非培養(yǎng)技術(shù)在非移植、非粒細(xì)胞缺乏的重癥患者真菌感染診斷中的應(yīng)用進(jìn)展

石 巖

隨著對(duì)侵襲性真菌感染認(rèn)識(shí)的提高，早期經(jīng)驗(yàn)性抗真菌治療被越來越多的臨床醫(yī)師采用，但在非移植、非粒細(xì)胞缺乏領(lǐng)域經(jīng)驗(yàn)治療的作用尚未明確，早期診斷是提高治療準(zhǔn)確性、降低過度治療以及由此產(chǎn)生的真菌耐藥、醫(yī)療資源耗費(fèi)及不良反應(yīng)增加等的關(guān)鍵。由于組織病理和培養(yǎng)技術(shù)的靈敏度低、耗時(shí)長(zhǎng)，難以滿足臨床需要，非培養(yǎng)技術(shù)成為近年研究熱點(diǎn)，并已被批準(zhǔn)用于血液系統(tǒng)惡性疾病、實(shí)體器官移植受者等免疫受損人群侵襲性真菌感染的診斷［1－2］，在非移植、非粒細(xì)胞缺乏的重癥患者中也受到廣泛重視。

一、血清學(xué)診斷技術(shù)

主要通過檢測(cè)真菌抗原、抗體或代謝產(chǎn)物指導(dǎo)早期診斷。目前應(yīng)用較廣泛的有（1，3）－β－D葡聚糖、半乳甘露聚糖抗原、甘露聚糖抗原及抗體檢測(cè)。

（一）（1，3）－β－D葡聚糖

1.（1，3）－β－D葡聚糖在ICU人群的應(yīng)用研究：（1，3）－β－D葡聚糖廣泛存在于除接合菌、隱球菌外的真菌細(xì)胞壁中，酵母菌含量最高，其他微生物（如細(xì)菌、病毒、動(dòng)物和人體細(xì)胞）無(wú)該成分，在侵襲性真菌感染時(shí)釋放入血液或其他體液，能特異性激活自鱟變形細(xì)胞溶解產(chǎn)物中的凝血因子G因子，故稱為G試驗(yàn)。

盡管血液系統(tǒng)惡性疾病及實(shí)體器官移植領(lǐng)域的薈萃分析顯示，（1，3）－β－D葡聚糖具有較高的特異度（80%～99%）和靈敏度（50%～85%）［3］，但 Digby等［4］在ICU進(jìn)行的研究顯示，大部分患者（88%）（1，3）－β－D葡聚糖水平升高，在確診真菌血癥和細(xì)菌血癥的患者間無(wú)差異，認(rèn)為其對(duì)ICU內(nèi)不具有典型宿主因素患者的侵襲性真菌感染的診斷缺乏特異性。

與該研究結(jié)果不同，其后2項(xiàng)大樣本的回顧性研究初步顯示，（1，3）－β－D葡聚糖在該領(lǐng)域侵襲性真菌感染的診斷中仍具有較高的特異度。其中Ostrosky－Zeichner等［5］對(duì)6所醫(yī)院一年半內(nèi)（1，3）－β－D葡聚糖測(cè)定的333例（70%無(wú)血液系統(tǒng)惡性疾病或非實(shí)體器官移植受者）進(jìn)行回顧性分析，顯示單次＞60 ng／L 在符合確診（117 例）及臨床 診斷（46例）侵襲性真菌感染標(biāo)準(zhǔn)的人群中具有較高特異度（87.1%）和中等程度的靈敏度（69.9%）。與該研究相似，Koo等［6］回顧性研究也顯示，其具有較高特異度 （84%）和中等程度的靈敏度（64%）（Fungitell，＞80 ng／L）。由于該階段的研究主要是基于實(shí)驗(yàn)室的臨床資料回顧，并非專門針對(duì)ICU重癥患者的臨床研究，故其價(jià)值未被廣泛認(rèn)可。

自2009年起，在非移植、非粒細(xì)胞缺乏的重癥患者中開展了一系列前瞻性研究，為G試驗(yàn)的應(yīng)用提供了有力證據(jù)。其中較具影響力的研究主要集中于下列3方面。

首先是動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)（1，3）－β－D葡聚糖指導(dǎo)侵襲性真菌感染早期診斷。Presterl等［7］對(duì)ICU內(nèi)真菌感染的高?；颊呙恐?次動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)（1，3）－β－D 葡聚糖。最終確診24例，未證實(shí)58例。與對(duì)照組（外科非重癥患者115例）比較，第7天的（1，3）－β－D葡聚糖中位水平分別為44、22、12.9 ng／L（P＜0.001），真菌感染組（1，3）－β－D 葡聚糖水平更高。第7天（1，3）－β－D葡聚糖 ＞40 ng／L診斷侵襲性真菌感染的受試者工作曲線下面積為0.7，靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)計(jì)值和陰性預(yù)計(jì)值分別52.2%、75.9%、46.2%和80.0%。該研究的重要意義在于其指出動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)有助于排除假陽(yáng)性，若持續(xù)升高對(duì)該人群侵襲性真菌感染的早期診斷仍有幫助。

其次是G試驗(yàn)聯(lián)合侵襲性念珠菌病的臨床風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)模型協(xié)助早期診斷。Posteraro等［8］率先比較了（1，3）－β－D葡聚糖、念珠菌評(píng)分和真菌定植指數(shù)［9］對(duì)ICU內(nèi)非移植、非粒細(xì)胞缺乏的高?；颊咔忠u性真菌感染的預(yù)測(cè)作用。95例患者中最終確診16例（14例念珠菌），其診斷靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)計(jì)值和陰性預(yù)計(jì)值分別為93.7%、93.6%、75.0%和98.6%（Fungitell，＞80 ng／L），早于真菌培養(yǎng)1～3 d。同時(shí)，與念珠菌評(píng)分和真菌定植指數(shù)相比，（1，3）－β－D葡聚糖呈現(xiàn)更高的靈敏度和特異度（念珠菌評(píng)分分別為85.7%和88.6%；真菌定植指數(shù)為64.3%和69.7%）。該研究的另一重要發(fā)現(xiàn)是（1，3）－β－D葡聚糖聯(lián)合念珠菌評(píng)分能顯著改善診斷靈敏度和陰性預(yù)計(jì)值（均達(dá)100%），而聯(lián)合真菌定植指數(shù)并未顯示額外優(yōu)勢(shì)。這對(duì)于進(jìn)一步開展以念珠菌評(píng)分為指導(dǎo)的，篩選高危人群進(jìn)行（1，3）－β－D葡聚糖檢測(cè)提供了重要依據(jù)。因此，被認(rèn)為是ICU領(lǐng)域的里程碑式研究。

再者是應(yīng)用（1，3）－β－D葡聚糖指導(dǎo)抗真菌治療時(shí)機(jī)的研究。Hanson等［10］率先進(jìn)行隨機(jī)對(duì)照研究，入選住ICU≥3 d并預(yù)計(jì)仍需住2 d以上的患者64例，按3∶1隨機(jī)分為每周監(jiān)測(cè)2次（1，3）－β－D葡聚糖并指導(dǎo)搶先治療組（48例）和經(jīng)驗(yàn)性抗真菌治療組（16例）。最終分別有21例接受搶先治療和5例經(jīng)驗(yàn)治療，搶先治療組（1，3）－β－D葡聚糖水平更高。但由于該研究樣本量較小，最終僅1例確診侵襲性真菌感染，5例臨床診斷，無(wú)法進(jìn)一步評(píng)估（1，3）－β－D葡聚糖指導(dǎo)的搶先治療對(duì)真菌感染率及預(yù)后的影響，故有待進(jìn)一步研究證實(shí)以G試驗(yàn)為指導(dǎo)的干預(yù)時(shí)機(jī)對(duì)臨床的影響及經(jīng)濟(jì)學(xué)效益。

2.（1，3）－β－D 葡聚糖在ICU 應(yīng)用的問題和前景：應(yīng)特別注意在ICU重癥患者中多種因素可導(dǎo)致G試驗(yàn)假陽(yáng)性。如體液中的蛋白酶可干擾檢測(cè)結(jié)果，抗腫瘤藥物中的多糖、半合成青霉素、含葡聚糖成分的濾器、紗布、血制品、某些類型的血流感染以及操作過程污染等［11－12］。另外，隱球菌、接合菌感染時(shí)可呈假陰性。同時(shí)，還應(yīng)了解不同的試劑盒（來自于不同種的鱟提煉的G因子）的診斷閾值不同，目前主要有Fungitec（日本）和Fungitell（美國(guó)）兩種，前者診斷閾值多推薦為20 ng／L，后者為60 ng／L或80 ng／L。更重要的是，G試驗(yàn)僅僅是輔助臨床早期診斷侵襲性真菌感染的手段之一，它不能區(qū)分真菌種屬，故仍需其他手段鑒定。

目前G試驗(yàn)在ICU領(lǐng)域的研究剛剛起步，進(jìn)一步應(yīng)建立臨床操作及檢測(cè)過程規(guī)范，聯(lián)合多項(xiàng)血清學(xué)技術(shù)有助于降低假陽(yáng)性［13］。同時(shí)，應(yīng)探索適宜的檢測(cè)時(shí)機(jī)。由于常規(guī)篩查作用有限，甚至受假陽(yáng)性的誤導(dǎo)，目前建議在具備多種危險(xiǎn)因素或結(jié)合念珠菌評(píng)分篩選出的高危人群中動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，更符合成本效益原則［14］。更進(jìn)一步聯(lián)合G試驗(yàn)與臨床疾病特征建立ICU抗真菌治療分層管理策略。如G試驗(yàn)具有較高的陰性預(yù)計(jì)值，單次（1，3）－β－D葡聚糖陰性具有較高的排除診斷價(jià)值，指導(dǎo)終止抗真菌治療［14］；而（1，3）－β－D葡聚糖持續(xù)增高并排除假陽(yáng)性后指導(dǎo)搶先治療，但需要注意的是不能僅停留在針對(duì)（1，3）－β－D葡聚糖陽(yáng)性的治療，應(yīng)借助其他實(shí)驗(yàn)室技術(shù)進(jìn)一步明確診斷。

（二）半乳甘露聚糖抗原 半乳甘露聚糖是曲霉細(xì)胞壁的特異性多糖成分，可用于侵襲性曲霉病診斷。Pfeiffer等［15］薈萃分析顯示，其對(duì)不同人群的診斷價(jià)值不同。在實(shí)體器官移植者中的靈敏度顯著低于造血干細(xì)胞移植受者 （20%～60%對(duì)61%～70%）。另外，陽(yáng)性率還與人群發(fā)病率有關(guān)，如在發(fā)病率5%～10%的人群中，陽(yáng)性預(yù)計(jì)值僅為23%～53%。在ICU領(lǐng)域的研究也證實(shí)了上述特點(diǎn)，靈敏度較低（約50%），與感染部位、釋放半乳甘露聚糖的量、前期抗真菌藥物應(yīng)用等降低真菌負(fù)荷以及患者對(duì)半乳甘露聚糖的清除有關(guān)［16－17］。上述局限性推動(dòng)了測(cè)定肺泡灌洗液半乳甘露聚糖的研究，主要基于感染部位的標(biāo)本有可能提高診斷靈敏度這一假設(shè)。

Meersseman等［18］率先開展研究，入選110例，最終26例確診肺曲霉病，以肺泡灌洗液半乳甘露聚糖的吸光度指數(shù)＞0.5為閾值，診斷靈敏度為88%，特異度為87%，優(yōu)于血清半乳甘露聚糖（后者的靈敏度僅為42%）。Acosta等［19］入選51例懷疑肺曲霉病患者，同樣顯示肺泡灌洗液半乳甘露聚糖對(duì)確診（4例）和臨床診斷（6例）肺曲霉病的患者的診斷價(jià)值優(yōu)于血半乳甘露聚糖和血（1，3）－β－D 葡聚糖，且比真菌培養(yǎng)陽(yáng)性早4.3（1～10）d。上述研究選擇的臨界值與血清半乳甘露聚糖相同（均為0.5），而國(guó)內(nèi)He等［20］對(duì)34例慢性阻塞性肺疾病患者的研究則認(rèn)為，肺泡灌洗液半乳甘露聚糖的吸光度指數(shù)＞0.8診斷肺曲霉病的預(yù)測(cè)效力最佳，其診斷靈敏度、特異度、陽(yáng)性預(yù)計(jì)值、陰性預(yù)計(jì)值分別為88.9%、100%、100% 和94.4%。迄今為止，盡管一系列的研究初步顯示了肺泡灌洗液半乳甘露聚糖在診斷肺曲霉病中的優(yōu)勢(shì)，但由于樣本量小、缺乏明確的實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)范、選擇了不同的臨界值，以及呼吸道真菌定植對(duì)檢測(cè)的影響，限制了其在ICU應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的建立［21］。

總之，就（1，3）－β－D 葡聚糖與半乳甘露聚糖在ICU應(yīng)用前景而言，盡管（1，3）－β－D葡聚糖不能區(qū)分真菌種類，但I(xiàn)CU人群以侵襲性念珠菌病為主，故較半乳甘露聚糖有更廣的適用人群，目前已被美國(guó)感染病學(xué)會(huì)（IDSA）［22］及拯救膿毒癥組織（SSC）發(fā)表的指南［23］推薦用于ICU非移植、非粒細(xì)胞缺乏的重癥患者侵襲性真菌感染的輔助診斷。當(dāng)然，（1，3）－β－D葡聚糖假陽(yáng)性率高，不穩(wěn)定，易受操作過程污染，建議重復(fù)檢測(cè)或聯(lián)合半乳甘露聚糖提高診斷準(zhǔn)確性［24］。

（三）甘露聚糖抗原和抗體 甘露聚糖是組成酵母菌細(xì)胞壁的主要成分，約占細(xì)胞干重的7%，感染時(shí)釋放入血。早先應(yīng)用的Cand－Tec試劑盒，因靈敏度和特異度不一，且類風(fēng)濕因子導(dǎo)致假陽(yáng)性，限制了其發(fā)展。目前的試劑盒主要有ELISA法抗原檢測(cè)和流式免疫分析法。Prella等［25］研究顯示，流式免疫分析法對(duì)重癥患者侵襲性念珠菌病診斷的靈敏度略高 （82%對(duì)53%），特異度相似 （96%對(duì)93%）。同時(shí)，靈敏度還與真菌種類有關(guān)，如白念珠菌較高，近平滑念珠菌略低，特別是應(yīng)用ELISA法抗原檢測(cè)時(shí)。

甘露聚糖抗原半衰期短，血中很快出現(xiàn)抗甘露聚糖抗體，故在高?；颊呓ㄗh同時(shí)檢測(cè)抗體。試劑盒 Platelia Candida Antibody （Bio－Rad Laboratories，Marnes－la－Coquette，F(xiàn)rance）診斷侵襲性念珠菌病的靈敏度59%，特異度83%，當(dāng)聯(lián)合甘露聚糖抗原后，靈敏度可達(dá)83%［25］。目前甘露聚糖抗原和抗體檢測(cè)被SSC頒布的新指南列為2C級(jí)推薦［23］，較低的推薦級(jí)別提示有待進(jìn)一步大規(guī)模研究。

二、分子生物學(xué)技術(shù)

已有多項(xiàng)技術(shù)，如聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）、分子探針、限制性酶切片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析、DNA指紋圖譜、隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA等用于真菌感染的診斷和分型。其中，以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的方法有較高敏感度和特異度，特別是對(duì)于生長(zhǎng)緩慢和難以培養(yǎng)的真菌，是一項(xiàng)非常有希望的技術(shù)，但目前大部分仍處于實(shí)驗(yàn)室手工提取DNA階段。薈萃分析顯示，單次PCR對(duì)侵襲性曲霉病診斷的靈敏度及特異度分別為88%和75%，肺孢菌（耶氏肺孢菌）為57.1%和98.6%，念珠菌則均＞90%［26－28］。單次 PCR 陰性足以排除診斷，但若確定診斷則需2次陽(yáng)性。

第1 個(gè)實(shí)時(shí) PCR（real time－PCR）診斷試劑盒——SeptiFast，可在6 h內(nèi)觀察5種重要的致病念珠菌，診斷靈敏度和特異度均在90%以上，但對(duì)光滑念珠菌可呈假陰性，可能與用于DNA提取的血樣中真菌負(fù)荷較低有關(guān)［29］。另一個(gè)試劑盒SeptiTest也開始用于臨床［30］。

下列因素限制了該技術(shù)的臨床推廣。① 假陽(yáng)性以及不能鑒別感染與定植：多數(shù)病原真菌在自然界廣泛存在而造成樣本污染，特別是使用非特異性真菌作為引物，并針對(duì)高度保守的rRNA基因時(shí)更易出現(xiàn)假陽(yáng)性；同時(shí)真菌在皮膚、黏膜或其他體腔定植，難以與感染鑒別；②假陰性：如真菌細(xì)胞壁阻礙其釋放DNA、存在PCR抑制劑、體內(nèi)真菌負(fù)荷低且DNA樣本量小或技術(shù)本身無(wú)法識(shí)別的真菌等；③缺乏實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化，如DNA提取、選擇最佳樣本、確定檢測(cè)基因等［31］。

綜上所述，非培養(yǎng)技術(shù)在ICU非移植、非粒細(xì)胞缺乏患者侵襲性真菌感染診治中有了長(zhǎng)足進(jìn)步，但其確切作用有待進(jìn)一步研究證實(shí)。在廣泛開展前，必須掌握技術(shù)規(guī)范和影響因素，同時(shí)選擇適宜人群及檢測(cè)時(shí)機(jī)，并聯(lián)合多種技術(shù)，才能為制訂個(gè)體化抗真菌治療策略提供幫助。

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