常規(guī)受精失敗行早期補(bǔ)救ICSI中透明帶結(jié)合精子的選擇性應(yīng)用（附2例報(bào)道及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)）

徐鴻毅 羅清炳 陳 娟 張 穎 張 鑫 張昌軍

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（十堰 44200）

·短篇報(bào)道·

常規(guī)受精失敗行早期補(bǔ)救ICSI中透明帶結(jié)合精子的選擇性應(yīng)用（附2例報(bào)道及文獻(xiàn)復(fù)習(xí)）

徐鴻毅 羅清炳 陳 娟 張 穎 張 鑫 張昌軍*

湖北醫(yī)藥學(xué)院附屬人民醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心（十堰 44200）

自卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射（Intracytoplasmic Sperm Injection, ICSI）應(yīng)用于輔助生殖技術(shù)獲得成功妊娠以來(lái)，ICSI技術(shù)已經(jīng)從單純男性精子的因素推廣到治療免疫性因素、體外受精失敗等因素導(dǎo)致的不孕。近年來(lái),體外常規(guī)受精失敗患者的卵母細(xì)胞由隔夜行補(bǔ)救ICSI逐步改進(jìn)到短時(shí)補(bǔ)救，很多報(bào)道[1-3]已經(jīng)證實(shí)通過(guò)短時(shí)受精判斷受精與否, 再行補(bǔ)救 ICSI，獲得了良好的妊娠結(jié)局。在此基礎(chǔ)上我們對(duì)常規(guī)受精失敗中行早期補(bǔ)救ICSI時(shí)選擇卵母細(xì)胞透明帶（zona pellucida, ZP）上黏附的精子行ICSI，現(xiàn)報(bào)道2例如下。

臨床資料

一、病例1

患者，女，35歲，月經(jīng)規(guī)律，結(jié)婚9年未避孕未孕，2012年3月來(lái)我院就診， 輸卵管造影檢查雙側(cè)輸卵管梗阻，B超檢測(cè)示卵泡發(fā)育不良，男方精液檢查診斷為輕度弱精子癥。夫婦染色體檢查正常。標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)方案黃體期降調(diào)節(jié)超促排卵,于前一月經(jīng)周期黃體中期D23應(yīng)用曲普瑞林（gonadotropin releasing hormone agonist，GnRH-a）（德國(guó)輝凌公司生產(chǎn)，3.75mg/支）0.1mg皮下注射，月經(jīng)第11天同時(shí)開(kāi)始給予促卵泡激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）（瑞士雪蘭諾公司生產(chǎn)，75 IU/支）225 IU/ 支×12d，停用FSH當(dāng)日，A 型子宮內(nèi)膜，厚度為10.3mm，卵泡直徑大于18 mm（5個(gè)），人絨毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotrophin，hCG）（珠海麗珠公司生產(chǎn)，5 000 IU/支） 注射5 000～1 000 IU，取卵日男方精液檢查：密度為82×106條精子/mL，精子活動(dòng)率為68%： a級(jí)12%，b級(jí)26%，c級(jí)30%，d級(jí)32%；患者手術(shù)獲卵10只，卵冠丘分散度適中，常規(guī)授精，加精密度調(diào)整為每個(gè)卵子周?chē)s10～15萬(wàn)條精子，加精5h后拆除卵周顆粒細(xì)胞觀察8枚MII期卵母細(xì)胞第二極體均未排出，1枚為MI期卵子，半小時(shí)后觀察成熟卵子仍未變化，即行補(bǔ)救ICSI，ICSI時(shí)選取成熟卵母細(xì)胞上黏附精子，16 h后觀察原核，形成7個(gè)2PN，繼續(xù)培養(yǎng)后獲胚胎7枚，根據(jù)Ziebe等[4]進(jìn)行胚胎形態(tài)學(xué)評(píng)分，Ⅰ級(jí)胚胎2枚，Ⅱ級(jí)胚胎1枚，Ⅲ級(jí)胚胎1枚，Ⅳ級(jí)胚胎3枚，移植兩枚Ⅰ級(jí)胚胎，余3枚行玻璃化冷凍。移植后14 d 驗(yàn)?zāi)?hCG 為陽(yáng)性，移植4周后B超顯示見(jiàn)宮內(nèi)單胎妊娠,監(jiān)測(cè)中胎心正常，目前已分娩 1個(gè)正常女?huà)搿?/p>

二、病例2

患者，女，25 歲，結(jié)婚4年未避孕未孕，月經(jīng)規(guī)律。2010年在外院檢查輸卵管造影檢查雙側(cè)輸卵管粘連，行雙側(cè)輸卵管疏通術(shù)，仍未孕，于2013年5月來(lái)我中心行體外受精-胚胎移植（IVF-ET）治療，輸卵管造影顯示輸卵管通暢，盆腔粘連，B超檢測(cè)排卵正常，男方精液檢查診斷為中度弱精子癥，夫婦染色體檢查正常。標(biāo)準(zhǔn)長(zhǎng)方案黃體期降調(diào)節(jié)超促排卵，于前一月經(jīng)周期黃體中期D23應(yīng)用GnRH-a，0.1mg皮下注射，月經(jīng)第5天同時(shí)開(kāi)始給予FSH 125 IU/ 支×9d，停用促性腺激素（Gn）當(dāng)日，子宮內(nèi)膜顯示不均，平均厚度為16mm，卵泡直徑大于 18 mm（4個(gè)），hCG 注射1 000 IU，取卵當(dāng)天男方精液檢查密度4 ×106條精子/mL，精子活動(dòng)率為53%： a級(jí)0%，b級(jí)23 %，c級(jí)30 %，d級(jí)47 %；獲卵14只，卵冠丘分散度適中，常規(guī)授精，加精密度調(diào)整為每個(gè)卵子周?chē)s10～15 萬(wàn)條精子，加精5.5h后拆除卵周顆粒細(xì)胞觀察11枚MⅡ期卵母細(xì)胞第二極體均未排出，3枚未成熟，觀察每個(gè)未成熟卵母細(xì)胞透明帶黏附有5～10條精子，半小時(shí)后觀察成熟卵母細(xì)胞極體仍未排除，即行補(bǔ)救ICSI，ICSI選取未成熟卵母細(xì)胞上黏附精子，14～16h觀察原核情況，9枚為2PN，繼續(xù)培養(yǎng)后獲Ⅰ級(jí)胚胎2枚，Ⅱ級(jí)胚胎1枚，Ⅲ級(jí)胚胎3枚，Ⅳ級(jí)胚胎枚，移植兩枚Ⅰ級(jí)胚胎，余4枚行囊胚培養(yǎng)，形成兩枚囊胚評(píng)分均為4BB，囊胚行玻璃化冷凍。胚胎移植后14d 驗(yàn)?zāi)?hCG 為陽(yáng)性，移植后4周B超見(jiàn)宮內(nèi)單孕囊，目前已分娩 1個(gè) 正常男嬰。

討 論

ICSI技術(shù)主要用于少、弱、畸形精子癥造成的受精力低下、受精障礙以及梗阻性無(wú)精子癥患者的輔助生殖治療。輔助生殖技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展，為我們提供了較理想的促排卵方案，足以使我們獲得所需要的成熟卵母細(xì)胞，但在每個(gè)實(shí)驗(yàn)室?guī)缀醵疾豢杀苊獾娜匀话l(fā)生一定比例的卵母細(xì)胞受精障礙現(xiàn)象，目前在常規(guī)受精過(guò)程中卵子受精失敗發(fā)生率約 5%～15%[5]。對(duì)于受精障礙的卵母細(xì)胞我們采用補(bǔ)救性ICSI，從原來(lái)的18～20h縮短到6～8h[1-3,6]，這為防止卵母細(xì)胞提前老化贏得了時(shí)間，使有限的卵母細(xì)胞控制在受精窗內(nèi)，取得了一定的效果。由于女性患者卵子數(shù)量有限，從體內(nèi)取出后質(zhì)量也無(wú)從改變，因此尋找潛在提高妊娠空間的方法應(yīng)從選擇精子的角度考慮。

在體外常規(guī)受精中精子數(shù)量達(dá)到一定的標(biāo)準(zhǔn)才能實(shí)施常規(guī)受精，加精后的精子數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于因嚴(yán)重少精子癥行ICSI的精子，在受精障礙補(bǔ)救ICSI中我們所使用的精子是由實(shí)驗(yàn)技術(shù)人員用當(dāng)天常規(guī)授精后剩余的精子，從數(shù)千萬(wàn)精子中挑選理想的精子是比較困難的事情，并且用肉眼在低倍顯微鏡下人為主觀地挑選，這樣更難鑒別出精子有無(wú)缺陷，也失去了卵子與精子之間的自然選擇。早在1997年Garrett等[7]觀察到，在IVF治療過(guò)程中, 通過(guò)對(duì)與ZP結(jié)合的精子形態(tài)進(jìn)行檢查,結(jié)果顯示和卵細(xì)胞ZP結(jié)合精子比普通用于受精的精子在形態(tài)上更好。Black等[8]也認(rèn)為精-卵透明帶理想狀態(tài)的結(jié)合對(duì)受精的完成十分重要, 凡是結(jié)合到透明帶上的精子大部分都是形態(tài)正常的。另有報(bào)道不孕患者在直接行ICSI治療時(shí)使用了未成熟卵ZP上穿越的精子行ICSI能取得較好的妊娠率[9]。

在受精障礙補(bǔ)行ICSI中，精子從優(yōu)化到ICSI實(shí)施需要6～8h，研究報(bào)道精子過(guò)長(zhǎng)時(shí)間孵育也會(huì)產(chǎn)生一些代謝產(chǎn)物，其中活性氧水平過(guò)高就會(huì)對(duì)精子產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化和DNA氧化損傷[10,11]，可能影響其獲能、受精[12]，而培養(yǎng)液中活性氧增多也可以使胚胎碎片增多[13]，在傳統(tǒng)受精障礙補(bǔ)行ICSI 使用的是剩余的、已在體外孵育過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的精子，部分精子死亡產(chǎn)生的代謝物也可能會(huì)對(duì)其他精子帶來(lái)不利的影響。研究報(bào)道卵子顆粒細(xì)胞可以產(chǎn)生抗氧化物質(zhì)[14]，在精卵混合液滴中的精子特別是結(jié)合在透明帶上的精子周?chē)€存在未剝離的顆粒細(xì)胞，在顆粒細(xì)胞的環(huán)境下可能會(huì)因抗氧化物質(zhì)的作用使精子的氧化損傷更小，因此在受精障礙卵母細(xì)胞補(bǔ)救性ICSI時(shí)，使用透明帶上結(jié)合的精子可能是一種理想的選擇，本文2例中分別用成熟卵母細(xì)胞和未成熟卵母細(xì)胞結(jié)合的精子均獲得了妊娠，可說(shuō)明選擇卵母細(xì)胞成熟度不影響透明帶所黏附的精子質(zhì)量。

由于這種方法在技術(shù)上較常規(guī)挑選精子耗時(shí)，且去除顆粒細(xì)胞后并非所有卵母細(xì)胞透明帶上均黏附有精子，這需要技術(shù)人員的經(jīng)驗(yàn)和操作手法，結(jié)局是否優(yōu)于常規(guī)選擇的精子還需要增加樣本量證實(shí)。但根據(jù)文獻(xiàn)和精子的自然選擇結(jié)果，這種方法不失為早期補(bǔ)救性ICSI進(jìn)一步改進(jìn)提供了一種新的思路。

透明帶; 精子; 精子注射, 細(xì)胞質(zhì)內(nèi)

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（2014-09-30收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.12.016

R 321-33

*通訊作者, E-mail: sycjzhang@sohu.com