免疫磁珠的原理與特性及其在動物源性食品檢測中的應(yīng)用研究

費(fèi) 楓，黃迅辰

(1.嘉興職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江嘉興314000; 2.中國計(jì)量學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院)

免疫磁珠(IMB)簡稱磁珠。免疫磁珠是通過磁場作用特異性分離目的產(chǎn)物的新興技術(shù)，具有操作簡便、靈敏度高、耗時少、生物活性強(qiáng)等特點(diǎn)，是近30年發(fā)展起來的新型免疫學(xué)分離技術(shù)，在食品微生物及其毒素、細(xì)菌分離、生化及分子遺傳學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。常用免疫磁珠是超順磁性四氧化三鐵納米磁珠，可通過特殊官能團(tuán)偶聯(lián)抗原或標(biāo)記物，結(jié)合于靶物質(zhì)，并在外加磁場作用下達(dá)到分離、純化的目的。

動物源性食品是指可食用動物的肉、乳、蛋及其制品和副產(chǎn)品。動物源性食品污染通常存在于動物飼養(yǎng)，產(chǎn)品加工、運(yùn)輸和儲存的各個環(huán)節(jié)，包括動物飼料中添加劑殘留、農(nóng)藥殘留、動物體本身的激素和病原微生物等，經(jīng)常受到加工、運(yùn)輸過程中的衛(wèi)生情況和保鮮技術(shù)的影響。

對于動物源性食品中的污染物檢測技術(shù)通常包括色譜法、質(zhì)譜法、酶聯(lián)免疫檢測法及微生物抑制法等，這些方法大都需要復(fù)雜的前處理操作，耗費(fèi)較長的檢測時間，免疫磁珠檢測技術(shù)則因檢測方便、靈敏度高、生物活性強(qiáng)等特點(diǎn)，可以作為動物源性食品污染檢測的新技術(shù)。

1 免疫磁珠的原理與特性

1.1 免疫磁珠的原理 據(jù)Sandeep Kumar V.等(2003)［1］報道，磁性微球材料的自身屬性決定磁珠的生物活性和毒性，小于100 nm 的磁珠有較大的比表面積，較高的穩(wěn)定性和擴(kuò)散性。磁性微球由磁性元素組成，如鐵、鈷、鎳及其化合物。當(dāng)磁珠粒徑小到臨界尺寸時，無磁場下磁化強(qiáng)度為0，達(dá)到超順磁狀態(tài)，同時對磁場有很高的靈敏度。

磁性微粒可偶聯(lián)高分子聚合物，進(jìn)而固定化親和吸附、離子交換吸附或疏水作用的免疫配基，形成能特異性結(jié)合的復(fù)合體免疫磁珠。通過免疫磁珠與靶物質(zhì)(病原微生物，病毒，細(xì)菌，化學(xué)物質(zhì)等)相連，在磁場作用下，將其分離，達(dá)到快速、靈敏的富集效果。

1.2 免疫磁珠的特性

1.2.1 磁珠粒徑 磁性微球粒徑均一(10－100 nm)。磁珠粒徑越小飽和磁性越小，吸附效率則越大，具有小尺寸效應(yīng)和表面效應(yīng)，呈現(xiàn)新的物理性質(zhì)。磁珠的球型結(jié)構(gòu)有均勻的成核機(jī)制，晶體穩(wěn)定并可減少不同形狀粒子間的非特異性結(jié)合。

1.2.2 磁珠表面基團(tuán) 磁性微球表面所含的活性基團(tuán)可用高分子材料進(jìn)行修飾以提高應(yīng)用能力。聚甲基丙烯酸甲脂修飾磁性微球可有效抑制磁珠濃縮而沉淀，修飾的磁珠分散性強(qiáng)，溶解能力是未修飾磁珠的25 倍;油酸修飾可改變免疫磁珠極性，增強(qiáng)其在有機(jī)溶液中的溶解性;聚乙烯亞胺修飾可使粒徑增大至80 nm，提高磁性微球與免疫配基及其目的捕獲物質(zhì)的結(jié)合效率［2］。

1.2.3 磁珠的特異性 免疫磁珠特異性強(qiáng)，其捕獲目標(biāo)物質(zhì)能力取決于免疫配基的特異性。根據(jù)磁性微球高分子材料結(jié)合的DNA、RNA、抗體、抗原、生物素等不同特異性配基，可應(yīng)用于不同分離純化。多重DNA 探針與免疫磁珠結(jié)合，可用于慢性淋巴細(xì)胞性白血病和骨髓增生異常綜合征等血液系統(tǒng)疾病檢測，RNA 固定于免疫磁珠上則可特異性分離細(xì)菌，免疫磁珠偶聯(lián)生物素可提取分離出某些生物毒素。不同濃度樣品和不同目標(biāo)物質(zhì)決定了免疫磁珠制備時不同的結(jié)合順序，主要取決于免疫配基與目標(biāo)物質(zhì)或磁性微球偶聯(lián)的順序。

1.2.4 磁珠的適用性 免疫磁珠自組的磁性微球和免疫配基均具有良好的生物活性和穩(wěn)定性，且在制備偶聯(lián)過程中對其性質(zhì)不產(chǎn)生影響。通過分離后得到的目標(biāo)物質(zhì)再結(jié)合ELISA、PCR 等現(xiàn)代檢測技術(shù)可有效實(shí)現(xiàn)物質(zhì)的精確分析。免疫磁珠制備所需設(shè)備簡單，易操作，在應(yīng)用過程中選擇性多，適用范圍廣;使用后的免疫磁珠經(jīng)洗滌后可再生，可有效保存數(shù)月后仍可重復(fù)使用。

2 免疫磁珠的制備方法

2.1 沉淀法 沉淀法是采用二價鐵和三價鐵堿化沉淀制備出四氧化三鐵。Olowe AA.等(1991)［3］研究發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)分為3 個步驟:Fe2++ 2OH－→Fe(OH)2;3Fe(OH)2+1/2O2→Fe(OH)2+2FeOOH+H2O;Fe(OH)2+2FeOOH→Fe3O4+2H2O。lida H.等(2007)［4］采用亞鐵與乙二胺沉淀或亞鐵和三價鐵混合與乙二胺沉淀，表征后生成中間產(chǎn)物γ－Fe2O3，后氧化形成Fe3O4，其粒徑大于混合沉淀制備的四氧化三鐵，且磁性強(qiáng)度更大。Shen YF.等(2009)［5］將亞鐵鹽和鐵鹽混合溶于水溶液中，滴加氨水溶液，室溫下攪拌1 h，再用聚乙二醇－4000 溶液分散黑色膠狀物，氮?dú)獗Ｗo(hù)下90℃水浴鍋攪拌30 min，洗滌干燥制備得到平均粒徑為12 nm 的納米四氧化三鐵－聚乙二醇微粒，其飽和強(qiáng)度可達(dá)到74.3 emu/g，為理論最大值的80%。

2.2 微乳液法 微乳液是由相互不溶的液體形成熱力學(xué)穩(wěn)定的分散體系，微乳液較強(qiáng)的分散能力對納米磁性微球的形成有著重要意義。微乳液表面張力小，增容能力強(qiáng)，形成水包油型(O/W)或油包水型(W/O)微乳液。磁性微球晶體的各向異性直接影響磁珠的超順磁性和阻塞溫度，當(dāng)微粒達(dá)到阻塞溫度時，即可表現(xiàn)出特有的宏觀磁體特性和純量子行為，使之成為適用的免疫磁珠。阻塞溫度取決于分子間偶極作用，而乳膠粒間的相互作用可改變自由能，因此微乳液法能制備出粒徑均一，分散性強(qiáng)的磁性微球。Vidal－Vidal J.等(2006)［6］采用環(huán)已胺和油酸作表面活性劑，形成穩(wěn)定膠狀的油胺－納米磁珠體系，其粒徑分布集中，平均為3.5 ±0.6 nm，但表面修飾的油胺容易被油酸所取代，所以生成的磁性微球純度不高。Yang HH.等(2004)［7］采用反相微乳法制備了SiO2－Fe3O4納米磁珠，用于酶的固定和免疫檢測，球型微粒的平均粒徑為53 ±4 nm，表面積為330 m2/g，SiO2形成的孔徑為1.427 cm3/g，磁飽和強(qiáng)度達(dá)到3.2 emu/g。

2.3 凝膠溶膠法 凝膠溶膠法原理是將Fe2+鹽溶液與堿混合形成凝膠網(wǎng)絡(luò)狀態(tài)，加入溫和氧化劑，通過長時間反應(yīng)，逐漸形成納米四氧化三鐵，在凝膠網(wǎng)中不聚沉納米四氧化三鐵即為單分散性的磁珠。當(dāng)納米四氧化三鐵數(shù)量增加，凝膠狀態(tài)部分溶解，可制備得到粒徑較大的磁珠。凝膠網(wǎng)網(wǎng)絡(luò)形成的濃度越大，則納米四氧化三鐵的粒徑越小。Ma M.等(2004)［8］采用凝膠溶膠法，以Fe2+鹽溶液為變量制備出7.5－416 nm 磁性微球，大于46 nm 的磁珠比吸收率隨粒徑的減小而增加，而7.5－13 nm 的磁珠具有超順磁性。

2.4 水熱法 水熱法是以水為反應(yīng)介質(zhì)，將Fe3+鹽溶液與還原劑(包括氧化石墨、堿三乙烯四胺、氫氧化鈉等)按比例混合，利用高溫高壓環(huán)境使難溶或不溶物質(zhì)溶解，反應(yīng)結(jié)晶形成納米四氧化三鐵，當(dāng)反應(yīng)溫度在130℃－250℃之間，隨著溫度升高可有效提高磁珠磁飽和強(qiáng)度。Fan R.等(2001)［9］將硫化鹽鐵、硫代硫酸鈉、氫氧化鈉混合于蒸餾水中，置高溫釜內(nèi)，140℃加熱12 h，得到粒徑為50 nm 的逆立方尖晶石結(jié)構(gòu)納米四氧化三鐵，產(chǎn)率高達(dá)90%。Yan A.等(2008)［10］采用SDS(十二烷基硫酸鈉)和PEG(聚乙二醇)混合作為表面活性劑，通過控制反應(yīng)時間、表面活性劑濃度、FeCl3濃度，制備得到15－190 nm 的磁性微球。

2.5 熱分解法 熱分解法主要通過金屬氧化物和表面活性劑混合，高溫加熱得到幾種金屬氧化物的混合物分解產(chǎn)物，這種方法制備的納米四氧化三鐵粒徑與表面活性劑、反應(yīng)溫度、鐵鹽種類有關(guān)。Hua GE.等(2003)［11］將Fe2+鹽溶于聚乙烯醇，加入氨水使之形成含F(xiàn)eOOH 等的復(fù)合物，再用100℃持續(xù)干燥12 h，最后用600℃處理得到40 nm 的納米四氧化三鐵磁珠。范娜(2007)［12］采用前驅(qū)物(Fe－(CP)2)和草酸鈉混合作為前體，600℃持續(xù)反應(yīng)，通過控制(Fe－(CP)2)用量及反應(yīng)體系(壓力、溫度等)制備了不同形狀和粒徑的納米四氧化三鐵。

3 免疫磁珠在動物源性食品病原微生物污染檢測中的研究進(jìn)展

食源性微生物是導(dǎo)致食源性疾病的根本原因，嚴(yán)重影響食品安全，因此建立食源性微生物檢測技術(shù)有著重要意義。應(yīng)用免疫磁珠技術(shù)可以從食品樣品中快速、簡便、特異性的分離出目的微生物，配合常規(guī)、標(biāo)準(zhǔn)的檢測方法，從而實(shí)現(xiàn)微生物的快速檢測。

3.1 1990年代研究進(jìn)展 20 世紀(jì)90年代，Skjerve E.等(1990)［13］研究了從食品中分離單核細(xì)胞增多性李斯特菌，從實(shí)驗(yàn)室篩選出李斯特菌，同時分離出菌體鞭毛，用粒徑大小為2.8μm 的磁珠和羊抗鼠抗體室溫下震蕩反應(yīng)形成免疫磁珠濃度105/μl PBS溶液。結(jié)果表明，李斯特菌吸附濃度同磁珠濃度和時間呈正相關(guān)，最低濃度約為1 ×102CFU/mL 至2×102CFU/mL。Patel PD.等(1991)［14］制備出磁性微球－生物素－鏈霉親和素－多克隆抗體的復(fù)合免疫磁珠，可檢測出不同食品中沙門氏菌最低濃度為105CFU/g，且將檢測時間從5 ～6 d 縮短到1 ～2 d。Olsvik O 等(1994)［15］提出免疫磁珠檢測包括細(xì)菌(大腸桿菌、沙門氏菌、志賀氏桿菌、李斯特菌、金黃色葡萄球菌、腸炎弧菌、霍亂弧菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、芽胞桿菌、沙眼衣原體、康氏立克次體等);病毒(腸道病毒、巨細(xì)胞病毒、HIV－1、傳染性胰腺壞死病毒);寄生蟲(惡性瘧原蟲、曼氏裂體吸蟲)。Goodridge L.等(1999)［16］檢 測 肉 湯 中 大 腸 桿 菌O157∶H7濃度，首先處理大腸桿菌O157∶H7制備熒光標(biāo)記噬菌體，通過組裝形成磁性微球－熒光標(biāo)記噬菌體免疫磁珠，離心分離后用流式細(xì)胞術(shù)檢測到大腸桿菌為104CFU/mL，通過改進(jìn)的熒光過濾法可檢測到大腸桿菌的最低濃度為102－103CFU/mL。

3.2 2000年來研究進(jìn)展 2000年以來，免疫磁珠技術(shù)在食源性微生物檢測領(lǐng)域取得了更多突破。Mansfield LP.等(2000)［17］用脫脂奶接種沙門氏菌進(jìn)行培養(yǎng)，用沙門氏菌特異性單克隆抗體M105 偶聯(lián)磁性微球，固定沙門氏菌。進(jìn)而用ELISA 方法進(jìn)行鑒定。相比于一般方法需要72－96 h，而此方法則能在24 h 內(nèi)完成，且最低檢測濃度為105－106CFU/mL。Kumar S.等(2005)［18］用LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)傷寒桿菌，用新西蘭大白兔免疫獲得鞭毛蛋白抗血清，交叉反應(yīng)獲得抗原，用2.8 μm 的磁性微粒，在PBS 中重懸多克隆抗體制備出多抗－免疫磁珠。通過與食品和水樣品孵育捕獲目的微生物，經(jīng)PCR 鑒定獲得的食源微生物，檢測需3－5 d，傷寒桿菌在肉類和牛奶中達(dá)106－108CFU/g，蔬菜中達(dá)102CFU/g。Jin SQ.等(2009)［19］建立基于免疫磁珠的高通量檢測系統(tǒng)，可用于檢測金黃色釀膿葡萄球菌、副溶血性弧菌、李斯特菌、沙門氏菌、志賀氏桿菌、大腸桿菌O157∶H7等。將粒徑大小為250 μm 的磁性微粒用異硫氰酸酯表面修飾，偶聯(lián)用氨基修飾的寡核苷酸，置于聚二甲基硅氧烷的微通道中，再將病原體PCR 產(chǎn)物用泵壓入微通道中與免疫磁珠混合。檢測過程靈敏度強(qiáng)，特異性高，能在30 min 內(nèi)完成，且檢測濃度按照菌屬不同達(dá)到500－6000 CFU/mL，可檢測包括牛奶、雞蛋、肉類等動物源性食品。

3.3 近幾年研究進(jìn)展 近年來，免疫磁珠在食源性微生物研究不斷升溫。Jeníková G.等(2010)［20］用免疫磁珠與沙門氏菌抗體偶聯(lián)，對濃縮后的菌體樣本進(jìn)行處理，將混合溶液用磁場分離免疫磁珠，用乙醇和蒸餾水洗滌數(shù)次除去食品殘余和其他微生物，通過PCR 鑒定獲得腸桿菌科中有4 種是非沙門氏菌，有17 種是沙門氏菌。同時將免疫磁珠法與普通離心法對比，免疫磁珠法可將食品中沙門氏菌檢測時間縮短到24 h 以內(nèi)，快速完成，且可應(yīng)用于低濃度和菌體種類復(fù)雜的食品樣品中。Diler E.等(2011)［21］提出溶菌酶催化中心的突變點(diǎn)影響溶菌酶的催化活性，將其定點(diǎn)突變克隆后，固定在免疫磁珠上，重懸于菌液中，溶菌酶特異性識別細(xì)菌細(xì)胞壁，將細(xì)菌連接在免疫磁珠上，在磁場下將免疫磁珠分離，將細(xì)菌洗脫后進(jìn)一步分析，同時將突變的溶菌酶轉(zhuǎn)錄于酵母菌中，表達(dá)重組蛋白。這一方法能快速有效的從細(xì)胞組織中分離細(xì)菌。Wang L.等(2012)［22］用熒光納米磁珠檢測牛肉中的大腸桿菌和沙門氏菌，首先將熒光量子點(diǎn)用三氯甲烷溶解，用甲醇洗滌后干燥，然后用二氫硫辛酸脫氫酶溶液攪拌溶解，離心分離，重懸于PBS 緩沖溶液，用0.2 μm針筒過濾器得熒光量子點(diǎn)水溶液。采用間接法先用EDC 和MES 處理得到QD－EDC－蛋白A 復(fù)合物，在此基礎(chǔ)上連接抗體DSB－X 生物素。用免疫磁珠處理后作用于牛肉樣品磁場分離，可以檢測到大腸桿菌和沙門氏菌的最低濃度為10 CFU/g。Krizkova S.等(2013)［23］用鋅指蛋白雞抗修飾免疫磁珠，可高效用于富集金黃色釀膿葡萄球菌及其鋅指蛋白，得出捕獲效率與抗體濃度、離子濃度、孵育時間呈相關(guān)性，然后用SDS－PAGE 鑒定出用免疫磁珠分離的鋅指蛋白。

4 免疫磁珠在動物源性食品化學(xué)污染物檢測中的應(yīng)用進(jìn)展

目前，動物源性食品中化學(xué)污染問題嚴(yán)重，包括有機(jī)物或無機(jī)物等化學(xué)物質(zhì)，如食品添加劑，重金屬污染，農(nóng)藥殘留，水體污染等。免疫磁珠分離法在化學(xué)污染物的檢測中已得到較好的應(yīng)用。

4.1 動物源性食品中添加劑檢測 鹽酸克倫特羅俗稱“瘦肉精”，為提高瘦肉率添加于豬飼料中。李超輝等(2013)［24］制備180 nm 納米磁珠－鏈霉親和素－生物素化抗體的免疫磁珠，其中抗體偶聯(lián)量為77.2 μg/mg，用于捕獲豬肉勻漿中的克倫特羅，洗脫后用ELISA 方法檢測，免疫磁珠有較大的回收效率。干寧等(2009)［25］用合成的三聚氰胺抗體－納米磁珠－氯代鄰菲噦啉雙核銅配合物免疫磁珠固定于絲網(wǎng)印刷電極(SPCE)表面，構(gòu)建了一種測定牛奶中三聚氰胺含量的安培免疫傳感器，能檢測的最低濃度為0.25 ng/mL，且檢測時間小于20 min。

4.2 動物源食品中毒素檢測 肉毒神經(jīng)毒素具有很強(qiáng)的毒性，比氰化物毒性高1000 億倍，由厭氧菌產(chǎn)生在食品中殘留。Singh BR.等(2000)［26］將抗肉毒神經(jīng)毒素抗體共價結(jié)合于納米磁珠上，作用于牛奶樣品中捕獲肉毒神經(jīng)毒素重鏈，無需受其酶活性影響，避免其內(nèi)源性蛋白酶和肽酶的作用，能檢測出的最低濃度遠(yuǎn)低于正常人攝入量70 μg。金黃色釀膿葡萄球菌能產(chǎn)生約50 種具有廣泛生物活性的毒力因子，其中有21 種已知腸毒素(SEA)，其生物活性、酶活性、抗原活性類似，能引發(fā)人體腸道炎和過敏反應(yīng)。Rasooly R.等(2012)［27］用葡萄球菌腸毒素抗體偶聯(lián)免疫磁珠捕獲食品中毒素，洗脫后通過細(xì)胞中腫瘤壞死因子定量表達(dá)檢測葡萄球菌腸毒素的生物活性。Pauly D.等(2009)［28］用2.8 mm 的磁珠偶聯(lián)單克隆抗體和多克隆抗體制備出高通量檢測蓖麻毒素、相思豆毒素、肉毒神經(jīng)毒素、葡萄球菌腸毒素B 的免疫磁珠，將捕獲靈敏度從2－546 ng/L 的最低飽和濃度線提高到每500 mL 樣品檢出濃度為0.3－ 85 ng/L，能檢測牛奶、嬰兒食品和酸奶等食品。

4.3 動物源性食品中農(nóng)藥殘留檢測 食品或水體等周圍環(huán)境中農(nóng)藥殘留一直是很受關(guān)注的問題，檢測方法手段主要包括放射免疫分析、酶免疫分析、熒光免疫技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附分析法、生物傳感器等。目前免疫磁珠檢測農(nóng)藥的研究較少，一般同生物傳感器結(jié)合進(jìn)行農(nóng)藥殘留檢測。莠去津是一種農(nóng)藥除草劑，易被根系吸收，殘留在植物體內(nèi)被畜禽攝入，Byzova NA.等(2010)［29］將30 nm 磁珠偶聯(lián)抗莠去津單克隆抗體，可以在10 min 內(nèi)檢測出莠去津最低濃度為130 ng/mL。

5 結(jié) 語

免疫磁珠檢測技術(shù)效率比一般方法提高6－8倍，對于動物源性食品檢測有著重要意義，可以達(dá)到現(xiàn)場檢測的目的。

但是，目前免疫磁珠技術(shù)還尚未十分成熟，成型商業(yè)化的免疫磁珠檢測技術(shù)、檢測試紙、檢測卡等甚少，隨著更多的檢測特異性指標(biāo)的免疫磁珠開發(fā)，免疫磁珠檢測將在動物源性食品的安全控制領(lǐng)域，將可能得到更為廣泛的應(yīng)用。

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