水稻近等基因系構(gòu)建及應(yīng)用研究進(jìn)展

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128）

水稻近等基因系構(gòu)建及應(yīng)用研究進(jìn)展

盛浩聞，羅麗華，肖應(yīng)輝*

（湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，長(zhǎng)沙410128）

近等基因系是作物遺傳育種研究中常用的遺傳群體，具有遺傳背景簡(jiǎn)單的特點(diǎn)。介紹了回交轉(zhuǎn)育、從突變體中和高世代群體中分離以及其他綜合方法等構(gòu)建水稻近等基因系的方法，綜述了近等基因系在水稻基因定位、基因效應(yīng)研究、品種選育、生理機(jī)能和重要農(nóng)藝性狀鑒定等方面的應(yīng)用情況。

水稻；近等基因系；遺傳群體構(gòu)建；基因定位

近等基因系（Near Isogenic Lines，NIL）指一組遺傳背景相同或相近，而只在個(gè)別染色體區(qū)段或某個(gè)特定性狀上存在差異的一組品系。通過連續(xù)回交轉(zhuǎn)育的近等基因系，又可稱為滲入系（Introgression lines）和單片段代換系（Single segment substitution line，SSSL）等。自從Clark［1］首次應(yīng)用大豆近等基因系研究其對(duì)根瘤的反應(yīng)以來，近等基因系在不同作物的遺傳和育種研究中得以廣泛應(yīng)用，特別是近年來在作物基因精細(xì)定位和基因功能研究方面發(fā)揮了重要作用。

水稻是我國乃至全世界最重要的糧食作物，加之其基因組相對(duì)較小并與其他禾本科植物基因組具有共線性［2］，使其成為作物分子遺傳學(xué)及基因組研究的模式植物。針對(duì)不同的農(nóng)藝生理性狀，已構(gòu)建了大量的水稻近等基因系，并廣泛應(yīng)用于基因定位、基因功能和遺傳效應(yīng)分析、生理機(jī)制解析以及品種選育。

1 水稻近等基因系的構(gòu)建方法

1.1 回交轉(zhuǎn)育

回交轉(zhuǎn)育法是構(gòu)建近等基因系最常用的方法。以帶有目的基因／性狀的植株（供體親本）與擬導(dǎo)入該目標(biāo)基因／性狀的植株（受體親本）進(jìn)行雜交，在其后的各分離世代中每代均選擇包含目標(biāo)基因／性狀的植株與受體親本回交，回交至一定世代后使之自交分離并純合穩(wěn)定，從中篩選獲得具有目標(biāo)基因／性狀的植株，遺傳背景與輪回親本相近，兩者互為近等基因系。20世紀(jì)90年代以前，回交轉(zhuǎn)育構(gòu)建近等基因系在水稻不育系改良和抗病品種選育方面得到大量應(yīng)用。20世紀(jì)70年代，我國通過連續(xù)回交進(jìn)行核代換選育了大量的雄性不育系和保持系，從而使三系法雜交水稻取得成功［3］。此外，利用一套抗病基因分別導(dǎo)入一個(gè)共同的輪回親本上，育成農(nóng)藝性狀相同而抗性基因不同的近等基因系，然后將各近等基因系混合組成多系品種，曾是解決稻瘟病、白葉枯病等病害對(duì)水稻危害的重要途徑［4］。

隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，很多與水稻產(chǎn)量、品質(zhì)和抗性相關(guān)的功能基因相繼被定位或克隆，這就為回交轉(zhuǎn)育構(gòu)建近等基因系目標(biāo)基因／性狀的選擇提供了新手段，即DNA分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)。在每一代回交過程對(duì)目標(biāo)性狀或含有目標(biāo)基因單株的選擇，可以直接依據(jù)DNA標(biāo)記進(jìn)行，省卻了傳統(tǒng)回交轉(zhuǎn)育目標(biāo)性狀鑒定的環(huán)節(jié)，并且在抽穗開花前即可確定用于回交的單株，從而加快了回交轉(zhuǎn)育構(gòu)建近等基因系的進(jìn)程。目前，DNA分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)已在近等基因系構(gòu)建中得以廣泛應(yīng)用。如，李健等［5］將Sbe1、Sbe3、Isa、Pull和SSSI等與支鏈淀粉結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因，通過分子標(biāo)記輔助選擇回交導(dǎo)入桂朝2號(hào)構(gòu)建了5個(gè)近等基因系。又如，鄧化冰等［6］采用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，將來自于馬來西亞普通野生稻的兩個(gè)增產(chǎn)QTL yld1.1和yld2.1，回交轉(zhuǎn)移到超級(jí)稻恢復(fù)系9311中，獲得分別攜帶yld1.1、yld2.1及同時(shí)攜帶yld1.1和yld2.1的3套近等基因系。

1.2 從突變體中分離

在自然條件下，純合的水稻品系中一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)位點(diǎn)發(fā)生自然突變或人工誘變后經(jīng)自交純化，獲得的突變體僅目標(biāo)性狀發(fā)生變化而其他遺傳背景不變，其與原品系互為近等基因系。從自然突變體中分離獲得的近等基因系，曾使我國的水稻育種技術(shù)發(fā)生了幾次重大變革。如，1956年洪春利等在當(dāng)?shù)胤N植的高稈品種“南特16”田塊邊發(fā)現(xiàn)兩株矮化的自然變異株，通過系統(tǒng)選育培育出我國第一個(gè)矮稈水稻品種“矮腳南特”［7］，開創(chuàng)了矮化育種的先例。又如，石明松［8］在農(nóng)墾58大田中發(fā)現(xiàn)的光敏感雄性不育突變株農(nóng)墾58S，除了其育性發(fā)生變化外，其余性狀與原始品系農(nóng)墾58基本一致，該近等基因系的發(fā)現(xiàn)開辟了我國水稻兩系法雜種優(yōu)勢(shì)利用的新途徑。

1.3 從高世代群體中分離

近年來，重組自交系、回交重組自交系和染色體片段置換系等遺傳群體相繼構(gòu)建用于基因定位等遺傳分析研究。在這些遺傳群體的高世代中，由于連續(xù)自交使各株系的絕大多數(shù)基因組趨于純合，僅有極少數(shù)基因位點(diǎn)仍處于雜合狀態(tài)，這樣的株系稱為剩余雜合體（Residual heterozygous line，RHL）。剩余雜合體繼續(xù)自交就可得到目標(biāo)性狀／基因分離的2種純合類型，即構(gòu)成對(duì)應(yīng)性狀差異明顯的近等基因系。Tang等［9］采用爪哇稻品種D50和秈稻品種HB277為親本構(gòu)建了一套包含178個(gè)株系的重組自交系群體，在其F7代中發(fā)現(xiàn)一個(gè)在第3染色體RM130～RM85標(biāo)記區(qū)間雜合的株系，該株系基因組其他區(qū)域均表現(xiàn)純合；由于該染色體區(qū)域包涵一個(gè)已知控制千粒重的QTL qTGW3.2，因此該株系自交分離的后代即RHL F2單株間僅在目標(biāo)基因位點(diǎn)發(fā)生分離，可用于該QTL的精細(xì)定位分析。Zhang等［10］從衍生于CDL／R1126的一套稻谷粒形差異顯著的重組自交系群體F6中，觀察到一個(gè)粒形分離的株系RIL28，該株系自交形成的800株F7植株稻谷粒長(zhǎng)呈3∶1的分離比例，由此推斷RIL28為一個(gè)稻谷粒形單基因分離的剩余雜合體，其分離后代中的長(zhǎng)粒形和短粒形單株則互為近等基因系，利用該株系的衍生后代精細(xì)定位了控制稻谷粒形的基因GS2。

1.4 其他綜合方法

現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，為近等基因系的構(gòu)建提供了新的途徑。如轉(zhuǎn)基因技術(shù)與回交技術(shù)相結(jié)合，就是近年應(yīng)用較多的一種近等基因系構(gòu)建方法。在通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源豌豆鐵蛋白基因Fer34導(dǎo)入粳稻品種秀水11的基礎(chǔ)上，趙霏等［11］以原始受體親本秀水11為輪回親本，轉(zhuǎn)基因純系為非輪回親本，采用gus標(biāo)記基因輔助選擇連續(xù)回交，獲得含目標(biāo)基因的BC6F3純合穩(wěn)定近等基因系Fer34-XS11。該近等基因系可以避免轉(zhuǎn)基因植株再生過程中可能產(chǎn)生的無性系變異的干擾，從而能客觀評(píng)價(jià)外源豌豆鐵蛋白基因?qū)胨竞髮?duì)受體生物學(xué)特性的影響。

2 水稻近等基因系的應(yīng)用

2.1 在水稻基因定位中的應(yīng)用

水稻的產(chǎn)量、品質(zhì)等重要的農(nóng)藝性狀，大多屬于復(fù)雜的數(shù)量遺傳性狀，表現(xiàn)為連續(xù)的變異，同時(shí)也易受環(huán)境條件的影響。采用F2、重組自交系和DH等初級(jí)群體進(jìn)行QTL定位，往往因群體遺傳背景復(fù)雜，造成QTL定位的精確性偏低，就難以對(duì)QTL進(jìn)行準(zhǔn)確的效應(yīng)估計(jì)和可靠的標(biāo)記輔助選擇，更難以對(duì)QTL進(jìn)行克隆分離。有學(xué)者提出構(gòu)建多數(shù)染色體區(qū)段來自同一遺傳背景，而目標(biāo)基因所在染色體區(qū)段有差異的近等基因系，以用于基因精細(xì)定位研究［12］。近等基因系間的遺傳差異僅限于某一染色體片段，表型差異是由該染色體片段的差異所引起，能有效地消除遺傳背景的干擾。在初級(jí)定位基礎(chǔ)上，利用近等基因系雜交并自交建立次級(jí)分離群體，使QTL定位分析局限在很窄的染色體區(qū)域上，消除遺傳背景變異的干擾，從遺傳上和統(tǒng)計(jì)上保證對(duì)QTL的精確定位。

利用近等基因系進(jìn)行基因精細(xì)定位的具體策略為：（1）對(duì)目標(biāo)基因進(jìn)行初級(jí)定位；（2）利用初級(jí)定位的標(biāo)記構(gòu)建近等基因系；（3）近等基因系雜交并自交，建立只在目標(biāo)染色體區(qū)段發(fā)生分離的F2群體；（4）鑒定F2群體中各單株的目標(biāo)性狀的表型；（5）用多態(tài)性分子標(biāo)記分析F2各單株的標(biāo)記基因型；（6）聯(lián)合表現(xiàn)型數(shù)據(jù)和標(biāo)記型數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，估算目標(biāo)基因與標(biāo)記間的距離。利用該策略已精細(xì)定位并克隆了水稻中許多非常重要的農(nóng)藝性狀相關(guān)的QTL。

姚國新等［13］選擇基因型雜合的BC4F2單株自交構(gòu)建BC4F3大群體，將芒基因AWN3-1定位在第3染色體RM6283和RM5685之間。Luo等［14］以不同世代單株回交、自交，最終采用BC5F4將控制千粒重的qTGW5和每穗穎花數(shù)的qSSP5精細(xì)定位，將兩個(gè)緊密連鎖的基因分解為各自獨(dú)立遺傳的孟德爾因子。

2.2 在水稻基因效應(yīng)研究方面的應(yīng)用

由于近等基因系間遺傳背景相近，表型性狀差別僅由個(gè)別染色體區(qū)段或基因位點(diǎn)的差異引起，因此近等基因系是研究基因功能和基因遺傳互作的有力工具。Zhang等［15］報(bào)道無論是主效基因還是微效基因，近等基因系檢測(cè)的LOD值和表型變異解釋率均遠(yuǎn)大于重組自交系，其根本原因在于近等基因系消除了遺傳背景影響，從而使基因遺傳效應(yīng)充分顯現(xiàn)。

Yamamoto等［16］利用近等基因系群體雜交的F2群體，發(fā)現(xiàn)Hd2和Hd6存在上位性作用，影響水稻光周期敏感性。楊蓋宇等［17］分別構(gòu)建兩個(gè)QTL同時(shí)分離的近等基因系群體，發(fā)現(xiàn)第7染色體的Ghd7和第1染色體的Qph1在控制株高的遺傳上表現(xiàn)出上位性互作效應(yīng)。Kobayashi等［18］構(gòu)建分別包含單基因qWB6和雙基因qWB6＋qWB9的近等基因系，發(fā)現(xiàn)qWB6在多個(gè)環(huán)境中均能獨(dú)自起作用；而qWB9則需在qWB6存在前提下才能發(fā)揮作用。

2.3 在水稻育種中的應(yīng)用

構(gòu)建近等基因系所采用的回交轉(zhuǎn)育方法，通常也用于水稻品種改良，特別是在細(xì)胞質(zhì)核互作雄性不育系的選育和品種病蟲害抗性的改良中應(yīng)用較多。通過該育種方法，能將細(xì)胞質(zhì)不育基因轉(zhuǎn)移到農(nóng)藝性狀優(yōu)良的背景親本中，培育綜合性狀優(yōu)良的新不育系。將不同抗性基因回交轉(zhuǎn)移到同一優(yōu)良品種中形成的多個(gè)抗性近等基因系混合而成的多系品種，則能大大提高水稻對(duì)病蟲害的抗性進(jìn)而提高品種產(chǎn)量穩(wěn)定性。

DNA分子標(biāo)記技術(shù)的快速發(fā)展，為回交轉(zhuǎn)育目標(biāo)性狀／基因的高效準(zhǔn)確選擇提供了可能。近年分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛應(yīng)用于育種實(shí)踐，在水稻稻瘟?。?9］、白葉枯?。?9，20］、細(xì)菌性條斑?。?1］、黑條矮縮?。?2］、褐飛虱［23］等病蟲害抗性、耐鹽性［24］和稻米品質(zhì)性狀［25］改良等方面發(fā)揮了重要作用。潘曉飚等［19］利用分子標(biāo)記輔助選擇和田間鑒定選擇相結(jié)合的方法，將三黃占2號(hào)的抗稻瘟病主基因Pi-GD -1（t）、Pi-GD-2（t）和主效QTL GLP8-6（t）及IR24的抗白葉枯病基因Xa23導(dǎo)入到明恢86、蜀恢527和浙恢7954等骨干恢復(fù)系，復(fù)交育成帶有抗稻瘟病兼抗白葉枯病的雙基因或多基因聚合系。閆成業(yè)等［20］通過分子標(biāo)記輔助選擇，最終獲得以先恢207為背景，分別攜帶Xa7、Xa21、Xa23基因以及聚合兩個(gè)不同抗性基因的近等基因系，顯著改良了其白葉枯病抗性。李愛宏等［22］采用分子標(biāo)記技術(shù)，以“明恢63”第6染色體短臂上緊密連鎖的2個(gè)抗性QTL為基因源，構(gòu)建了“淮稻5號(hào)”攜帶目標(biāo)抗性QTL的系列近等基因系，自然接種和人工接種鑒定表明水稻黑條矮縮病抗性得到顯著改良。Hu等［23］以藥用野生稻轉(zhuǎn)育成的B5為供體親本，以明恢63和珍汕97B為受體，分別采用與目標(biāo)基因Bph14、Bph15連鎖的側(cè)翼標(biāo)記進(jìn)行輔助選擇，從BC3F2群體中選育出包含Bph14、Bph15以及聚合兩個(gè)基因的近等基因系，對(duì)褐飛虱的抗性較受體親本顯著增強(qiáng)。

除應(yīng)用于單個(gè)農(nóng)藝性狀的回交改良和少數(shù)性狀的基因聚合以外，構(gòu)建近等基因系還是分子設(shè)計(jì)育種的重要環(huán)節(jié)。荷蘭科學(xué)家Peleman和van der Voort［26］最早提出了設(shè)計(jì)育種（Breeding by design）的概念，并且詳細(xì)闡述了設(shè)計(jì)育種的三個(gè)環(huán)節(jié)：定位所有農(nóng)藝相關(guān)性狀的QTLs，評(píng)價(jià)這些位點(diǎn)的等位性變異，進(jìn)行設(shè)計(jì)育種。在該育種技術(shù)體系中，QTL滲入系（即近等基因系）是貫穿品種設(shè)計(jì)育種始終的關(guān)鍵元件。首先，開展全基因組所有農(nóng)藝性狀的QTL精細(xì)定位，必須建立基于全基因組的滲入系文庫（Introgression line library），后者是由大量遺傳背景相似而包含不同基因位點(diǎn)的近等基因系所組成的遺傳群體，由于其遺傳背景單一，特別適合遺傳效應(yīng)小的QTL的精細(xì)定位；其次，每一個(gè)基因或者QTL的等位性變異引起的遺傳效應(yīng)或者不同基因位點(diǎn)間的互作，必須依賴于遺傳背景清晰的近等基因系才能完成；再者，近等基因系是設(shè)計(jì)育種組裝實(shí)施的最適元件，只要將控制同一性狀的不同近等基因系相互雜交，通過分子標(biāo)記輔助選擇，就可實(shí)現(xiàn)相應(yīng)性狀的組裝和精準(zhǔn)調(diào)控。

2.4 在水稻生理機(jī)能研究方面的應(yīng)用

以往關(guān)于水稻生理特性的研究，多側(cè)重于比較研究不同基因型品種間的生理指標(biāo)差異，但由于不同品種的遺傳背景差異較大，難以揭示其生理機(jī)制。近等基因系遺傳背景相同或相近，對(duì)于解析生理機(jī)制具有獨(dú)到優(yōu)勢(shì)，近年來常用于作物生理研究。

Venuprasad等［27］利用近等基因系研究干旱脅迫對(duì)水稻產(chǎn)量的影響，發(fā)現(xiàn)最耐旱的株系在極度干旱下表現(xiàn)出較高的蒸騰速率和氣孔導(dǎo)度。符冠富等［28］以近等基因系研究花期干旱脅迫條件下耐旱性生理性狀和農(nóng)藝性狀的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)淡黃綠葉色及金黃谷色的近等基因系耐旱性相對(duì)較強(qiáng)，建議在水稻耐旱性品種選育中更多關(guān)注這些葉色性狀。楊永杰等［29］采用近等基因系的研究則表明，花期干旱脅迫下水稻耐旱性與劍葉含水量、水勢(shì)和氣孔導(dǎo)度的降幅這3個(gè)水分生理參數(shù)密切相關(guān)。

Ohsumi等［30］構(gòu)建了分別滲入一次枝梗數(shù)QTL（SBN1）、二次枝梗數(shù)QTL（PBN6）以及聚合了兩QTL（SBN1＋PBN6）的近等基因系，三者每穗穎花數(shù)即庫容量較背景親本分別增加28%～37%、9%～16%和62%～65%，但產(chǎn)量卻未顯著提高，其原因是抽穗前莖鞘中碳水化合物積累量并未顯著增加，指出單一擴(kuò)大庫容量并不能使水稻增產(chǎn)。Hashida等［31］研究表明，攜帶蔗糖磷酸合成酶基因（Os-SPS1）的近等基因系，在移栽期和穗分化期葉片蔗糖磷酸合成酶的活性遠(yuǎn)高于其背景親本，而在抽穗期卻無顯著差異；同時(shí)發(fā)現(xiàn)近等基因系分化出更多的二次枝梗引起每穗穎花數(shù)顯著增多，據(jù)此推斷穗分化期源葉中蔗糖磷酸合成酶活性增大可能促進(jìn)干物質(zhì)分配到穗進(jìn)而增加二次枝梗數(shù)。

2.5 在農(nóng)藝性狀鑒別上的應(yīng)用

隨著研究的逐步深入，越來越多帶有優(yōu)異農(nóng)藝性狀的水稻種質(zhì)資源不斷被發(fā)現(xiàn)與創(chuàng)制，鑒定并挖掘控制這些優(yōu)異性狀的功能基因是育種應(yīng)用的前提和基礎(chǔ)。然而，攜帶這些功能基因的特異種質(zhì)往往分布在不同的地域或研究單位，鑒定這些基因與以往報(bào)道的基因是否一致，就必須進(jìn)行等位性分析或者采用統(tǒng)一的鑒別系鑒定。對(duì)于抽穗期、稻瘟病和白葉枯病抗性等重要的農(nóng)藝性狀，國際上已建立了多套相應(yīng)的近等基因系。

自20世紀(jì)50年代以來，日本、美國、菲律賓、中國臺(tái)灣省、印度、韓國、泰國等國家和地區(qū)先后建立了鑒別品種體系，用于鑒別稻瘟病的不同生理小種［32］。由于這些鑒別品種的遺傳背景復(fù)雜，鑒別能力不強(qiáng)，并且不具有通用性［32］，因此國際水稻研究所利用秈稻品種CO39作為輪回親本育成一套由4個(gè)系統(tǒng)組成的近等基因系［33］，我國的凌忠專等［32］又建立了以麗江新團(tuán)黑谷為遺傳背景的近等基因鑒別系。這些近等基因鑒別系隨后被不斷更新和擴(kuò)充［34］，并在世界各地被廣泛應(yīng)用于稻瘟病菌系的鑒定［35］。

在水稻抽穗期方面，日本科學(xué)家先后構(gòu)建了兩套近等基因系，分別是包括EG1-EG7以EG0為背景的抽穗期主基因近等基因系［36］和包含Hd1、Hd2、Hd3、Hd5和Hd6的以日本晴為背景的抽穗期QTL近等基因系［37，38］。利用這些近等基因系先后分析了我國不同生態(tài)類型水稻品種的抽穗期基因型［39～41］，為我國不同生態(tài)區(qū)域水稻品種的生育期育種目標(biāo)的制訂提供了決策依據(jù)［42］。

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Advances on Developm ent and Application of Near Isogenic Lines in Rice

SHENG Hao-wen，LUO Li-hua，XIAO Ying-hui*

（College of Agronomy，Hunan Agricultural University，Changsha，Hunan 410128，China）

Near isogenic lines，which with a simple genetic background，was commonly used in genetics and breeding research of crops.Themethods include backcrossing，isolating from mutants and advanced population，and other integrated methods for developing near isogenic lines in ricewere introduced.The application of near isogenic lines in genemapping，gene effects analysis，breeding，physiology function identification and agronomic traits evaluation were summarized.

Rice；Near isogenic lines；Development of genetics population；Genemapping

S511.032

A

1001-5280（2014）03-0306-06 DOI：10.3969／j.issn.1001-5280.2014.03.22

2014 02 05

盛浩聞（1989-），男，內(nèi)蒙古包頭市人，碩士研究生，Email：987687301＠qq.com。*通信作者，肖應(yīng)輝，博士，研究員，從事水稻遺傳育種研究，Email：xiaoyh＠hunau.net。

教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃（IRT1239）；湖南省高校科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)支持計(jì)劃。