天然免疫分子抗菌肽的作用機(jī)制和臨床應(yīng)用

安泰，徐瑜，陳博，鄭鑫，林海龍

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天然免疫分子抗菌肽的作用機(jī)制和臨床應(yīng)用

安泰，徐瑜，陳博，鄭鑫，林海龍

102209 北京，中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司

抗生素的發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為是醫(yī)學(xué)史上最偉大的成就之一，在感染性疾病臨床治療中曾經(jīng)給患者帶來福音。但近年來，隨著抗生素在各領(lǐng)域的濫用，細(xì)菌耐藥已成為全球公共健康領(lǐng)域面臨的嚴(yán)峻問題，因此人們一直試圖通過新的手段或者可替代的藥物來解決抗生素耐藥性問題?！疤烊豢股亍笨咕模╝ntimicrobial peptides，AMPs）被認(rèn)為是先天免疫系統(tǒng)中非常重要的一類物質(zhì)，它的發(fā)現(xiàn)與應(yīng)用將為未來解決此問題提供潛在的可能。到目前為止，多達(dá) 5000 種抗菌肽已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)或合成[1]。天然的抗菌肽廣泛分布在原核生物（如細(xì)菌）和真核生物（如原生動物、真菌、植物、昆蟲和其他動物）中。對于動物來說，抗菌肽主要分布在暴露于接觸病原體的組織和器官表面上，并且被認(rèn)為是抵抗細(xì)菌、病毒和真菌的先天免疫反應(yīng)的第一道防線[2-3]?；谝陨咸匦裕咕脑卺t(yī)藥和農(nóng)業(yè)方面有著廣闊的應(yīng)用前景。本文結(jié)合國內(nèi)外抗菌肽的最新研究進(jìn)展，從抗菌肽的理化性質(zhì)、抑菌和免疫機(jī)制以及臨床研究等方面進(jìn)行論述，為抗菌肽的研發(fā)和應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 理化性質(zhì)及抑菌機(jī)制

抗菌肽是由約 100 個氨基酸組成的小分子短肽，不同的氨基酸序列組成使抗菌肽呈現(xiàn)出特定的結(jié)構(gòu)特征和不同的理化性質(zhì)，形成一種低抗原活性的免疫防御機(jī)制。這類帶正電荷極性和疏水性殘基較多的兩性短肽分子可以很好地與微生物膜表面磷脂進(jìn)行非特異性相互作用[4-5]，這種短時間與微生物的相互作用可以使微生物快速死亡，并且耐藥菌株的產(chǎn)生大大降低。按結(jié)構(gòu)差異，抗菌肽可以分為三類：α-螺旋類（如天蠶素）、富含半胱氨酸類和 β-片層類（如防御素）。通常組氨酸、精氨酸、脯氨酸和色氨酸是抗菌肽中含量較高的幾種氨基酸[6]。

研究發(fā)現(xiàn)，抗菌肽對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌具有很強(qiáng)的抑菌效應(yīng)，并對真菌、原生動物以及具有包膜的人類免疫缺陷病毒和皰疹病毒也有防御作用[7]。其機(jī)制是通過特殊的理化性質(zhì)破壞和滲透入細(xì)胞膜表面，達(dá)到殺死細(xì)菌的作用，其穿透膜表面的能力與抑菌能力是直接相關(guān)的。這些特殊的理化性質(zhì)包括肽的二級結(jié)構(gòu)、靜電荷、兩親性、疏水性和肽的大小等[6-8]?？咕膶?xì)胞膜表面的破壞主要通過磷脂雙分子層形成孔道使細(xì)胞膜破裂，還有研究發(fā)現(xiàn)抗菌肽利用其與核酸和蛋白的結(jié)合能力與病原體胞內(nèi)的特定靶點發(fā)生相互作用[9-10]?？咕脑隗w外試驗中對微生物的最小抑菌濃度往往高于其在生理狀態(tài)下的抑菌濃度?？咕娜绾卧隗w內(nèi)能以較低的濃度產(chǎn)生抗菌作用，一種解釋是抗菌肽可以產(chǎn)生協(xié)同抗菌作用；而另一種更被認(rèn)同的解釋是抗菌肽通過一種間接的方式保護(hù)宿主而非簡單的殺菌作用，這就是抗菌肽的免疫調(diào)節(jié)功能。

2 調(diào)節(jié)宿主免疫反應(yīng)

抗菌肽是生物在長期進(jìn)化過程中為適應(yīng)環(huán)境而產(chǎn)生的免疫分子。當(dāng)宿主受到病原微生物感染后，處于感染或受損部位的細(xì)胞會釋放抗菌肽進(jìn)行抵抗?？咕某四軌蛞种莆⑸锏纳L增殖，還能作為免疫效應(yīng)分子，直接招募淋巴細(xì)胞或介導(dǎo)趨化因子和細(xì)胞因子的表達(dá)，從而間接提高效應(yīng)細(xì)胞如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、未成熟樹突狀細(xì)胞和 T 淋巴細(xì)胞等的招募能力。因此，抗菌肽對宿主免疫反應(yīng)調(diào)節(jié)起重要作用。如在無脊椎動物和脊椎動物中存在的抗菌肽 cathelicidin，由于其在人體內(nèi)編碼一個 18 kD 大小的非活性前體蛋白，因此被命名為 hCAP18。在人中性粒細(xì)胞中，hCAP18 被加工成由 37 個氨基酸殘基組成且 N 端含有 2 個亮氨酸的 α-螺旋陽離子肽，被稱為 LL-37。LL-37 在中性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞以及皮膚、內(nèi)臟、腺體和附睪的上皮細(xì)胞中均有表達(dá)[11]。當(dāng)宿主感染病原微生物或機(jī)體受損時，cathelicidin 能夠直接作為免疫細(xì)胞的趨化因子，募集其到感染部位，從而發(fā)揮抗感染的作用[12]。此外，LL-37 還可通過調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞釋放趨化因子和細(xì)胞因子，從而間接產(chǎn)生趨化作用[13]。例如，LL-37 可以促進(jìn)人外周血單核細(xì)胞分泌大量的 IL-1β，從而間接介導(dǎo) IL-6 和 IL-10、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）和單核細(xì)胞趨化蛋白-3（MCP-3）的表達(dá)[14]。

防御素是一組抗菌肽，體外實驗表明其在機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)過程中發(fā)揮重要作用。根據(jù)保守區(qū)半胱氨酸和二硫鍵的位置不同，哺乳動物防御素可以分為三個亞家族，即α-防御素、β-防御素和 θ-防御素[15]。α-防御素分子鏈內(nèi)的6 個半胱氨酸的連接位置分別為 Cys1-Cys6、Cys2-Cys4、Cys3-Cys5。β-防御素分子鏈內(nèi)半胱氨酸的連接順序為 Cys1-Cys5、Cys2- Cys4、Cys3-Cys6。θ-防御素的結(jié)構(gòu)不同于前兩者，會形成一個沒有 N 端和 C 端的環(huán)狀結(jié)構(gòu)[16]。防御素在機(jī)體內(nèi)主要起趨化作用，人 α-防御素 1 和人α-防御素 2可以募集單核細(xì)胞至炎癥部位，發(fā)揮其免疫功能[17]；人 β-防御素 3 和人 β-防御素 4 是單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的趨化因子[18]，人 β-防御素 2 是肥大細(xì)胞的趨化因子[19]。人 α-防御素和人 β-防御素對 T 淋巴細(xì)胞及未成熟樹突狀細(xì)胞有趨化作用，此趨化作用可被 CCR6 抗體抑制，提示防御素的趨化作用機(jī)制可能是通過其與 G 蛋白偶聯(lián)受體 CCR6 的相互作用而實現(xiàn)的。防御素同樣可以通過介導(dǎo)免疫細(xì)胞分泌趨化因子和細(xì)胞因子，從而間接產(chǎn)生趨化作用。例如，人 β-防御素 3 通過與單核細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞上 TLR1 和 TLR2 的相互作用，介導(dǎo) CD80、CD86 和 CD40 的表達(dá)，從而激活 MyD88 信號通路，使 IL-1 受體相關(guān)激酶磷酸化[20]。在人角化細(xì)胞中，人 β-防御素 2、人 β-防御素 3 和人 β-防御素 4 以及 LL-37 可以介導(dǎo) ERK1/2 和 p38 MAPK 信號通路的磷酸化，ERK1/2 的激活會導(dǎo)致下游轉(zhuǎn)錄因子 Elk-1 的激活，增加 IL-18 的分泌，使 T 淋巴細(xì)胞、B 淋巴細(xì)胞和 TK 細(xì)胞能夠過表達(dá)干擾素-γ，增加 CD4+T 淋巴細(xì)胞中 IgE 的表達(dá)，放大免疫反應(yīng)[21]。

綜上所述，cathelicidin 和防御素調(diào)節(jié)機(jī)體免疫應(yīng)答的方式是直接作為抗菌物質(zhì)被機(jī)體釋放發(fā)揮抗菌作用、自身作為趨化因子進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)或者通過介導(dǎo)免疫細(xì)胞釋放細(xì)胞因子而間接發(fā)揮趨化作用。

3 抗菌肽與疾病

目前研究證明抗菌肽作為一種具有多種免疫效應(yīng)的物質(zhì)，在疾病的發(fā)生和發(fā)展過程中具有至關(guān)重要的作用。

dermcidin 1 是一種體表汗腺持續(xù)分泌的天然抗菌肽[22]，在特應(yīng)性皮炎患者的皮損組織中發(fā)現(xiàn) dermcidin 1 表達(dá)水平與正常人相比顯著降低，這些患者缺失該抗菌肽的免疫屏障導(dǎo)致其與正常人群相比更易受到微生物的感染。

另外，患有播散性神經(jīng)性皮炎的患者易感染金黃色葡萄球菌，這些患者的人β-防御素 2、人 β-防御素 3 以及 cathelicidin LL-37 的表達(dá)水平顯著下降[23]。

在正常皮膚表面，LL-37 會行使正常的生理功能，然而，LL-37 的異常高水平表達(dá)會引起紅斑痤瘡的發(fā)生，同時，在這些患者中發(fā)現(xiàn) LL-37 的剪切加工過程也與正常人存在差異，提示該疾病的發(fā)生機(jī)制可能與 LL-37 翻譯后修飾過程的異常有關(guān)[24]。

銀屑病是一種常見的慢性炎癥性皮膚病，其發(fā)生機(jī)制與自身反應(yīng)性 T 細(xì)胞的局部活化及表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的異常增殖分化密切相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)銀屑病皮損表面 cathelicidin 的表達(dá)水平異常升高，正常情況下，細(xì)胞凋亡產(chǎn)生的 DNA/RNA 可被自身降解，并不引起炎癥反應(yīng)，然而在銀屑病患者皮損部位大量表達(dá)的 LL-37 可以破壞機(jī)體對自身 DNA/RNA 的天然免疫耐受，LL-37 與之形成復(fù)合物，該復(fù)合物會被轉(zhuǎn)運(yùn)至漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞，激活 TLR-9 并誘導(dǎo)干擾素-α 的產(chǎn)生，從而引起銀屑病的發(fā)生[25]。

LL-37、人 α-防御素和人 β-防御素以及 histatin 等抗菌肽作為口腔中對病原體的第一道防線也起著十分重要作用。而這幾種抗菌肽的異常表達(dá)會導(dǎo)致各種口腔疾病的發(fā)生，例如人 β-防御素基因的單核苷酸多態(tài)性會導(dǎo)致患有 I 型糖尿病的患者口腔中白色念球菌高于對照組[26]，而在口腔中 LL-37 的缺乏也會導(dǎo)致患有科斯特曼?。∕orbus-Kostmann）的患者口腔細(xì)菌感染和牙周系統(tǒng)疾病發(fā)病頻率增高[27]。另外有研究發(fā)現(xiàn)，口腔中人中性粒細(xì)胞多肽表達(dá)較高的兒童患有齲齒的可能性較低，這些發(fā)現(xiàn)提示正常的抗菌肽濃度對于控制口腔細(xì)菌生長有重要作用[28]。

正常人的腸道中抗菌肽與腸道微生物之間是保持平衡的，然而在克羅恩?。–rohn’s disease）的患者當(dāng)中，由于人 β-防御素 2、人 β-防御素 3 和人 β-防御素 4 的表達(dá)水平不足，導(dǎo)致微生物可以侵入腸黏膜，從而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生。此外，一些研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)患者人 β-防御素 2 基因拷貝數(shù)低于 4 個時，腸黏膜中人 β-防御素 2 mRNA 水平將隨之降低，提示防御素基因拷貝數(shù)的變化可能會影響個體對于感染的耐受水平，并且由于人 β-防御素 3 和人 β-防御素 4 的基因也位于相同的基因座位上，提示這兩個基因可能也是由于類似的機(jī)制導(dǎo)致表達(dá)水平降低[29]。

4 抗菌肽的應(yīng)用前景

到目前為止，已發(fā)現(xiàn)的抗菌肽高達(dá)上千種，其中數(shù)十種處在臨床前或臨床試驗階段。此外，有一些抗菌肽在臨床應(yīng)用中已取得了良好的療效，且未發(fā)現(xiàn)明顯的副作用。由此可見，抗菌肽是具有發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕幬铮某霈F(xiàn)將帶來抗生素治療領(lǐng)域的變革。

培西加南（pexiganan）是一個由 22 個氨基酸構(gòu)成的爪蟾蛙皮素類似物，該多肽藥物對治療糖尿病引起的足壞疽感染十分有效。Genaera 公司在美國已完成培西加南治療糖尿病足壞疽的 III 期臨床試驗，結(jié)果顯示局部使用培西加南軟膏與口服氧氟沙星相比，對于輕度糖尿病足壞疽的患者治療效果沒有明顯差異，而相比于喹諾酮類抗生素，培西加南的不良反應(yīng)較低。培西加南的作用機(jī)制可能與其可以同時抑制革蘭陽性菌和革蘭陰性菌感染有關(guān)[30]。

Novozyme 公司研發(fā)的抗菌肽菌絲霉素是從真菌中分離得到的一種防御素家族抗菌肽。2008 年，Novozyme 公司和 Sanofi-Aventis 公司簽署了一份全球許可轉(zhuǎn)讓和合作協(xié)議，以開發(fā)和銷售菌絲霉素NZ2114。研究發(fā)現(xiàn)，在動物模型中該抗菌肽對葡萄球菌引起的心內(nèi)膜炎有較好的療效[31]。

MU1140 是從口腔中生長的細(xì)菌中分離得到的羊毛硫氨酸抗菌肽。研究發(fā)現(xiàn)，MU1140 對處于活動期和休眠期的結(jié)核分枝桿菌均有良好的作用，相比于傳統(tǒng)的抗結(jié)核藥物，其不良反應(yīng)較輕且不易產(chǎn)生耐藥性，未來可能成為治療肺結(jié)核的有效藥物。此外，有研究表明 MU1140 對耐甲氧西林金黃色葡萄球菌和炭疽桿菌同樣有著良好的作用。但 MU1140 的表達(dá)量較低，Oragenics 公司采用一種新技術(shù)以獲得足夠用于前期臨床研究的抗菌肽。2012 年，Oragenics 公司與 Intrexon 公司合作共同生產(chǎn)和開發(fā) MU1140 和其他羊毛硫酸抗菌肽。盡管 Oragenics 公司尚未對 MU1140 進(jìn)行研究性新藥申請，但是 MU1140 作為抗菌新藥的前景還是較為明朗的[32]。

足部的真菌感染影響著全球 12% 的人口，一般的治療策略為應(yīng)用外用抗真菌軟膏、口服深部抗真菌藥物或者激光治療，以上治療策略存在治療效果差、毒副作用高以及價格昂貴等問題。novexatin 是 NovaBiotics 公司基于人 α-防御素和人 β-防御素設(shè)計研發(fā)的一個環(huán)狀、高精氨酸陽離子多肽。研究發(fā)現(xiàn)，此環(huán)形多肽不僅能夠提高抗真菌能力，還能夠提高抗菌肽的穩(wěn)定性。2010 年，novexatin 已成功完成了 II 期臨床試驗[33]。

5 總結(jié)與展望

抗菌肽的研究雖取得了一些進(jìn)展，并在部分臨床實驗中取得了良好的效果，但仍然有一些問題亟待解決?？咕脑谂R床前體外實驗的研究中具有明顯抑菌作用，但進(jìn)入到臨床試驗中卻難以達(dá)到傳統(tǒng)抗菌藥物的治療效果，這說明抗菌肽體外和在體的抑菌效果有較大差異。此外，抗菌肽的安全性問題也應(yīng)引起重視?？咕膶ι锬さ钠颇ぷ饔?，可能會導(dǎo)致溶血現(xiàn)象。因而多數(shù)臨床應(yīng)用還僅局限在臨床前期研究，進(jìn)入臨床研究的藥物也多限制在外用藥物上。

未來通過對抗菌肽作用機(jī)制的不斷深入研究，進(jìn)一步闡明其藥理作用，提高抗菌肽的穩(wěn)定性、減少抗菌肽的毒副作用將會使其更好地應(yīng)用于臨床。同時，抗菌肽對于宿主免疫活性調(diào)節(jié)的進(jìn)一步研究與探索將會為抗菌肽在免疫疾病的臨床應(yīng)用提供明確的理論依據(jù)。更為詳實的數(shù)據(jù)與科學(xué)依據(jù)將會不斷得到判斷和評估?？傊?，抗菌肽作為抗病原微生物的天然免疫系統(tǒng)的重要組成部分，其作為新藥的價值和臨床應(yīng)用前景廣闊。

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中糧集團(tuán)應(yīng)用基礎(chǔ)研究與技術(shù)開發(fā)項目（2014-C2-F005）

林海龍，Email：linhl@cofco.com

2014-05-28

10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2014.04.014