)胞吸收入血，incubation chamber法測得有10%～15%的蚓激酶被完整吸收入血，大約60 min后即可測得血中蚓激酶。Yan等[36]對口服蚓激酶的大鼠做免疫熒光試驗顯示，33.6 kDa和54.7 kDa的蚓激酶在腸上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運最多，并且蚓激酶可以從黏膜腔被完整吸收入血。通過口服蚓激酶后的藥代動力學(xué)測定及免疫熒光方法顯示，口服后胃和十二指腸是主要吸收部位，結(jié)腸有很強的轉(zhuǎn)運能力[37]，而結(jié)腸部位蛋白水解酶活性較低，藥物滯留時間長，因而是蚓激酶等多肽蛋白質(zhì)類藥物較理想的給藥部位之一。蚓激酶除了跨細(xì)胞膜的吸收方式之外，李玉華等[38]通過大鼠的體內(nèi)實驗研究證實，蚓激酶及其吸收促進(jìn)劑殼聚糖均可通過降解細(xì)胞旁路中的一些蛋白質(zhì)，調(diào)節(jié)細(xì)胞旁路通透性，進(jìn)一步促進(jìn)蚓激酶的吸收。Cheng等[39]蛋白多肽類藥物本身具有相對分子質(zhì)量大、水溶性高、穩(wěn)定性差等特點，再加上蚓激酶因油/水分配率、膜滲透性較低且在胃液中不穩(wěn)定，因而口服生物利用度比較低，利用油包水型微乳液處理蚓激酶后可促進(jìn)蚓激酶的吸收，而且不會導(dǎo)致腸道損傷。張云湖等[40]用125I標(biāo)記的纖溶酶制成膠囊給家兔口服，確定了纖溶酶消化道吸收的藥時曲線，在血液中的消除半衰期為137 min，消除速率常數(shù)為0.005 L/min，峰濃度時間約為170 min，生物利用度為39%。蚓激酶口服吸收后在胃液中破壞較多，即使制成腸溶制劑，生物利用度也比較低。而與口服相比，靜脈注射在生物體內(nèi)的利用率相對較高，特別是Efp-0-2、Efp-Ⅰ-1、Efp-Ⅱ-1的蚓激酶純品較粗提物有更長的半衰期，但是蚓激酶純品仍未能批量生產(chǎn)[41]。通過健康志愿者進(jìn)行的Ⅰ期臨床試驗顯示，蚓激酶注射液在4萬～6萬U時作用最佳且維持時間較長，克服了口服蚓激酶制劑用量大、吸收緩慢、起效慢的弊端，適用于急癥的治療。因此，北京儒展生化藥物研究中心開發(fā)出無菌粉針劑型“注射用蚓激酶”，該藥選擇性作用于α、β型纖維蛋白原而不作用于γ型纖維蛋白原，既保留了抗凝作用，又避免了纖維蛋白原過低癥和出血，其安全性和有效性比較理想。

相比尿激酶等傳統(tǒng)抗血栓藥物，蚓激酶不僅藥物效果好成本低廉，而且副作用也小。賀石林等[42]小鼠為模型，一次性向腹腔內(nèi)注入蚓激酶提取物，并將注入蚓激酶提取物后48 h作為判定死亡與否的最終時間。結(jié)果顯示，蚓激酶提取物對小鼠的半數(shù)致死量為40.7 g/kg，其最大安全量（LD50）和藥物有效量（EPT）之比為7.5。丁曉麗等[43]在合理的最大給藥濃度及給藥容量的前提下，最大受試藥物劑量為51.00 g/kg，相當(dāng)于人臨床擬用量（0.06 g/kg）的850倍，蚓激酶對小鼠的體重沒有顯著性影響，給藥組小鼠也沒有出現(xiàn)明顯的毒副反應(yīng)，說明日服灌胃給藥的最大受試藥物劑量在51.00 g/kg范圍內(nèi)，蚓激酶不會引起小鼠急性毒性反應(yīng)，毒副作用相當(dāng)?shù)?。另外，現(xiàn)有研究表明，蚓激酶藥物沒有致癌、致畸、致突變的“三致”作用。陶大昌等[44]通過倉鼠肺細(xì)胞（CHL）的離體試驗研究顯示，蚓激酶不能誘發(fā)CHL細(xì)胞染色體畸變。另外，已有大量臨床試驗表明，在治療血栓性疾病過程中蚓激酶藥物表新出很高的安全性。

蚓激酶安全性較高，但因為蚓激酶的制作工藝尚不成熟，因此，在提取過程中，蚯蚓體內(nèi)物質(zhì)有可能進(jìn)入藥物中對人體造成損害。王洪武等[45]通過家兔的體內(nèi)實驗發(fā)現(xiàn)，家兔體內(nèi)注射蚓激酶的粗提物即見呼吸加快、血管收縮，3 h左右即死亡。蚓激酶粗提物中可能有呼吸抑制物，在麻醉狀態(tài)下呼吸抑制更為明顯。Lange等[46]研究顯示，炮制蚯蚓過程中，蚯蚓應(yīng)激分泌液含有透明質(zhì)酸酶和毒性蛋白，有劇毒性，小鼠身上致死量為0.242 mg/kg。

6 結(jié)語

心腦血管疾病是危害人類健康和生命的主要疾病，血栓的形成則是致病的主要原因之一。蚓激酶具有良好的纖溶、抗凝、調(diào)節(jié)血脂血流等藥理作

用，并得到了較理想的結(jié)果。蚓激酶與其他抗凝藥物比較，具有不良反應(yīng)小、安全性高、療效較顯著、生產(chǎn)成本低等優(yōu)勢。而蚓激酶的抗腫瘤等藥理作用則有待進(jìn)一步開發(fā)。相信不久的將來，蚓激酶的作用會進(jìn)一步被人們所認(rèn)識并得到廣泛應(yīng)用。

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《中國實用鄉(xiāng)村醫(yī)生雜志》特色簡介

◆媒體優(yōu)勢

?刊物內(nèi)容精優(yōu)

本刊創(chuàng)刊于1994年，由中華人民共和國衛(wèi)生部主管，中國醫(yī)師協(xié)會和中國醫(yī)科大學(xué)主辦。所有的稿件由專家審定把關(guān)，嚴(yán)格的質(zhì)量控制流程保證了本刊的科學(xué)性和專業(yè)性。欄目設(shè)置貼近讀者，以全方位、立體化的服務(wù)為讀者提供工作、生活資訊，被廣大讀者譽為“案頭知己，遠(yuǎn)道良師”。

?讀者影響力強

本刊讀者群為工作在鄉(xiāng)鎮(zhèn)衛(wèi)生院、村衛(wèi)生室的廣大農(nóng)村衛(wèi)生技術(shù)人員和鄉(xiāng)村醫(yī)生，以及部分廠礦、縣、社區(qū)醫(yī)院的衛(wèi)生工作者。其基層接近“擬家庭化”的醫(yī)療服務(wù)能夠為廣大民眾提供最貼心、最溫情的醫(yī)療建議，強大的影響力不可估量。

?發(fā)行覆蓋面廣

本刊是全國最大的面向農(nóng)村的專業(yè)醫(yī)療媒體，發(fā)行遍布全國31個省，數(shù)十萬計的專業(yè)讀者是廣告訴求源。

?處方藥刊發(fā)媒體

本刊是國家藥品監(jiān)督管理局首批批準(zhǔn)刊發(fā)處方藥的專業(yè)媒體。

?面向農(nóng)村市場

農(nóng)村市場是國家醫(yī)療改革關(guān)注的重點，也是藥品企業(yè)必爭的待墾之地，本刊是開拓農(nóng)村市場的最佳媒體平臺。

◆誠邀合作

我雜志誠招全國各地優(yōu)質(zhì)藥品、衛(wèi)材、醫(yī)療設(shè)備、學(xué)術(shù)會議、技術(shù)培訓(xùn)推廣業(yè)務(wù)，尋求各地雜志銷售代理及廣告中介客戶。歡迎來電咨詢：13889265325 張編輯

1672-7185（2014）02-0025-05

10.3969/j.issn.1672-7185.2014.02.012

孫晉民

2013-11-08）

遼寧省教育廳高?？蒲谢鹳Y助項目，資助編號：2010686

專利項目：國家知識產(chǎn)權(quán)局發(fā)明專利，專利證書第263115號

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