高通量測序技術(shù)在動(dòng)物MicroRNA研究中的應(yīng)用

柏亞鐸 尹 羿 汪 琳 李勐偉,2 蒲 靜

（1.北京出入境檢驗(yàn)檢疫局 北京 100026；2.西南大學(xué)）

1 前言

MicroRNA（miRNA）是一類新發(fā)現(xiàn)的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA分子，廣泛存在于動(dòng)物、植物細(xì)胞中，長度為18-25nt。雖然這類RNA不能直接編碼蛋白質(zhì)，但在基因的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中發(fā)揮著重要功能。線蟲中與靶基因mRNA3′UTR互補(bǔ)的miRNA分子是最早觀察到的miRNA，包括lin-4[1]和let-7[2]，它們控制著線蟲的時(shí)序性發(fā)育[3-4]。miRNA通過與靶基因mRNA特異性互補(bǔ)配對，導(dǎo)致靶mRNA的降解，或者抑制靶基因的表達(dá)，產(chǎn)生基因沉默[5-6]。目前，在不同物種中共發(fā)現(xiàn)24521種miRNA，這些miRNA 在動(dòng)物體多個(gè)調(diào)節(jié)途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用，其功能涉及細(xì)胞增殖控制、細(xì)胞死亡、脂肪代謝、神經(jīng)元形成、造血細(xì)胞系分化的調(diào)節(jié)等各個(gè)方面。

隨著對miRNA的深入研究，分子生物學(xué)和生物信息學(xué)等一系列方法已被引入該領(lǐng)域[7-8]，如結(jié)合了克隆測序和生物信息學(xué)的高通量測序技術(shù)為基因組測序提供了很大的便利，已被用于多種動(dòng)物的miRNA測序。

2 miRNA的產(chǎn)生

研究發(fā)現(xiàn)，miRNA是存在于動(dòng)植物細(xì)胞內(nèi)一類非編碼蛋白質(zhì)的短序列RNA[9]，是一類重要的負(fù)調(diào)控因子，具有很高的保守性[10]。多數(shù)動(dòng)物的miRNA位于前體mRNA的內(nèi)含子中，由獨(dú)立轉(zhuǎn)錄單位表達(dá)。miRNA基因常以單拷貝、多拷貝或基因簇等多種形式存在于基因組的基因間隔區(qū)，且以基因簇形式存在的miRNA基因多以多順反子形式轉(zhuǎn)錄。miRNA在動(dòng)物體內(nèi)的形成過程包括轉(zhuǎn)錄、加工和與蛋白復(fù)合體結(jié)合。細(xì)胞核內(nèi)編碼miRNA的基因首先在RNA聚合酶Ⅱ的作用下形成具有帽子結(jié)構(gòu)（5MGpppG）和多聚腺苷酸尾巴（PolyA）的幾百個(gè)核苷酸初級(jí)轉(zhuǎn)錄物pri-miRNA[11]；pri-miRNA在Drosha[12]（一種第2類的RNase Ⅲ內(nèi)切酶）的作用下，形成大約60-70nt、具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的pre-miRNA[13]，它具有重要的二級(jí)結(jié)構(gòu)，能被連續(xù)地切割成一個(gè)或多個(gè)miRNA[14-15]；pre-miRNA 通過Ran-GTP及其受體Exportin-5轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)[16-18]，在Dicer 酶的作用下轉(zhuǎn)化為成熟的雙鏈miRNA[19-22]，互補(bǔ)雙鏈中只有一條miRNA，另一條為miRNA*（注：miRNA*是miRNA加工成熟過程中與其互補(bǔ)的大約22個(gè)核苷酸的RNA序列）；隨后miRNA 的雙鏈解鏈形成成熟miRNA[23]，它與一種類似RISC（the RNA-induced silencing complex）的核糖核蛋白結(jié)合形成miRNP而發(fā)揮相關(guān)基因沉默作用[24-25]。

3 miRNA的作用機(jī)理

研究表明：成熟miRNA通過引導(dǎo)miRISC與靶mRNA 3′UTR的堿基配對，從而降解靶mRNA或抑制靶mRNA翻譯。miRNA與靶基因mRNA的作用方式有2種，采取何種方式由mRNA的特性所決定，與miRNA和靶基因的配對程度有關(guān)。當(dāng)miRNA與目的基因不完全配對時(shí)，將抑制靶基因mRNA的翻譯，但并不影響mRNA的數(shù)量和穩(wěn)定性，大多數(shù)動(dòng)物為這種作用方式，如線蟲中的miRNAlin-4就是通過抑制lin-14和lin-28兩個(gè)靶基因的翻譯[26-27]；當(dāng)miRNA與目的基因某段序列配對完全時(shí)，該目的基因?qū)⒈籖ISC特異地降解。在動(dòng)物中，miRNA與靶基因mRNA的結(jié)合位點(diǎn)通常有多個(gè)，例如lin-14基因有7個(gè)結(jié)合位點(diǎn)[28]，并且總在3UTR[29]，這些結(jié)合位點(diǎn)的數(shù)量和互補(bǔ)性可能與翻譯減弱的程度有關(guān)。研究表明，位點(diǎn)被結(jié)合較少，靶基因mRNA的翻譯被抑制程度也較少；當(dāng)所有位點(diǎn)都被結(jié)合時(shí)，翻譯就被完全抑制[30]。說明結(jié)合位點(diǎn)的互補(bǔ)程度與翻譯程度具有一定的正比例關(guān)系，這也通過在3′UTR添加多個(gè)結(jié)合位點(diǎn)而得到證實(shí)[30]。此外，翻譯抑制具有可調(diào)節(jié)性和可逆性，從結(jié)合位點(diǎn)移去miRNA，mRNA又可翻譯；反之，在編碼區(qū)裂解可永久破壞mRNA，產(chǎn)生的徹底抑制只有mRNA重新轉(zhuǎn)錄才能逆轉(zhuǎn)。

4 高通量測序技術(shù)原理

目前，生物試驗(yàn)法和生物信息學(xué)法是研究miRNA的2種主要方法。生物實(shí)驗(yàn)法主要是直接克隆法，但是在克隆過程中，受到高表達(dá)miRNA以及降解片段等的干擾，許多物種特異的、低表達(dá)的miRNA很難被發(fā)現(xiàn)；生物信息學(xué)法則主要是通過計(jì)算機(jī)預(yù)測獲得miRNA[31-32]，雖然此方法解決了克隆測序?qū)Ρ磉_(dá)量的偏向性，但是對物種基因組信息依賴度高、結(jié)果還需實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。近幾年來，隨著生物技術(shù)的快速發(fā)展，miRNA測序技術(shù)也發(fā)生了革命性變化，最近開發(fā)的高通量測序技術(shù)[33-34]，大大提高了miRNA的研究。如NGS（Next Generation Sequencing）結(jié)合了克隆測序和生物信息學(xué)預(yù)測的優(yōu)點(diǎn)，不需要載體擴(kuò)增，直接通過聚合酶或者連接酶進(jìn)行體外合成測序，具有高通量、高準(zhǔn)確性，高靈敏度、低成本等優(yōu)點(diǎn)，因而也被稱為下一代測序技術(shù)，在miRNA研究過程中，能捕捉體內(nèi)一些低表達(dá)的miRNA，也能對未知小片段RNA進(jìn)行預(yù)測。NGS主要包括羅氏公司（Roche）的454 測序儀（Roch GS FLX Sequencer）、Illumina 公司的Solexa基因組分析儀（Illumina Genome Analyzer）和ABI的SOLiD測序儀（ABI SOLID Sequencer）。

2003年，454公司首先建立了基于焦磷酸測序法的高通量第二代測序技術(shù)，2005年，454公司被羅氏診斷公司收購。454測序法是以DNA擴(kuò)增的乳膠系統(tǒng)（emulsion system）和皮升( picoliltre )大小焦磷酸( pyrophosphate)為基礎(chǔ)的測序方法，其原理是：首先將基因組DNA或者BAC打斷成300-800bp的片段，對于小分子的非編碼RNA或者PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，這一步則不需要；然后將雙鏈解開，用特別設(shè)計(jì)的DNA捕獲磁珠將其中一條單鏈DNA文庫固定，每一個(gè)磁珠固定一個(gè)獨(dú)特的單鏈DNA片段；用乳液PCR進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后產(chǎn)生單分子多拷貝的分子簇，然后將乳液混合物打破，把磁珠放入PTP板中進(jìn)行后繼的測序反應(yīng)。利用焦磷酸測序原理可以準(zhǔn)確、快速地確定待測模板的堿基序列。

SOLiD（Supported Oligo Ligation Detetion）測序技術(shù)是ABI公司推出的以4色熒光標(biāo)記寡核苷酸的連續(xù)連接反應(yīng)為基礎(chǔ)的高通量測序技術(shù)，取代了利用DNA聚合酶在合成過程中讀取序列。其原理為：將切斷成短序列的DNA片段固定在一個(gè)獨(dú)立的微珠上，并進(jìn)行乳液PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增后的微珠沉積到一塊玻片上，加入8堿基單鏈熒光探針，探針的5＇端分別標(biāo)記了4種不同的熒光染料，3＇端第1、2位堿基對應(yīng)5端熒光信號(hào)的顏色，探針按照堿基互補(bǔ)規(guī)則與單鏈DNA模板鏈配對，因?yàn)?個(gè)堿基有16種不同的組合情況，所以4種堿基對應(yīng)一種顏色的熒光；連接測序反應(yīng)進(jìn)行5輪，每輪測序反應(yīng)含有多次連接反應(yīng)；最后反應(yīng)得到的是原始顏色序列。由于SOLiD系統(tǒng)采用了雙堿基編碼技術(shù)，在測序過程中對每個(gè)堿基判讀兩遍，從而減少原始數(shù)據(jù)錯(cuò)誤，提供內(nèi)在的校對功能。目前最新款SOLiD 5500xl 含有2張微流體芯片（microfluidic flow chip），每張芯片含有6條相互獨(dú)立的運(yùn)行通道（run lane），每條通道都能運(yùn)行相對獨(dú)立的測序反應(yīng)；這樣的設(shè)計(jì)使得SOLiD 5500xl測序平臺(tái)極具靈活性，最大測序讀長為75 nt，同樣支持Fragment、Pair-end和Mate-Paired文庫；單次運(yùn)行能得到的最大數(shù)據(jù)量為300 Gb（使用最新設(shè)計(jì)的nanobeads）；測序的系統(tǒng)準(zhǔn)確性能達(dá)99%。

Illumina公司的新一代測序法-Solexa測序法最早由Solexa公司研發(fā)，2007年Solexa 公司被Illumina公司收購，隨之Solexa測序儀也被命名為Illumina genome analyzer。該方法利用“DNA簇”和“可逆性末端終結(jié)（reversible terminator）技術(shù)，進(jìn)行邊合成邊測序。其基本原理為：將切割為短序列的基因片段固定到光學(xué)透明的玻璃表面（即Flow cell），通過擴(kuò)增形成單克隆DNA簇，然后加入改造過的DNA聚合酶和帶有4種熒光標(biāo)記的dNTP進(jìn)行合成；熒光標(biāo)記的dNTP是可逆終止子，3＇羥基末端帶有可化學(xué)切割的部分。因此每個(gè)循環(huán)只允許摻入單個(gè)堿基，通過檢測不同熒光標(biāo)記堿基的引入導(dǎo)致發(fā)出相應(yīng)波段的熒光，從而測出基因片段的序列。

5 高通量測序技術(shù)在動(dòng)物miRNA的應(yīng)用

在動(dòng)物研究領(lǐng)域中，高通量測序技術(shù)使miRNA的測序、表達(dá)、探查變得更加容易。近些年來，利用高通量測序法結(jié)合生物信息學(xué)分析手段可以預(yù)測新的miRNA，研究miRNA的保守性，建立miRNA表達(dá)譜，比較miRNA表達(dá)豐度以及發(fā)現(xiàn)其他非編碼RNA等。凌英會(huì)等[35]使用solexa測序技術(shù)成功獲取了山羊肌肉組織miRNA序列及其表達(dá)譜，共鑒定出517個(gè)物種間保守的miRNA和2個(gè)山羊基因組特有的miRNA，并通過miRNA靶基因預(yù)測和功能分析，表明很多miRNA可能影響動(dòng)物肌肉發(fā)育的細(xì)胞信號(hào)通路；這為進(jìn)一步研究特定miRNA參與山羊肌肉細(xì)胞的增殖與分化等生長發(fā)育機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。miRNA廣泛參與哺乳動(dòng)物的生殖調(diào)控，尤其在卵巢功能發(fā)揮中起重要作用[36-37]。張曉東等[38]通過Solexa測序成功構(gòu)建了山羊卵巢組織miRNA表達(dá)文庫，發(fā)現(xiàn)山羊卵巢組織表達(dá)的508個(gè)miRNA，預(yù)測出4個(gè)新的山羊miRNA，首次分析了山羊卵巢組織miRNA表達(dá)情況，為進(jìn)一步研究miRNA調(diào)控哺乳動(dòng)物生殖發(fā)育奠定了基礎(chǔ)。為了增加甲殼類動(dòng)物miRNA的數(shù)目，歐江濤等[39]研究宿主miRNA表達(dá)與病原體感染的關(guān)系，利用Illumina/Solexa高通量深度測序法對正常和感染顫抖病螺原體的中華絨螯蟹血細(xì)胞進(jìn)行miRNA測序和表達(dá)分析，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)735中特異性miRNA，其中228種miRNA在正常和感染情況下具有顯著的表達(dá)差異，133條（58%）miRNA在感染顫抖病螺原體的血細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，95條（42%）表達(dá)下調(diào)；這一研究結(jié)果表明許多miRNA在病原體侵染后會(huì)出現(xiàn)差異性表達(dá)。同樣，關(guān)于miRNA的差異性表達(dá)，孫等人[40]通過深度測序方法對SD大鼠在出生后第0天、21天、42天3個(gè)不同階段股骨頭軟骨miRNA庫測序和構(gòu)建，3個(gè)miRNA庫一共發(fā)現(xiàn)246個(gè)miRNA；采用solexa測序法分析大鼠股骨頭軟骨在不同發(fā)育階段表達(dá)的miRNA，其中23個(gè)miRNA基因上調(diào)，6個(gè)下調(diào)，顯示miRNA在關(guān)節(jié)軟骨發(fā)育不同階段具有差異表達(dá)。李成華等[41]通過Illumina公司的Hiseq2000測序平臺(tái)構(gòu)建l健康刺參和具有“腐皮綜合征”刺參血細(xì)胞兩個(gè)miRNA庫，用solexa測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)刺參40個(gè)保守miRNA；在這兩個(gè)miRNA庫中，發(fā)現(xiàn)miR-31和miR-2008具有顯著差異性表達(dá)，這可能為“腐皮綜合征”內(nèi)在機(jī)制的闡述作為依據(jù)，也進(jìn)一步說明miRNA在宿主-病原體相互作用過程中起著關(guān)鍵的介導(dǎo)作用。Rathjen Tina等[42]應(yīng)用高通量Solexa測序技術(shù)對雞胚胎的體節(jié)中miRNA進(jìn)行測序鑒定，發(fā)現(xiàn)85種已知miRNA、18種已知miRNA的新變型、8種新miRNA，其中1個(gè)新發(fā)現(xiàn)的miRNA大量存在于體節(jié)組織中，說明深度測序其他組織有可能發(fā)現(xiàn)其他的新miRNA。張麗等人[43]通過高通量測序技術(shù)構(gòu)建鴨廓羽和絨羽毛囊miRNA基因庫，比較表達(dá)差異性發(fā)現(xiàn)miRNA在皮膚功能和皮膚演化具有重要的功能，不同的羽囊可能存在不同的miRNA調(diào)控機(jī)制；禽羽毛囊和哺乳動(dòng)物的毛囊也可能存在不同的miRNA調(diào)控機(jī)制；來自于器官的保守miRNA能為動(dòng)物的進(jìn)化提供重要信息。張彥明等[44]用solexa高通量測序法對豬永生化血管內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)行測序，確定了154個(gè)豬的miRNA基因，其中有146個(gè)具有跨物種保守性，8個(gè)具有豬特異性；146個(gè)miRNA基因編碼116個(gè)保守成熟的miRNA和66個(gè)miRNA，8個(gè)豬特異性miRNA基因編碼4個(gè)成熟的miRNA，并發(fā)現(xiàn)miR-206、miR-21和miR-378具有相對高表達(dá)性，這些被研究的、具有生物活性的miRNA可能與血管疾病、炎癥和血腦屏障有關(guān)。

6 結(jié)語

miRNA在動(dòng)物生長發(fā)育、細(xì)胞分化和凋亡過程中發(fā)揮著重要的作用，目前已經(jīng)對其合成與功能進(jìn)行了初步探究，但是依然有很多問題亟待解決，如miRNA的作用模式等。隨著分子生物學(xué)技術(shù)和生物信息學(xué)的高速發(fā)展，高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展為基因組的測序帶來革命性的改變，它將替代傳統(tǒng)測序技術(shù)，不僅能快速的進(jìn)行miRNA的測序，而且通過對miRNA庫的序列對比，能更好地進(jìn)行miRNA的靶基因預(yù)測和新miRNA的預(yù)測。

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