椎間盤細(xì)胞增殖和分化的研究進(jìn)展

劉書豪 費(fèi)琴明

(復(fù)旦大學(xué)附屬中山醫(yī)院骨科，上海 200032)

椎間盤退化是導(dǎo)致椎間盤病變及腰部疼痛的主要原因之一。椎間盤退化的原因包括:髓核細(xì)胞的功能降低和數(shù)量減少以及蛋白聚糖、Ⅱ型膠原蛋白等基質(zhì)成分的減少［1-2］;遺傳因素、機(jī)體衰老以及椎間盤營養(yǎng)缺失、過度受壓;椎間盤特殊的內(nèi)環(huán)境如高滲、低氧、低營養(yǎng)、高酸性等［3-6］?，F(xiàn)就椎間盤細(xì)胞增殖和分化的研究進(jìn)展作一綜述。

1 椎間盤細(xì)胞的起源和其在出生后的增殖過程

椎間盤細(xì)胞來源于胚胎時(shí)期的脊索，其在出生后不久，分化為脊索細(xì)胞和類軟骨細(xì)胞。McCann等［7］用Noto-cre鼠來追蹤脊索源性細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)髓核細(xì)胞內(nèi)的脊索細(xì)胞以及軟骨樣細(xì)胞均起源于胚胎脊索。Dahia等［8］對(duì)出生后不同時(shí)間小鼠椎間盤細(xì)胞增殖分化的情況進(jìn)行了研究，他們用磷酸化組蛋白H3對(duì)椎間盤細(xì)胞進(jìn)行染色，發(fā)現(xiàn)出生后2～3周內(nèi)椎間盤細(xì)胞處于增殖狀態(tài)，第1周達(dá)到峰值，3周后停止;而椎間盤細(xì)胞外基質(zhì)在出生3周后仍繼續(xù)增多，致使椎間盤體積不斷增大;纖維環(huán)細(xì)胞在出生后1周內(nèi)表現(xiàn)為圍繞髓核的連續(xù)性結(jié)構(gòu)，1周后這些細(xì)胞逐漸分化為連接相鄰椎體的成熟纖維環(huán)細(xì)胞和覆蓋椎體表面并最終形成終板的逐漸鈣化的圓形細(xì)胞;TUNEL染色發(fā)現(xiàn)，出生后2周時(shí)髓核細(xì)胞及生長板細(xì)胞即發(fā)生凋亡，而鈣化終板未發(fā)生凋亡。椎間盤伴隨著椎體一起生長，其調(diào)控機(jī)制可能是一致的。

2 椎間盤干細(xì)胞的分化和干細(xì)胞龕

Risbud等［9］證實(shí)在人退化的椎間盤內(nèi)存在骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)，可分化為成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞。纖維環(huán)分離出來的細(xì)胞也被證實(shí)可以多向分化，甚至可分化為神經(jīng)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞［10］。Blanco等［11］從人退化的椎間盤髓核中分離并擴(kuò)增了MSC，通過流式細(xì)胞免疫表型檢測(cè)、細(xì)胞分化、反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)等技術(shù)證實(shí)，髓核MSC與自體的骨髓MSC在形態(tài)學(xué)、擴(kuò)增潛能、免疫表型、分子譜和分化潛能上相似。Erwin等［12］從狗椎間盤髓核中提取并培養(yǎng)出祖細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)其在體外可分化為軟骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞;在活體(髓磷脂缺乏鼠)內(nèi)有分化為少突膠質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細(xì)胞的傾向，提示髓核祖細(xì)胞有用于神經(jīng)修復(fù)的潛能。Huang等［13］對(duì)恒河猴的研究發(fā)現(xiàn)，在體外，髓核祖細(xì)胞的集落生成能力強(qiáng)于纖維環(huán)祖細(xì)胞;且其在體內(nèi)(裸小鼠皮下移植模型中)或體外擴(kuò)增后，仍有分化潛能。原代髓核祖細(xì)胞和傳代髓核祖細(xì)胞有與骨髓MSC類似的分化能力，而纖維環(huán)祖細(xì)胞的分化能力相對(duì)弱于骨髓MSC。

人體多種組織都有干細(xì)胞龕，如腸、皮膚、腦等，干細(xì)胞龕的存在對(duì)相應(yīng)組織細(xì)胞的擴(kuò)增具有重大意義。Henriksson等［14］采用5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-Deoxyuridine，Brdu)標(biāo)記法檢測(cè)兔的椎間盤細(xì)胞增殖情況，發(fā)現(xiàn)在纖維環(huán)和髓核內(nèi)有增殖細(xì)胞;髓核內(nèi)增殖細(xì)胞極少，纖維環(huán)近骨外緣有少量持續(xù)增殖的細(xì)胞，而在近韌帶區(qū)的纖維環(huán)外緣及軟骨膜區(qū)有大量增殖細(xì)胞。前者被認(rèn)為可能是椎間盤的干細(xì)胞龕，可能對(duì)椎間盤的形態(tài)和功能起重要作用;同時(shí)，Henriksson等對(duì)鼠、豬、人的椎間盤上進(jìn)行了研究并證實(shí)了這一結(jié)論。他們還采用免疫組化手段對(duì)用BrdU進(jìn)行體內(nèi)標(biāo)記的兔椎間盤進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)在肝細(xì)胞轉(zhuǎn)移區(qū)域、BrdU標(biāo)記區(qū)域都存在GDF-5、SMAD1/5、SOX-9細(xì)胞;此外，在這些區(qū)域還發(fā)現(xiàn)了SNAI1、SLUG和β1-INTEGRIN陽性的細(xì)胞，通過與小腸干細(xì)胞龕細(xì)胞的遷移進(jìn)行對(duì)照，證實(shí)椎間盤內(nèi)細(xì)胞增殖是由干細(xì)胞龕內(nèi)細(xì)胞遷移引起的［15］。他們將MSC與椎間盤碎片共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，炎性物質(zhì)生成量下調(diào)。提示干細(xì)胞對(duì)減輕椎間盤炎癥有積極作用［16］。

3 椎間盤細(xì)胞表面標(biāo)志物

雖然干細(xì)胞龕被證實(shí)對(duì)促進(jìn)椎間盤細(xì)胞增殖有明顯效果，但其特異性標(biāo)志物尚未被發(fā)現(xiàn)。目前多用各種軟骨細(xì)胞及MSC標(biāo)志物來定位和提取椎間盤有增殖分化能力的細(xì)胞。Brisby等［17］證實(shí)，在基因?qū)用?，OCT3/4、STRO-1、CD105、CD90和 Notch1在絕大多數(shù)退化的人體椎間盤標(biāo)本中表達(dá)。Huang等［13］在mRNA層面發(fā)現(xiàn)，恒河猴椎間盤細(xì)胞普遍表達(dá)骨髓MSC的表面標(biāo)志物如 CD44、CD166、CD90、CD146、HLA-DR、Notch1等，其中 CD146在髓核增殖細(xì)胞的表達(dá)量高于骨髓MSC和纖維環(huán)增殖細(xì)胞，提示CD146可能是髓核增殖細(xì)胞的特異性標(biāo)志物［13］。Sakai等［18］提取并培養(yǎng)了 C57BL/6 鼠的尾椎間盤髓核細(xì)胞，得到兩種集落群:黏附性成纖維細(xì)胞集落和球形集落;通過免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，后者大量表達(dá)Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖，而前者不表達(dá)，因此他們認(rèn)為，球形集落是髓核表型細(xì)胞;他們還發(fā)現(xiàn)，雙唾液酸神經(jīng)節(jié)苷脂(disialoganglioside 2，GD2)是與球形集落形成最為相關(guān)的表面標(biāo)志物，且發(fā)現(xiàn)GD2+細(xì)胞的前體細(xì)胞是Tie+細(xì)胞;球形集落細(xì)胞在生長過程中呈現(xiàn)出如下變化:Tie2+GD2－CD24－(T/sp)細(xì)胞、Tie2+GD2+CD24－(TG/dp)細(xì)胞、Tie2－GD2+CD24－(G/sp)細(xì)胞，最后變?yōu)?Tie2－GD2－CD24+(24/sp)細(xì)胞。目前，尋找椎間盤干細(xì)胞特異性標(biāo)志物仍是椎間盤基礎(chǔ)研究的重點(diǎn)之一。

4 培養(yǎng)基質(zhì)、椎間盤內(nèi)環(huán)境、基礎(chǔ)病因?qū)ψ甸g盤細(xì)胞增殖的影響

隨著年齡增長，髓核內(nèi)細(xì)胞不斷減少，同時(shí)Ⅱ型膠原和蛋白多糖等細(xì)胞外基質(zhì)成分也減少，而金屬蛋白酶和膠原酶等含量增加。Brisby等［17］用骨髓-MSC細(xì)胞基質(zhì)和非退化椎間盤細(xì)胞基質(zhì)培養(yǎng)退化椎間盤的細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)增加，說明MSC和椎間盤細(xì)胞產(chǎn)生的可溶性因子可以刺激退化椎間盤的修復(fù)過程［17］。He 等［19］通過滑膜源性干細(xì)胞獲得其細(xì)胞外基質(zhì)，將髓核細(xì)胞在此基質(zhì)中培養(yǎng)，然后與無基質(zhì)培養(yǎng)的髓核細(xì)胞進(jìn)行比較，前者的擴(kuò)增分化的能力顯著強(qiáng)于后者;將在無基質(zhì)環(huán)境下傳代5次后的髓核細(xì)胞移到細(xì)胞外基質(zhì)中進(jìn)行第6次傳代，發(fā)現(xiàn)其增殖和分化能力也提高了，說明已退化的椎間盤細(xì)胞在合適的基質(zhì)中可恢復(fù)再生能力。

由于椎間盤內(nèi)高滲、低糖、低pH值、高機(jī)械壓力，植入椎間盤內(nèi)的干細(xì)胞在短期內(nèi)減少或死亡，更不能有效增殖與分化。Wuertz等［4］從不同年齡鼠中提取骨髓MSC，然后分別置于與椎間盤內(nèi)糖含量、滲透壓、pH值相同的環(huán)境下，發(fā)現(xiàn)在與椎間盤相同的低糖環(huán)境下，蛋白聚糖和膠原蛋白Ⅰ等生成增加，細(xì)胞也有少量擴(kuò)增;但在與椎間盤相同的高滲環(huán)境和低pH環(huán)境以及三者都同的環(huán)境下，基質(zhì)和細(xì)胞擴(kuò)增都減少。Liang等［20］在對(duì)脂肪性源性MSC的研究中也得到了類似的結(jié)論。Li等［5］證實(shí)了在缺氧條件下，SD大鼠髓核MSC和骨髓MSC的活性及增殖能力減弱，但分化為軟骨的能力增強(qiáng)。整體來說，髓核MSC比骨髓MSC更能耐受低氧環(huán)境。Tao等［6］將髓核細(xì)胞、髓核MSC在高滲環(huán)境下共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)高滲環(huán)境抑制了細(xì)胞活性、增殖及分化，減少了基質(zhì)的合成，但不影響凋亡率。因此，髓核-MSCs和髓核細(xì)胞共培養(yǎng)有望應(yīng)用于椎間盤退化相關(guān)疾病的治療。

此外，衰老、缺乏運(yùn)動(dòng)、遺傳等基礎(chǔ)病因也會(huì)導(dǎo)致椎間盤細(xì)胞增殖、分化能力的降低。Yasen等［21］從基因和蛋白表達(dá)層面上證實(shí)，兔椎間盤內(nèi)增殖細(xì)胞和干細(xì)胞數(shù)量均隨年齡的增長而呈降低趨勢(shì)，椎間盤退變可能與椎間盤內(nèi)增殖細(xì)胞和干細(xì)胞的減少相關(guān)。Sasaki等［22］通過對(duì)比運(yùn)動(dòng)組大鼠和對(duì)照組大鼠腰椎間盤細(xì)胞的擴(kuò)增情況發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)組大鼠的腰椎間盤細(xì)胞在干細(xì)胞龕、纖維環(huán)內(nèi)部和外圍及骺軟骨的外圍區(qū)域均出現(xiàn)不同程度擴(kuò)增，且運(yùn)動(dòng)可能對(duì)慢周期細(xì)胞和快周期細(xì)胞有促進(jìn)作用。

5 生長因子對(duì)椎間盤細(xì)胞增殖的影響

在與椎間盤內(nèi)氧含量相同的條件下，椎間盤細(xì)胞增殖速率在5 d后突然降低。體外髓核細(xì)胞不能適應(yīng)低氧環(huán)境，被認(rèn)為可能是低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia-inducible factor，HIF)無法上調(diào)。低氧條件下，相對(duì)于無基質(zhì)培養(yǎng)基，有蛋白聚糖時(shí)凋亡明顯降低，而HIF生成增加。蛋白聚糖可能是通過與轉(zhuǎn)化生長因子-β或BMP2信號(hào)系統(tǒng)相互作用而促進(jìn) HIF表達(dá)［13］。

椎間盤退化或創(chuàng)傷椎間盤細(xì)胞分泌的內(nèi)源性生長因子增加或終板破壞、血管生成等原因?qū)е峦庠葱陨L因子增加，兩者激活了ERK和Akt通路，啟動(dòng)一系列磷酸化過程，進(jìn)而使椎間盤內(nèi)細(xì)胞增殖加快。Pratsinis等［23］證實(shí)，在體外血小板衍生因子、堿性成纖維生長因子、胰島素樣生長因子-I等可以通過MEK/ERK和PI-3K/Akt通路刺激人的椎間盤細(xì)胞擴(kuò)增;同時(shí)，在模擬體內(nèi)環(huán)境中也得到了相同的結(jié)果，并且發(fā)現(xiàn)自分泌生長因子可影響細(xì)胞擴(kuò)增，并呈劑量依賴性。Sha’ban等［24］將纖維環(huán)和髓核細(xì)胞的可吸收多孔支架中加入纖維蛋白，發(fā)現(xiàn)其促進(jìn)了細(xì)胞增殖和基質(zhì)的形成。Shen等［25］發(fā)現(xiàn)，BMP-2通過轉(zhuǎn)化生長因子-β/Smad信號(hào)通路在軟骨細(xì)胞分化中起重要作用，同時(shí)還能促進(jìn)軟骨細(xì)胞基質(zhì)的生成，因此，BMP-2也被用于對(duì)椎間盤細(xì)胞分化及基質(zhì)生成等方面的研究。

6 椎間盤的外部干預(yù)

Lee等［26］研究發(fā)現(xiàn)，脈沖式電磁場(chǎng)對(duì)椎間盤細(xì)胞的擴(kuò)增有刺激作用，但對(duì)蛋白多糖的合成以及軟骨表型的表達(dá)無明顯作用。

綜上所述，本文從椎間盤細(xì)胞的起源、生長過程、干細(xì)胞龕、表面標(biāo)志物等方面對(duì)椎間盤增殖分化的研究進(jìn)行了總結(jié)，目的是探討激發(fā)椎間盤細(xì)胞自我更新及再生分化潛能的方法，從而尋求椎間盤退化相關(guān)疾病的新的治療策略。

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