HPLC法同時測定補(bǔ)中益氣丸中3種活性成分的含量

薛薇，毛菊華，王志芳

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院藥學(xué)部，南寧 530011；2.麗水市食品藥品檢驗(yàn)所，浙江麗水 323000；3.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣州 510663）

HPLC法同時測定補(bǔ)中益氣丸中3種活性成分的含量

薛薇1＊，毛菊華2，王志芳3

（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院藥學(xué)部，南寧 530011；2.麗水市食品藥品檢驗(yàn)所，浙江麗水 323000；3.廣州市香雪制藥股份有限公司，廣州 510663）

目的：建立同時測定補(bǔ)中益氣丸中橙皮苷、毛蕊異黃酮苷、甘草酸含量的方法。方法：采用高相液相色譜法。色譜柱為Kromasil C18，流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液（梯度洗脫），流速為1.0ml/min，柱溫為30℃，檢測波長為260nm，進(jìn)樣量為10μl。結(jié)果：橙皮苷、毛蕊異黃酮苷、甘草酸的檢測質(zhì)量濃度分別在0.0615～1.250、0.0255～0.510、0.0506～1.012mg/ml范圍內(nèi)與各自峰面積積分值呈良好的線性關(guān)系（r＝0.9997、0.9998、0.9999）；精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)的RSD≤0.98%；平均加樣回收率分別為99.19%、99.42%、101.13%，RSD分別為2.05%、2.43%、2.16%（n＝9）。結(jié)論：該方法準(zhǔn)確、可靠、簡便易行，可用于補(bǔ)中益氣丸的質(zhì)量控制。

高效液相色譜法；補(bǔ)中益氣丸；橙皮苷；毛蕊異黃酮苷；甘草酸

補(bǔ)中益氣丸為常用補(bǔ)中益氣藥，原方為金元時期著名醫(yī)家李東垣在其《脾胃論》中論述的“補(bǔ)中益氣湯”方，方中黃芪為君藥，黨參、白術(shù)、甘草（炙）為臣藥，當(dāng)歸、陳皮為佐藥；升麻、柴胡為使藥?，F(xiàn)代研究表明，補(bǔ)中益氣湯具有抗?jié)?、調(diào)節(jié)免疫、抗胃黏膜損傷及調(diào)節(jié)激素等功效[1-4]。2010年版《中國藥典》[5]中關(guān)于補(bǔ)中益氣丸的質(zhì)量控制僅為測定黃芪甲苷，但補(bǔ)中益氣丸中有效成分較多，有文獻(xiàn)報道，補(bǔ)中益氣丸方中橙皮苷、毛蕊異黃酮苷和甘草酸均為有效成分[6-7]。因此，僅以檢測黃芪甲苷作為衡量其質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)，具有一定的片面性，從而導(dǎo)致不同廠家生產(chǎn)的補(bǔ)中益氣丸質(zhì)量不一。目前，國內(nèi)文獻(xiàn)報道僅分別對補(bǔ)中益氣丸中黃芪甲苷、橙皮甘、甘草酸的含量進(jìn)行測定[8-9]，并未對多個指標(biāo)建立同時測定的方法。鑒于中藥復(fù)方制劑化學(xué)成分的復(fù)雜性，為保證藥品質(zhì)量，筆者嘗試采用高效液相色譜（HLPC）法同時測定補(bǔ)中益氣丸中3種主要活性成分的含量。

1 材料

Summit P680HPLC儀，包括Summit P680A低壓四元泵、DIONEX-UVD170U紫外檢測器、ASI-100自動進(jìn)樣器、Chromelon色譜工作站（美國戴安公司）；KQ-500型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州普天儀器制造有限公司）；XS225A型分析天平（德國Sartorius公司）。

橙皮苷對照品（成都植標(biāo)化純生物技術(shù)有限公司，批號：120316）；毛蕊異黃酮苷、甘草酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：130111、121124）；補(bǔ)中益氣丸（A公司，批號：201211027、201304034；B公司，批號：12082027；C公司，批號：121108；D公司，批號：N00014；E公司，批號：11D229；F公司，批號：130412）；甲醇（色譜純，德國默克公司）；水（純凈水，華潤怡寶食品飲料有限公司）；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Kromasil C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：流動相A為甲醇，流動相B為0.1%磷酸溶液，采用梯度洗脫（洗脫程序見表1）；流速：1.0ml/min；柱溫：25℃；檢測波長：260nm；進(jìn)樣量：10μl。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab1 Gradient elution of mobile phase

2.2 溶液的制備

2.2.1 供試品溶液的制備 稱取補(bǔ)中益氣丸，切碎，取約1g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25ml，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理60min（功率：500W，頻率：40kHz），放冷，稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，用0.45μm孔徑微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取橙皮苷對照品、毛蕊異黃酮苷對照品、甘草酸對照品適量，置于同一10ml棕色量瓶中，加入甲醇溶解并稀至刻度，搖勻，即得3種成分質(zhì)量濃度分別為0.510、1.250、1.012mg/ml的對照品溶液。

2.2.3 空白溶液的制備 按補(bǔ)中益氣丸處方比例制成不含黃芪、陳皮、甘草（炙）的空白對照品，按“2.2.1”項下供試品溶液的制備方法制備空白溶液。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

精密吸取“2.2”項下供試品溶液、對照品溶液、空白溶液各10μl，注入HPLC儀，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜，詳見圖1。在該色譜條件下，3種成分可達(dá)到基線分離。理論板數(shù)按橙皮苷峰計算應(yīng)不低于5000。

圖1 高效液相色譜圖A.空白；B.對照品；C.供試品1.毛蕊異黃酮苷；2.橙皮苷；3.甘草酸Fig1 HPLC chromatogramsA.blank；B.substance control；C.test samples；1.calycosin glycoside；2.hesperidin；3.glycyrrhizic

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密吸取“2.2.2”項下對照品溶液1、0.75、0.5、0.2、0.1、0.05ml，置于1ml量瓶中，分別以甲醇定容至刻度，搖勻，得到不同質(zhì)量濃度的系列溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。以檢測質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，峰面積（y）為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，回歸方程及線性范圍見表2。

表2 回歸方程及線性范圍Tab2 Results of regression equation and linear range of 3components

2.5 精密度試驗(yàn)

取“2.2.2”項下對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次。結(jié)果，橙皮苷、毛蕊異黃酮苷、甘草酸的RSD分別為0.24%、0.98%、0.79%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取“2.2.1”項下供試品溶液（批號：201211027）適量，分別于放置0、4、8、12、16、20、24h時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，橙皮苷、毛蕊異黃酮苷、甘草酸的RSD分別為0.91%、0.26%、0.67%，表明供試品溶液在24h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品（批號：201211027）內(nèi)容物適量，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，共6份，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，橙皮苷、毛蕊異黃酮苷、甘草酸的RSD分別為0.49%、0.67%、0.98%，表明本方法的重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量的樣品（批號：201211027）內(nèi)容物約0.2g，共9份，分別加入一定量的橙皮苷、毛蕊異黃酮苷、甘草酸對照品溶液，按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定并計算加樣回收率，結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）Tab3 Results of recovery test（n＝9）

2.9 樣品含量測定

取7批補(bǔ)中益氣丸樣品各適量，分別按“2.2.1”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算3種成分含量，結(jié)果見表4。

3 討論

3.1 流動相的選擇

筆者曾嘗試了分別采用甲醇-水與乙腈-水按不同的比例作為流動相進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3種待測成分的分離度均不理想，目標(biāo)峰拖尾較嚴(yán)重；又嘗試改為甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液作為流動相進(jìn)行測定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇-0.1%磷酸溶液作為流動相進(jìn)行梯度洗脫時，3種待測成分分離度均較好且峰形最佳。因此，選擇甲醇-0.1%磷酸溶液作為流動相。

表4 樣品含量測定結(jié)果（mg/g，n＝3）Tab4 Results of content determination of samples（mg/g，n＝3）

3.2 檢測波長的選擇

取對照品溶液在210～400nm波長范圍內(nèi)進(jìn)行檢測，結(jié)果可見，橙皮苷在280nm波長附近處有最大吸收，毛蕊異黃酮苷在260nm波長處有最大吸收，甘草酸在240nm波長處有最大吸收。當(dāng)在260nm波長時，3種待測成分分離度均良好，可滿足定量測定要求，故選擇260nm為檢測波長。

3.3 柱溫的選擇

取供試品溶液在選定的流動相及波長條件下觀察了20、25、30、35℃等不同柱溫對各成分分離效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)柱溫為30℃時，3種待測成分分離度均較好且峰形最佳。

綜上所述，本方法準(zhǔn)確、可靠、簡便易行，可用于補(bǔ)中益氣丸的質(zhì)量控制。

[1] 劉曉玲，王汝俊，付銓盛.補(bǔ)中益氣湯對脾虛大鼠胃黏膜MEK/ERK mRNA表達(dá)的影響[J].中藥藥理與臨床，2013，29（1）：5.

[2] 高璟春，張金超，陳瑤，等.補(bǔ)中益氣湯的LC-MS分析及其對免疫抑制小鼠的調(diào)節(jié)作用[J].中草藥，2006，37（8）：1134.

[3] 許琦，王建華，王汝俊，等.補(bǔ)中益氣湯對脾虛大鼠胃泌素受體結(jié)合作用的影響及其對胃黏膜損傷的保護(hù)機(jī)制[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2003，20（1）：51.

[4] 曾昭明，陳芝喜，趙慧，等.補(bǔ)中益氣丸對脾虛大鼠甲狀腺激素水平的影響[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2007，24（4）：320.

[5] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：780-781.

[6] 李洪剛，熊勝元，楊修齊，等.高效液相色譜法測定補(bǔ)中益氣丸中甘草酸含量[J].中國藥業(yè)，2005，14（7）：43.

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[8] 徐端瓊.高效液相色譜法測定補(bǔ)中益氣丸中橙皮苷的含量[J].海峽藥學(xué)，2007，19（3）：48.

[9] 柯雪紅，花汝風(fēng)，陳錦富，等.補(bǔ)中益氣湯中甘草酸含量測定及配伍對其影響[J].中成藥，2009，31（2）：245.

Simultaneous Determination of 3Active Constituents in Buzhong Yiqi Pills by HPLC

XUE Wei1，MAO Ju-hua2，WANG Zhi-fang3
（1.Dept.of Pharmacy，Ruikang Hospital of Guangxi University of TCM，Nanning 530011，China；2.Lishui Institute for Food and Drug Control，Zhejiang Lishui 323000，China；3.Guangzhou Xiangxue Pharmaceutical Co.，Ltd.，Guangzhou 510663，China）

OBJECTIVE：To establish a method for simultaneous determination of hesperidin，calycosin glycoside and glycyrrhizic acid in Buzhong yiqi pills.METHODS：HPLC method was adopted.The determination was performed on Kromasil C18column with mobile phase consisted of methanol-0.1%phosphoric acid（gradient elution）at the flow rate of 1.0mL/min.The column temperature was 30℃，and the detection wavelength was set at 260nm.The sample size was 10μl.RESULTS：The linear ranges were 0.0615-1.250mg/ml for hesperidin（r＝0.9997），0.0255-0.510mg/ml for calycosin glycoside（r＝0.9998）and 0.0506-1.011mg/ml for glycyrrhizic acid（r＝0.9999）；RSDs of precision，stability and reproducibility tests were lower than 0.98%.Average recoveries were 99.19%（RSD＝2.05%，n＝9），99.42%（RSD＝2.43%，n＝9）and 101.13%（RSD＝2.16%，n＝9）.CONCLUSIONS：The method is accurate，reliable，simple and feasible，and can be used for the quality control of Buzhong yiqi pills.

HPLC；Buzhong yiqi pills；Hesperidin；Calycosin glycoside；Glycyrrhizic

R917

A

1001-0408（2014）16-1524-03

DOI10.6039/j.issn.1001-0408.2014.16.30

＊碩士。研究方向：醫(yī)院藥學(xué)。電話：0771-2188297。E-mail：xw5346@foxmail.com

2013-12-06

2014-01-05）

·藥學(xué)教育·