三鄰甲苯基磷酸酯毒性作用研究進(jìn)展

(南華大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院,湖南衡陽(yáng)421001)

三鄰甲苯磷酸酯(tri-o-cresyl phosphate,TOCP)是一種有機(jī)磷酸酯類(lèi)化合物,是磷酸三甲苯酯(TCP)中鄰位、間位和對(duì)位三種同分異構(gòu)體的一種,TOCP是這三種同分異構(gòu)體中神經(jīng)毒性最強(qiáng)的化合物[1]。二十世紀(jì)工業(yè)發(fā)展時(shí)期,由于人們對(duì)有機(jī)磷類(lèi)化合物的毒性認(rèn)識(shí)不深,有機(jī)磷類(lèi)化合物作為阻燃劑、潤(rùn)滑劑、增塑劑、殺蟲(chóng)劑等而被廣泛應(yīng)用于工業(yè)、軍事、農(nóng)業(yè)等各個(gè)領(lǐng)域,造成有機(jī)磷類(lèi)化合物的嚴(yán)重污染,TOCP中毒事件在歐美各地爆發(fā)。上個(gè)世紀(jì)九十年代,中國(guó)因?yàn)槭称繁籘OCP污染而發(fā)生多起中毒事件。上個(gè)世紀(jì)因?yàn)槎嗥餞OCP中毒事件而引起社會(huì)的廣泛關(guān)注,隨著人們對(duì)毒物認(rèn)識(shí)的不斷加深而被禁止使用。二十一世紀(jì),經(jīng)濟(jì)快速發(fā)展之際,TOCP以另一種方式重新進(jìn)入人們的視線中,飛機(jī)燃油排放物和潤(rùn)滑劑中含有TOCP污染機(jī)艙,引起乘客和乘務(wù)人員出現(xiàn)神經(jīng)中毒癥狀——航空中毒癥候群。TOCP進(jìn)入機(jī)體經(jīng)微粒體酶細(xì)胞色素P450作用生成代謝活化產(chǎn)物進(jìn)一步產(chǎn)生毒性。TOCP最主要的毒性是神經(jīng)毒性,其中以遲發(fā)性神經(jīng)毒性(OPIDN)為主要特征,但其具體機(jī)制并未闡明。TOCP進(jìn)入機(jī)體后主要分布于腦、脊髓和坐骨神經(jīng),而其代謝產(chǎn)物主要分布在肝臟、腎臟和肺組織中[2]。在早期,對(duì)雞進(jìn)行TOCP染毒,Itoh[3]發(fā)現(xiàn)腦、脊髓、坐骨神經(jīng)、腎臟、心、肺、脾臟、消化系統(tǒng)均出現(xiàn)病理學(xué)改變,肝臟出現(xiàn)輕微的充血;“JAKE”事件中,部分男性出現(xiàn)性功能損害[4]。由此可見(jiàn),TOCP具有多種毒性作用,近年來(lái)對(duì)TOCP各種毒性的研究及相關(guān)機(jī)制的探索也逐漸受到重視。本文就TOCP的各種毒性研究展開(kāi)綜述。

1 神經(jīng)系統(tǒng)毒性

人體暴露于TOCP引起毒效應(yīng)最先觀察到的是神經(jīng)系統(tǒng)癥狀,而TOCP的神經(jīng)系統(tǒng)毒性分為急性毒性、慢性毒性、遲發(fā)型神經(jīng)毒性。

1.1 急性毒性

TOCP的急性中毒比較少見(jiàn),是一次性大劑量暴露TOCP數(shù)小時(shí)后由于TOCP的抗膽堿能作用而出現(xiàn)的膽堿樣中毒癥狀如：肌肉高度緊張、反射亢進(jìn)、陣攣、錐體束反射明顯受損及永久性上體位運(yùn)動(dòng)神經(jīng)綜合征等[4],癥狀在兩天內(nèi)消失。乙酰膽堿酯酶是一種包含調(diào)控結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域的絲氨酸酯酶,TOCP不可逆地共價(jià)結(jié)合催化結(jié)構(gòu)域中的絲氨酸羥基從而抑制乙酰膽堿酯酶的水解活性;乙酰膽堿是存在突觸小體中的一種神經(jīng)遞質(zhì),經(jīng)刺激釋放入突觸間隙中并刺激突觸后膜產(chǎn)生興奮,而被TOCP磷酸化的乙酰膽堿酯酶無(wú)法及時(shí)水解乙酰膽堿,乙酰膽堿酯酶抑制率達(dá)到70%以上時(shí),乙酰膽堿開(kāi)始出現(xiàn)聚集,并持續(xù)性刺激突觸后膜,從而出現(xiàn)膽堿樣急性毒性癥狀[1]。

1.2 慢性毒性

航空中毒癥候群屬于低劑量暴露TOCP而引起的慢性毒性,同樣以抗膽堿能癥狀為主。TOCP經(jīng)肝臟微粒體中的細(xì)胞色素P450氧化和催化血清白蛋白環(huán)化生成代謝產(chǎn)物CBDP,CBDP不可逆地抑制人體的丁酰膽堿酯酶和乙酰膽堿酯酶,丁酰膽堿酯酶同樣屬于絲氨酸水解酶家族,其機(jī)制與乙酰膽堿老化機(jī)制相同[5]。

1.3 遲發(fā)性神經(jīng)毒性

遲發(fā)性神經(jīng)毒性(OPIDN)是人和特定種屬暴露于TOCP后出現(xiàn)的最主要的神經(jīng)系統(tǒng)癥狀。OPIDN是機(jī)體攝入毒物后1～3周內(nèi)出現(xiàn)的一系列神經(jīng)癥狀,以遠(yuǎn)端軸突末端病變?yōu)橹饕卣鞯牟豢赡嫘酝诵行陨窠?jīng)病變,主要癥狀是周?chē)窠?jīng)和脊髓束的上行支和下行支的遠(yuǎn)端部位出現(xiàn)功能喪失和共濟(jì)失調(diào)。主要出現(xiàn)的組織病理學(xué)改變有：脊髓和坐骨神經(jīng)的軸突腫脹、降解,髓磷脂呈片段降解,繼發(fā)性脫髓鞘漸進(jìn)性增加,呈Wallerian樣變性,軸突遠(yuǎn)端病變較重,伴隨膠質(zhì)細(xì)胞增殖,坐骨神經(jīng)中滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、空泡和管狀物質(zhì)增加,有髓神經(jīng)元軸突中出現(xiàn)神經(jīng)絲和神經(jīng)微管的中度聚集等。然TOCP誘發(fā)OPIDN的具體機(jī)制并不清楚,成為研究TOCP的熱點(diǎn)問(wèn)題,不同的學(xué)說(shuō)和新的機(jī)制也在不斷的被探索與發(fā)現(xiàn)。

神經(jīng)病靶酯酶(NTE)“老化”機(jī)制被公認(rèn)為是有機(jī)磷遲發(fā)性神經(jīng)毒性發(fā)生的前提條件。有機(jī)磷類(lèi)物質(zhì)是NTE的底物類(lèi)似物,能磷酸化NTE上絲氨酸的羥基,磷酸化的NTE隨著時(shí)間進(jìn)程進(jìn)一步發(fā)生老化,即使烷基或芳基迅速被去除形成帶負(fù)電的親核物質(zhì),致使NTE的活性不可逆[6]。而NTE活性受到抑制只發(fā)生在暴露毒物后的72 h之內(nèi),之后NTE的活性逐漸恢復(fù),而OPIDN產(chǎn)生癥狀一般是第1～3周,NTE被抑制到癥狀出現(xiàn)這一過(guò)程中,NTE起什么樣的作用?

NTE調(diào)控磷脂的代謝,對(duì)軸突的維持和神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)起關(guān)鍵作用。TOCP損傷軸突的物質(zhì)獲得被認(rèn)為是軸突變性的重要原因,神經(jīng)細(xì)胞需要依賴內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和微導(dǎo)管的物質(zhì)運(yùn)輸維持軸突的功能和生長(zhǎng),NTE具有磷脂酶B和溶血磷脂酶活性,nte基因敲除證明神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分泌功能受到損傷[7],可見(jiàn)TOCP可能通過(guò)抑制NTE活性影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分泌功能導(dǎo)致軸突的變性。OPIDN軸突變性出現(xiàn)的典型的形態(tài)學(xué)改變是腫脹,nte基因敲除小鼠的脊髓遠(yuǎn)端出現(xiàn)軸突的降解,隨后腫脹,軸突內(nèi)出現(xiàn)空泡、腫脹、小泡和細(xì)胞骨架蛋白聚集等神經(jīng)變性樣特征[7]。同時(shí)也有實(shí)驗(yàn)表明,NTE缺陷型神經(jīng)細(xì)胞延遲神經(jīng)元突起生長(zhǎng),且突起長(zhǎng)度比對(duì)照組短[8]。猶太人和歐洲人出現(xiàn)的一種遺傳性痙攣性截癱和OPIDN一樣是屬于肢體運(yùn)動(dòng)神經(jīng)病,是由于NTE催化區(qū)發(fā)生突變而造成NTE失活[9]。這些都證明NTE對(duì)神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)和維持起重要作用,NTE如何調(diào)節(jié)和維持神經(jīng)細(xì)胞軸突的具體過(guò)程是TOCP產(chǎn)生OPIDN的一個(gè)關(guān)鍵機(jī)制。

細(xì)胞內(nèi)鈣紊亂和鈣相關(guān)蛋白酶活性增強(qiáng)這一機(jī)制是研究TOCP產(chǎn)生OPIDN的另一重要假說(shuō)。鈣離子是細(xì)胞內(nèi)的第二信使,參與各種信號(hào)途徑。在早期的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證明TOCP能夠引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子紊亂[10-12],發(fā)現(xiàn)L型鈣離子通道參與細(xì)胞內(nèi)鈣離子紊亂[10]。且有實(shí)驗(yàn)證明TOCP作用細(xì)胞,引起細(xì)胞內(nèi)一系列鈣相關(guān)蛋白酶如鈣中性蛋白酶(calpain)[13]、鈣依賴性蛋白激酶Ⅱ(CaMKⅡ)[14]、ERK1/2[15]、CDK5等[16]酶的活性增加。 鈣激活的蛋白酶能磷酸化神經(jīng)細(xì)胞中的神經(jīng)絲、微管蛋白及相關(guān)蛋白等,如：CaMKⅡ磷酸化MAP-2、α/β微管蛋白[17,14],被激活的Erk1和Erk2磷酸化NF-H和NF-M末端的KSP序列[15]。磷酸化的蛋白或聚集或進(jìn)入蛋白降解系統(tǒng)降解,聚集的磷酸化蛋白從而呈現(xiàn)組織病理學(xué)上的微管與微絲的中度聚集,而近年發(fā)現(xiàn)calpain蛋白酶增多與骨架蛋白降解密切相關(guān)[18,13]。且越來(lái)越多的研究證明TOCP誘導(dǎo)自噬溶酶體降解途徑增強(qiáng),自噬抑制軸突的生長(zhǎng)與維持[19]。自噬溶酶體途徑是細(xì)胞中蛋白酶降解系統(tǒng),細(xì)胞內(nèi)鈣離子變化及calpain活性變化誘導(dǎo)自噬,TOCP誘導(dǎo)OPIDN出現(xiàn)軸突退行性變性與自噬密切相關(guān)。自噬和凋亡與鈣密切相關(guān)[20-21]。TOCP誘導(dǎo)自噬成為新興的機(jī)制,但凋亡也頻頻被報(bào)道,線粒體凋亡途徑參與TOCP誘導(dǎo)OPIDN病變[22]。

2 生殖毒性

TOCP具有生殖毒性,早期 Somkuti[23-24]對(duì)TOCP雄性動(dòng)物的生殖毒性展開(kāi)了研究,睪丸與附睪均出現(xiàn)不同程度的不可逆性損傷：精子活率降低,數(shù)目下降,睪丸中神經(jīng)毒性酯酶和非特異性酯酶活性被抑制,組織切片顯示生精上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡和損傷。近年來(lái)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)隨著TOCP劑量的增加,精子生成發(fā)生障礙：曲精細(xì)管組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)紊亂,生精上皮細(xì)胞破壞和萎縮,生精細(xì)胞的數(shù)目減少等,基因沉默證明NTE受抑制降低生精干細(xì)胞的增殖[25]。NTE的活性在神經(jīng)毒性中研究較多,神經(jīng)細(xì)胞中NTE活性受抑制成為OPIDN的前提條件,同樣睪丸中NTE活性受到抑制在TOCP的生殖毒性起關(guān)鍵作用[25]。生精上皮細(xì)胞中支持細(xì)胞間的緊密連接構(gòu)成血睪屏障,為精子發(fā)生提供特定的環(huán)境,生精上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡和損傷,可見(jiàn)TOCP損傷血睪屏障,破壞精子發(fā)生的特定環(huán)境,影響精子生成。

3 肝臟毒性

肝臟是人體的代謝器官,同時(shí)也是含各種活性酶最多的器官,絕大部分外源物質(zhì)都要經(jīng)過(guò)肝臟的代謝排出體外,肝臟對(duì)外源化學(xué)物的解毒作用至關(guān)重要。TOCP經(jīng)吸收進(jìn)入肝臟生成代謝產(chǎn)物,經(jīng)糞和尿液排出體外,TOCP誘發(fā)OPIDN動(dòng)物模型中,Baron[26]研究中肝臟出現(xiàn)輕微的脂肪浸潤(rùn),Itoh[3]發(fā)現(xiàn)肝臟出現(xiàn)輕微充血,且發(fā)現(xiàn)肝臟中各種酶出現(xiàn)升高或降低,反映TOCP能夠損傷肝臟并引起肝細(xì)胞功能異常。

4 免疫毒性及其他

TOCP是脂溶性物質(zhì),能經(jīng)皮膚吸收進(jìn)入機(jī)體產(chǎn)生過(guò)敏反應(yīng),從事含有TCP增塑劑行業(yè)的工人,皮膚出現(xiàn)過(guò)敏反應(yīng)[27]。早期也有研究報(bào)道TOCP能對(duì)免疫系統(tǒng)造成損傷[28-29]。TOCP及其代謝產(chǎn)物分別于各種組織器官中,Itoh發(fā)現(xiàn)腎臟、心、肺、脾臟、消化系統(tǒng)同樣出現(xiàn)病理學(xué)改變[3],盡管相關(guān)方面的研究并未得到報(bào)道,但隨著OPIDN研究的進(jìn)行,TOCP的毒性作用必將會(huì)被不斷的揭露。

5 展 望

TOCP在上個(gè)世紀(jì)被廣泛應(yīng)用于工業(yè)和農(nóng)業(yè),但由于對(duì)其毒性的不斷了解而被禁用;二十一世紀(jì),經(jīng)濟(jì)飛速發(fā)展的時(shí)代,航空事業(yè)不斷壯大,航空中毒癥候群再次將TOCP拉上社會(huì)的焦點(diǎn)。對(duì)TOCP毒性的全面了解既是非常重要的問(wèn)題同時(shí)也是亟待解決的問(wèn)題。

目前針對(duì)TOCP毒物以預(yù)防為主,限制TOCP的含量或禁止使用。一旦中毒,沒(méi)有有效的藥物治療,只能根據(jù)臨床癥狀采取相應(yīng)的臨床措施。隨著TOCP對(duì)OPIDN機(jī)制研究的不斷深入,L-型鈣通道阻斷劑如：維拉帕米和尼莫地平能減緩TOCP引起的臨床癥狀,NTE活性抑制劑PMSF同樣可作為潛在的藥物治療TOCP中毒。TOCP毒性作用主要體現(xiàn)在神經(jīng)系統(tǒng)、肝臟、睪丸和免疫系統(tǒng),各系統(tǒng)與器官損傷程度不一,最先出現(xiàn)的臨床癥狀在神經(jīng)系統(tǒng),同時(shí)也以神經(jīng)系統(tǒng)癥狀最明顯最嚴(yán)重。目前以神經(jīng)系統(tǒng)和睪丸為主要研究靶器官,TOCP誘發(fā)OPIDN不同機(jī)制的提出促進(jìn)TOCP毒性作用的深入研究,為其他毒物的遲發(fā)型神經(jīng)毒性或神經(jīng)退行性病變等提供參考依據(jù),不同器官系統(tǒng)毒性的研究有利于更進(jìn)一步了解TOCP毒性,為T(mén)OCP毒性新機(jī)制的發(fā)現(xiàn)提供更有力證據(jù),同時(shí)TOCP毒性具體機(jī)制的進(jìn)一步闡明,促進(jìn)相應(yīng)藥物的開(kāi)發(fā)。對(duì)TOCP多毒性作用的全面了解,有利于臨床治療過(guò)程中對(duì)中毒者病情的全面把握及為患者的治療提供參考價(jià)值,同時(shí)對(duì)其他有機(jī)磷毒物研究有重要借鑒意義。

[1]Hargreaves AJ.Neurodegenerations induced by organophosphorous compounds[J].Adv Exp Med Biol,2012,724：189-204.

[2]Nomeir AA,Abou-Donia MB.Disposition of[14C]tri-o-cresyl phosphate and its metabolites in various tissues of the male cat following a single dermal application[J].Drug Metab Dispos,1984,12(6)：705-711.

[3]Itoh H,Tadokoro M,Oikawa K.Studies on the delayed neurotoxicity of organophosphorus compounds-(I)[J].J Toxicol Sci,1981,6(4)：287-300.

[4]Morgan JP,Penovich P.Jamaica ginger paralysis.Forty-seven-year follow-up[J].Arch Neurol,1978,35(8)：530-532.

[5]Carletti E,Schopfer LM,Colletier JP,et al.Reaction of cresyl saligenin phosphate,the organophosphorus agent implicated in aerotoxic syndrome,with human cholinesterases：mechanistic studies employing kinetics,mass spectrometry,and X-ray structure analysis[J].Chem Res Toxicol,2011,24(6)：797-808.

[6]Glynn P.Neuropathy target esterase[J].Biochem J,1999,344：625-631.

[7]Read DJ,Li Y,Chao MV,et al.Neuropathy target esterase is required for adult vertebrate axon maintenance[J].J Neurosci,2009,29(37)：11594-11600.

[8]Li Z,Szurek PF,Jiang C,et al.Neuronal differentiation of NTE-deficient embryonic stem cells[J].Biochem Biophys Res Commun,2005,330(4)：1103-1109.

[9]Rainier S,Bui M,Mark E,et al.Neuropathy target esterase gene mutations cause motor neuron disease[J].Am J Hum Genet,2008,82(3)：780-785.

[10]Wu YJ,Li M,Li YX,et al.Verapamil abolished the enhancement of protein phosphorylation of brainstem mitochondria and synaptosomes from the hens dosed with trio-cresyl phosphate[J].Environ Toxicol Pharmacol,2007,24(1)：67-71.

[11]Piao F,Yamauchi T,Ma N.The effect of Calcicol as calcium tonic on delayed neurotoxicity induced by organophosphorus compounds[J].Toxicology Letters,2003,143(1)：65-71.

[12]Emerick GL,Peccinini RG,de Oliveira GH.Organophosphorus-induced delayed neuropathy：a simple and efficient therapeutic strategy[J].Toxicol Lett,2010,192(2)：238-244.

[13]Song F,Han X,Zeng T,et al.Changes in beclin-1 and micro-calpain expression in tri-ortho-cresyl phosphate-induced delayed neuropathy[J].Toxicology Letters,2012,210(3)：276-284.

[14]Suwita E,Lapadula DM,Abou-Donia MB.Calcium and calmodulin-enhanced in vitro phosphorylation of hen brain cold-stable microtubules and spinal cord neurofilament triplet proteins after a single oral dose of tri-o-cresyl phosphate[J].Proc Natl Acad Sci U S A,1986,83(16)：6174-6178.

[15]Li BS,Veeranna,Grant P,et al.Calcium influx and membrane depolarization induce phosphorylation of neurofilament(NF-M)KSP repeats in PC12 cells[J].Brain Res Mol Brain Res,1999,70(1)：84-91.

[16]Wang YP,Mou DL,Song JF,et al.Aberrant activation of CDK5 is involved in the pathogenesis of OPIDN[J].J Neurochem,2006,99(1)：186-197.

[17]Abou-Donia MB.The cytoskeleton as a target for organophosphorus ester-induced delayed neurotoxicity(OPIDN)[J].Chem Biol Interact,1993,87(1-3)：383-393.

[18]Song F,Yan Y,Zhao X,et al.Neurofilaments degradation as an early molecular event in tri-ortho-cresyl phosphate(TOCP)induced delayed neuropathy[J].Toxicology,2009,258(2-3)：94-100.

[19]Chen JX,Sun YJ,Wang P,et al.Induction of autophagy by TOCP in differentiated human neuroblastoma cells lead to degradation of cytoskeletal components and inhibition of neurite outgrowth[J].Toxicology,2013,310：92-97.

[20]陸薇薇,齊永芬.內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和血管損傷性疾病[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志,2012,20(10)：939-944.

[21]李瑩,張泉,三曾智.氧化型高密度脂蛋白對(duì)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響[J].中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志,2005,13(2)：186-188.

[22]Zou C,Kou R,Gao Y,et al.Activation of mitochondriamediated apoptotic pathway in tri-ortho-cresyl phosphateinduced delayed neuropathy[J].Neurochem Int,2013,62(7)：965-972.

[23]Somkuti SG,Lapadula DM,Chapin RE,et al.Testicular toxicity following oral administration of tri-o-cresyl phosphate(TOCP)in roosters[J].Toxicol Lett,1987,37(3)：279-290.

[24]Somkuti SG,Lapadula DM,Chapin RE,et al.Time course of the tri-o-cresyl phosphate-induced testicular lesion in F-344 rats：enzymatic,hormonal,and sperm parameter studies[J].Toxicol Appl Pharmacol,1987,89(1)：64-72.

[25]Chen JX,Xu LL,Mei JH,et al.Involvement of neuropathy target esterase in tri-ortho-cresyl phosphate-induced testicular spermatogenesis failure and growth inhibition of spermatogonial stem cells in mice[J].Toxicology Letters,2012,211(1)：54-61.

[26]Baron RL,Bennett DR,Casida JE.Neurotoxic syndrome produced in chickens by a cyclic phosphate metabolite of tri-o-cresyl phosphate--a clinical and pathological study[J].Br J Pharmacol Chemother,1962,18：465-474.

[27]Norris P,Storrs FJ.Allergic contact dermatitis to adhesive bandages[J].Dermatol Clin,1990,8(1)：147-152.

[28]Foil LD,Chambers HW,Stinson RS,et al.Immunological aspects of tri-o-tolyl phosphate-induced delayed neurotoxicity in chickens[J].Toxicol Appl Pharmacol,1980,56(2)：259-264.

[29]Brinkerhoff CR,Sharma RP,Bourcier DR.The effects of tri-o-tolyl phosphate(TOTP)on the immune system of mice[J].Ecotoxicol Environ Saf,1981,5(3)：368-376.