鐵皮石斛原球莖分化的研究概述

張壽文，蘇慧慧

(江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌330004)

*

張壽文，教授，研究方向：中藥資源與開(kāi)發(fā);Tel：(0791)87118994，E-mail：hero220@163.com

鐵皮石斛原球莖分化的研究概述

張壽文*，蘇慧慧

(江西中醫(yī)藥大學(xué)，江西 南昌330004)

綜述國(guó)內(nèi)對(duì)鐵皮石斛原球莖分化組織培養(yǎng)進(jìn)行的深入研究，系統(tǒng)查閱國(guó)內(nèi)近5年的文獻(xiàn)20余篇。從培養(yǎng)基，激素，附加物等多個(gè)條件進(jìn)行了概述，并提出了存在的問(wèn)題及相應(yīng)對(duì)策。

鐵皮石斛；原球莖；分化

鐵皮石斛Dendrobiumofficnale為多年生草本，屬附生蘭類(lèi)，因其老莖外呈黑色，又名為黑節(jié)草，是常用的名貴中藥[1]，所含的主要成分為石斛多糖，具有提高人體白細(xì)胞，增加機(jī)體免疫力等功能[2]。但由于生長(zhǎng)環(huán)境特殊，以及長(zhǎng)期采挖，自然資源日趨枯竭，已被國(guó)家列為重點(diǎn)保護(hù)的野生藥材。同時(shí)，鐵皮石斛種子極小，無(wú)胚乳，自然條件下需要某些真菌共生才能萌發(fā)，繁殖比較慢，且植株生長(zhǎng)不一致，抗病蟲(chóng)害能力差[1]。因此通過(guò)組織培養(yǎng)技術(shù),使它在人工干涉的條件下大量繁殖，以保護(hù)種質(zhì)資源，緩解供求的緊張局面，是保護(hù)和利用鐵皮石斛資源的重要途徑。自1960年法國(guó)人Gmorel利用石斛基尖組織培養(yǎng)無(wú)病毒植株的無(wú)性繁殖技術(shù)創(chuàng)立以來(lái),石斛組織培養(yǎng)逐步走向深入化[3]。組織培養(yǎng)獲得鐵皮石斛再生植株的途徑有多種。用成熟的種子消毒后進(jìn)行無(wú)菌播種形成原球莖，并經(jīng)過(guò)增殖分化發(fā)育成完整植株只是其中一種。也可通過(guò)選擇適宜的外植體(莖段、莖尖、幼芽、葉片等)誘導(dǎo)形成擬原球莖或叢生芽來(lái)實(shí)現(xiàn)快繁以解決鐵皮石斛資源緊缺問(wèn)題[4]。其中原球莖的分化是鐵皮石斛組織培養(yǎng)的一個(gè)很重要的環(huán)節(jié)，筆者對(duì)近些年來(lái)有關(guān)鐵皮石斛原球莖分化作一簡(jiǎn)單的概述。

1 原球莖分化

影響原球莖分化的主要有原球莖的大小、生理狀態(tài)、培養(yǎng)基的類(lèi)型、激素種類(lèi)和比例、天然添加物以及其他一些因素。

1.1 原球莖的大小

原球莖的大小常以其長(zhǎng)度表示，隨著原球莖的長(zhǎng)大，其頂部分化能力增強(qiáng)，形成芽較多，原球莖上增殖的新原球莖數(shù)增加。短小的原球莖分化能力差，其分化形成的芽在隨后的培養(yǎng)中常?？菟阑蛟傩纬尚略蚯o[5]。因此誘導(dǎo)原球莖分化時(shí)，應(yīng)選用增殖旺盛，生長(zhǎng)粗壯，長(zhǎng)度達(dá)到1 cm以上的原球莖。

1.2 生理狀態(tài)

不同的生理狀態(tài)對(duì)石斛原球莖分化有很大的影響，張艷等[6]發(fā)現(xiàn)顏色翠綠形態(tài)飽滿(mǎn)、組織致密的原球莖有利于分化，趨向衰老的原球莖,其表面分生中心褐化脫落,頂部亦無(wú)芽形成。

1.3 培養(yǎng)基

培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)中最重要的基質(zhì)，選擇合適的培養(yǎng)基是組織培養(yǎng)的首要環(huán)節(jié)。常用的培養(yǎng)基有MS培養(yǎng)基，B5培養(yǎng)基，N6培養(yǎng)基，ER培養(yǎng)基等。邵世光等[7]在2009年以鐵皮石斛擬原球莖為外植體，在基本培養(yǎng)基N6中對(duì)6-BA(6-芐基腺嘌呤)、IBA(吲哚丁酸)及pH值三因素采用L9(34)正交試驗(yàn)表進(jìn)行正交試驗(yàn)，研究其對(duì)原球莖分化的影響。50 d后統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)結(jié)果，在基本培養(yǎng)基N6中，當(dāng)6-BA的濃度為2 mg·L-1、IBA濃度為0.2 mg·L-1、pH值為5.8時(shí),原球莖最易于分化成叢生小苗。楊立昌等[8]發(fā)現(xiàn)鐵皮石斛愈傷組織在1/2 MS培養(yǎng)基上的出芽率比MS培養(yǎng)基好，說(shuō)明低鹽培養(yǎng)基有利于不定芽的分化。而李榮珍[9]的研究表明不同培養(yǎng)基對(duì)鐵皮石斛原球莖的分化有明顯差異，其順序依次為改良MS>N6>MS>1/2N6>1/2改良MS>1/2MS，以改良MS培養(yǎng)基最好。李瑩等[10]對(duì)比了MS，1/2 MS，B5，N6培養(yǎng)基對(duì)腋芽的誘導(dǎo)效果，以MS培養(yǎng)基長(zhǎng)勢(shì)較好。

1.4 激素種類(lèi)和比例

一般高濃度的細(xì)胞分裂素有利于誘導(dǎo)芽的發(fā)生，而高濃度的2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)形成有促進(jìn)作用。趙興兵等[11]考察了不同濃度的6-BA，NAA(萘乙酸)和香蕉汁對(duì)原球莖分化的影響，三者配比使用，明顯促進(jìn)原球莖分化，優(yōu)選出最適于原球莖分化的激素濃度配比為6-BA 1.5 mg·L-1+NAA l.2 mg·L-1+5%香蕉汁的MS培養(yǎng)基。李丹等[12]認(rèn)為，當(dāng)培養(yǎng)基中不含激素時(shí)，原球莖的出芽率為0，添加一定濃度的KT(N6-呋喃甲基腺嘌呤)和NAA后，出芽率增大，隨著NAA濃度增加，出芽率也顯著增大。楊柳平等[13]通過(guò)試驗(yàn)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，只有NAA、6-BA和KT配合使用才能有效的促進(jìn)鐵皮石斛原球莖的分化，且分化效果較好，而過(guò)高或過(guò)低濃度的激素配比均不利于鐵皮石斛原球莖的分化。邵世光等[7]運(yùn)用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)研究原球莖的分化，30 d左右，每個(gè)原球莖的莖頂均長(zhǎng)出2～3片幼葉。極差分析表明，IBA濃度為0.12 mg·L-1，6-BA的濃度為2 mg·L-1、pH值為5.18時(shí)最易使原球莖分化成叢生小苗。

1.5 有機(jī)添加物

有機(jī)添加物由于含有許多復(fù)雜、有效的成分而廣泛應(yīng)用于蘭科植物的組織培養(yǎng)[14]。椰子、香蕉、馬鈴薯等是作為較常見(jiàn)的附加物添加到培養(yǎng)基中的，基本原理是：其中可能含有某種人類(lèi)尚未知道的物質(zhì)，且這些物質(zhì)對(duì)植物在生根壯苗中起一定的作用。蔣波等[15]認(rèn)為：香蕉提取液在鐵皮石斛的苗的形態(tài)建成中是作用效果較好的一種附加物，對(duì)鐵皮石斛的生根壯苗的效果明顯優(yōu)于其它的附加物。楊柳平等[13]研究發(fā)現(xiàn)，在適宜的激素配比培養(yǎng)基中添加土豆汁的原球莖分化率均高于不添加任何激素或其他添加物(CK)培養(yǎng)基，而添加香蕉汁的培養(yǎng)基其分化率均低于不加任何添加物(CK)的培養(yǎng)基，可見(jiàn)土豆汁能有效促進(jìn)鐵皮石斛原球莖的分化，但香蕉汁對(duì)原球莖的分化明顯有抑制作用。謝啟鑫等[16]將增殖后的原球莖團(tuán)，接種于1/2 MS+6-BA 2 mg·L-1+NAA 0.25 mg·L-1+20%馬鈴薯提取液的培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢芽，約15 d開(kāi)始分化出叢生芽，40 d時(shí)芽高可達(dá)1～2 cm。魏梅娟等[17]以椰汁作為附加物發(fā)現(xiàn)在6-BA 4 mg·L-1，NAA 0.1 mg·L-1時(shí)有利于鐵皮石斛組培苗的繼代培養(yǎng)。

1.6 其它影響因素

除了外植體、培養(yǎng)基、激素、天然附加物影響外,光照、溫度以及pH等也會(huì)影響原球莖的分化。鐵皮石斛組培常用的溫度為(25±1)℃，光強(qiáng)1 600～2 000 lx，日照光12 h，pH為5.0～5.5。在培養(yǎng)的過(guò)程中很容易出現(xiàn)褐化現(xiàn)象，最常見(jiàn)的做法就是及時(shí)更換培養(yǎng)基；在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑等。

2 問(wèn)題與展望

目前在鐵皮石斛原球莖分化的研究中，絕大多數(shù)采用固態(tài)靜止培養(yǎng)法，而對(duì)液體靜止培養(yǎng)和液體轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)的研究甚少。液體培養(yǎng)易于植物體通過(guò)水勢(shì)原理來(lái)吸收營(yíng)養(yǎng)成分，比較直接，而且液體中營(yíng)養(yǎng)成分分布均勻，使整個(gè)原球莖都能充分地吸收養(yǎng)分；在固體培養(yǎng)基內(nèi)培養(yǎng)，其營(yíng)養(yǎng)成分在培養(yǎng)基上下分布不十分均勻，且原球莖只有固著部分具有吸收能力，因此大大減少了原球莖吸收養(yǎng)分的面積，吸收的速度比較有限[18]。因此液體培養(yǎng)法也將是廣大學(xué)者今后探索的一個(gè)重要方向。

近年來(lái)對(duì)石斛的研究大多集中在石斛的種子萌發(fā)，試管苗生長(zhǎng)條件(如何選用外植體、培養(yǎng)基、激素、溫度、光強(qiáng)、pH值、外源添加物)等方面，而對(duì)石斛的煉苗、室外移栽以及石斛如何走向產(chǎn)業(yè)化研究較少。另外，石斛在自然傳粉的條件下結(jié)果率只有17.3%，人工授粉盡管可以使石斛的結(jié)果率提高到72.1%～100%[19]，但實(shí)際操作過(guò)程中既費(fèi)時(shí)又費(fèi)力。人工種子是一個(gè)不錯(cuò)的選擇，目前主要以萌發(fā)原球莖為繁殖體，用海藻酸鈉包裹，在鐵皮石斛外層制作包衣，自然條件下可獲得較高的萌發(fā)率和成活率[20]。但人工種子能夠大規(guī)模生產(chǎn)、貯藏和迅速推廣良種的優(yōu)越性，使得人工種子的研究和應(yīng)用仍然具有十分誘人的前景。

在野生植物資源遭到嚴(yán)重破壞的今天，為了達(dá)到石斛資源的可持續(xù)利用和發(fā)展，需要多方面共同努力，不僅要重視石斛的組織培養(yǎng)，也要注重天然產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)與利用，探索其活性成分的作用機(jī)制和構(gòu)效關(guān)系，為進(jìn)一步的化學(xué)合成提供參考。

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StudiesonProtocormDifferentiationofDendrobiumofficnale

ZHANGShouwen*,SUHuihui

(JiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330004,China)

Summary the protocorm differentiation ofDendrobiumofficnaletissue culture in China,and comprehensive inquiry the past five years domestic literature,more than 20 articles.The culture medium,hormones,additives,and other conditions are outlined,and put forward the existing problems and the corresponding countermeasures.

Dendrobiumofficinale;Protocorm;Differentiation

10.13313/j.issn.1673-4890.2014.04.003

2013-06-27)