環(huán)磷酰胺睪丸毒性研究進(jìn)展

趙紅樂(lè) 綜述 金保方 審校

南京中醫(yī)藥大學(xué)男科研究所（南京 210023）

·綜 述·

環(huán)磷酰胺睪丸毒性研究進(jìn)展

趙紅樂(lè) 綜述 金保方 審校

南京中醫(yī)藥大學(xué)男科研究所（南京 210023）

環(huán)磷酰胺（cyclophosphamide，CP）具有較強(qiáng)的睪丸毒性，可誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡、抑制精原干細(xì)胞增殖、分化，損傷生精細(xì)胞遺傳物質(zhì)及支持細(xì)胞，這與CP造成睪丸的氧化應(yīng)激損傷有關(guān)。CP還可以通過(guò)抑制膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白StAR、睪酮合成關(guān)鍵酶3β-HSD、17β-HSD等表達(dá)，抑制睪酮合成。本文就CP造成的睪丸毒性，引起生精異常及睪酮合成障礙做一綜述。

CP是一種抗腫瘤和免疫抑制類(lèi)藥物，目前常用于治療各種惡性腫瘤及自身免疫性疾病，但是環(huán)磷酰胺作為細(xì)胞毒性和細(xì)胞抑制類(lèi)藥物，其毒副作用尤其是生殖毒性越來(lái)越受重視。研究表明環(huán)磷酰胺可導(dǎo)致大鼠睪丸和附睪的組織病理學(xué)改變，造成精子減少、活力減弱、畸形精子增多[1]，睪丸、附睪重量減輕，甚至?xí)绊懮昂蟠纳L(zhǎng)發(fā)育等[2]。睪丸是雄性的主要生殖器官，睪丸損傷后主要造成精子生成和睪酮合成的障礙。現(xiàn)就環(huán)磷酰胺睪丸毒性損傷的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展綜述如下。

一、導(dǎo)致睪丸生精障礙

（一）生精細(xì)胞減少

正常生精小管中生精細(xì)胞的排列從外到內(nèi)依次為精原細(xì)胞、初級(jí)精母細(xì)胞、次級(jí)精母細(xì)胞、精子細(xì)胞、精子。睪丸中任何生精細(xì)胞的缺失都會(huì)造成生精障礙。Elangovan等[3]研究環(huán)磷酰胺的生殖毒性與劑量的相關(guān)性，睪丸組織病理發(fā)現(xiàn)CP組小鼠精母細(xì)胞和圓形精子細(xì)胞顯著減少，生精小管中未發(fā)現(xiàn)精子，而且隨著環(huán)磷酰胺劑量的增加，生精小管也出現(xiàn)明顯的萎縮。張長(zhǎng)城等[4]采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)小鼠在CP處理后各級(jí)生精細(xì)胞的比例，結(jié)果顯示CP處理組小鼠單倍體和四倍體細(xì)胞比例明顯減少，提示CP能引起減數(shù)分裂和減數(shù)分裂后階段的生精障礙。有研究表明[5,6]，CP造成生精細(xì)胞減少，可能與引發(fā)小鼠睪丸組織環(huán)腺苷酸反應(yīng)成分調(diào)節(jié)子（CREM）表達(dá)的減少有關(guān)。CREM在睪丸組織中高表達(dá)，其mRNA在粗線(xiàn)期精母細(xì)胞中就已經(jīng)存在，在減數(shù)分裂后的生殖細(xì)胞中表達(dá)水平更高。CREM通過(guò)激活單倍體精子細(xì)胞中的結(jié)構(gòu)調(diào)節(jié)基因，促進(jìn)單倍體細(xì)胞變態(tài)，進(jìn)而形成精子。CREM缺失小鼠，精子變態(tài)被阻斷在早期，許多減數(shù)分裂后基因表達(dá)被抑制，精子計(jì)數(shù)減少46%，畸形精子增加兩倍，甚至無(wú)精子產(chǎn)生[7]。

（二）生精細(xì)胞凋亡

CP誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡以精原細(xì)胞和精母細(xì)胞最為顯著，精原干細(xì)胞凋亡無(wú)顯著改變。1997年Cai等[8]研究了CP對(duì)大鼠睪丸生殖細(xì)胞凋亡的影響，原位缺口末端標(biāo)記法（TUNEL）的結(jié)果表明：環(huán)磷酰胺可以誘導(dǎo)所有階段的生殖細(xì)胞凋亡，以Ⅰ～Ⅳ和Ⅺ～ⅩⅢ階段的精原細(xì)胞和精母細(xì)胞最為顯著。何大維[9]選用僅有精原干細(xì)胞和支持細(xì)胞的1周齡大鼠，腹腔注射CP處理，結(jié)果1周組精原干細(xì)胞凋亡無(wú)顯著增加，3周和9周組生殖細(xì)胞凋亡率顯著高于正常對(duì)照組，推測(cè)可能是和這兩個(gè)年齡組生精小管中含精原細(xì)胞和細(xì)線(xiàn)前期的精母細(xì)胞較多有關(guān)。

大量研究表明，CP誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡主要與bax/ bcl-w、Fas/Fasl等基因凋亡通路有關(guān)。

在生精細(xì)胞凋亡的過(guò)程中，促凋亡蛋白bax起主要作用，而抗凋亡蛋白bcl-w抑制這一過(guò)程，bax/ bcl-w比值是生精細(xì)胞、支持細(xì)胞發(fā)生凋亡的決定性因素。黃宗軒等[10]采用腹腔注射CP，35d后免疫組化法檢測(cè)小鼠睪丸生精細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白bcl-w、bax表達(dá)的情況，結(jié)果顯示模型組生精細(xì)胞bax與bcl-w表達(dá)的積分光密度值（IOD）之比較正常組增大，提示CP可能通過(guò)bcl-w /bax途徑誘導(dǎo)生精細(xì)胞的凋亡。

死亡受體Fas信號(hào)通路是哺乳動(dòng)物生精細(xì)胞凋亡通過(guò)胱門(mén)蛋白酶的主要途徑之一。賓彬等[11]用CP處理小鼠，用免疫組織化學(xué)SABC法檢測(cè)Fas和Fasl蛋白在小鼠睪丸實(shí)質(zhì)組織中的表達(dá)，結(jié)果與空白組比較，模型組Johnson評(píng)分偏低，F(xiàn)as和Fasl蛋白表達(dá)率偏高，提示CP可能通過(guò)此信號(hào)通路誘導(dǎo)生精細(xì)胞的凋亡，導(dǎo)致生精障礙。

（三）抑制精原干細(xì)胞的增殖和分化

精子的發(fā)生開(kāi)始于精原干細(xì)胞的增殖、分化，終止于成熟的精子生成。精原干細(xì)胞增殖、分化障礙會(huì)引起生精障礙。CP可以抑制精原干細(xì)胞的增殖、分化，主要與抑制mSCF/c-Kit、GDNF/Akt通路有關(guān)。

何大維等[9]選用僅有精原干細(xì)胞的1周齡大鼠，腹腔注射CP處理，TUNEL法檢測(cè)生精細(xì)胞凋亡，結(jié)果精原干細(xì)胞凋亡無(wú)顯著增加。但是1周齡實(shí)驗(yàn)組大鼠睪丸在CP處理后不同時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞周期S期細(xì)胞比例、精原細(xì)胞分化相關(guān)蛋白c-Kit蛋白表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組。因此CP可能主要通過(guò)抑制精原細(xì)胞的增殖、分化，引起生精障礙，而不是促使精原干細(xì)胞的凋亡。代江濤等[12]證明CP可能通過(guò)下調(diào)睪丸組織中mSCF表達(dá)，導(dǎo)致生精細(xì)胞增殖指數(shù)下降，造成生精障礙。正常精原細(xì)胞上c-Kit蛋白與支持細(xì)胞分泌的mSCF干細(xì)胞因子結(jié)合，從而引起精原細(xì)胞的增殖、分化。這表明CP可能通過(guò)抑制mSCF/c-Kit通路，抑制精原細(xì)胞的增殖、分化。

在睪丸組織中Akt的激活可以產(chǎn)生對(duì)放療和化療的保護(hù)作用，主要是保護(hù)精原干細(xì)胞的生存和增加精原干細(xì)胞的自我更新[13]，Carmely等[14]通過(guò)對(duì)小鼠每周腹腔注射CP造成生精損傷，免疫印跡法檢測(cè)Akt和GSK-3β（糖原合成酶激酶-3）的表達(dá)，結(jié)果顯示CP組Akt和GSK-3β的磷酸化水平均下降。所以CP可能通過(guò)抑制AKt的表達(dá)影響精原干細(xì)胞的增殖。GDNF是由睪丸支持細(xì)胞分泌產(chǎn)生，它與精原細(xì)胞上的GFRa1/RET受體結(jié)合后，通過(guò)細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT（phosphatidylinositol 3-kinase/AKT）信號(hào)通路，促進(jìn)SSCs自我更新和增殖。常青等[15]通過(guò)對(duì)大鼠腹腔注射CP，免疫組化法檢測(cè)精原干細(xì)胞相關(guān)分子OCT-4和GDNF表達(dá)水平，結(jié)果顯示CP組GDNF表達(dá)明顯減少，而OCT-4表達(dá)水平無(wú)明顯變化。因此精原細(xì)胞的減少可能與CP導(dǎo)致GDNF表達(dá)下調(diào)有關(guān)。而且Akt通路的激活主要靠GDNF的作用，CP可能通過(guò)抑制睪丸支持細(xì)胞GDNF的分泌影響未分化精原細(xì)胞的增殖分化，造成生精細(xì)胞的大量減少。

（四）損害支持細(xì)胞功能

支持細(xì)胞對(duì)精子的發(fā)生起著支持保護(hù)作用，支持細(xì)胞結(jié)構(gòu)或功能異常將導(dǎo)致生精障礙。陳安等[16]發(fā)現(xiàn)，CP處理的小鼠睪丸超微結(jié)構(gòu)（第36d）顯示支持細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)大，有大空泡出現(xiàn)，溶酶體和脂滴的數(shù)量增多，細(xì)胞核的形態(tài)無(wú)明顯變化，緊密連接完好。代江濤等[17]觀(guān)察CP對(duì)幼鼠的生殖損傷情況，電鏡下發(fā)現(xiàn)：精原細(xì)胞、支持細(xì)胞、肌樣上皮細(xì)胞的線(xiàn)粒體腫脹、空泡化，出現(xiàn)髓樣小體，間質(zhì)水腫等，但睪丸間質(zhì)細(xì)胞未見(jiàn)明顯的結(jié)構(gòu)異常。Sue等[18]用CP誘變小鼠，發(fā)現(xiàn)睪丸組織大多數(shù)生精小管出現(xiàn)生精上皮缺失、變薄，而且伴有支持細(xì)胞的空泡化。另外，CP對(duì)支持細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子GDNF[15]、mSCF[12]也有抑制作用。因此CP可能通過(guò)對(duì)支持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷，導(dǎo)致支持細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子減少，從而影響精子生成。

（五）損傷生殖細(xì)胞遺傳物質(zhì)

精子發(fā)生程中，要進(jìn)行兩次減數(shù)分裂，期間進(jìn)行DNA復(fù)制、染色體重組、分離等。CP可以造成生精細(xì)胞DNA斷裂、抑制DNA合成，引起染色體改變而造成生精障礙。

Codrington等[19]研究CP誘導(dǎo)精原細(xì)胞遺傳物質(zhì)損傷的階段特異性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CP可以造成精子DNA 鏈斷裂增加。而且，CP誘導(dǎo)的DNA損傷具有生殖細(xì)胞階段特異性，最大的損傷效應(yīng)在精子染色質(zhì)重組期間的關(guān)鍵點(diǎn)即組蛋白高度乙?；娃D(zhuǎn)換蛋白沉積期，這可能是造成精子凋亡的重要原因。

增殖細(xì)胞核抗原是核酸復(fù)制中DNA 聚合酶的輔助蛋白，免疫組化顯示增殖細(xì)胞核抗原的陽(yáng)性反應(yīng)，即表明該細(xì)胞處于分裂增殖狀態(tài)。李杜娟等[20]采用小劑量長(zhǎng)期腹腔注射CP處理小鼠，免疫組化顯示模型組睪丸組織增殖細(xì)胞核抗原陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少，說(shuō)明CP在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)仍可抑制生精細(xì)胞的DNA復(fù)制，以致睪丸毒性作用。

Guo等[21]研究發(fā)現(xiàn)GSK-3β在哺乳動(dòng)物減數(shù)分裂和精子發(fā)生中起重要作用，GSK-3β功能抑制會(huì)導(dǎo)致減數(shù)分裂過(guò)程中DNA的合成減少，從而影響精子發(fā)生。Carmely等[14]研究發(fā)現(xiàn)，CP可以抑制睪丸組織中GSK-3β的合成，造成生精障礙和生育力下降。

微核是細(xì)胞內(nèi)染色體斷裂或紡錘絲損傷后在細(xì)胞有絲分裂后期滯留在細(xì)胞核外的遺傳物質(zhì)。微核試驗(yàn)?zāi)軝z測(cè)化學(xué)毒劑誘導(dǎo)產(chǎn)生的染色體完整性改變和染色體分離改變這兩個(gè)遺傳學(xué)終點(diǎn)。賈慶軍等[22]發(fā)現(xiàn)CP處理后小鼠精子畸形率和生殖細(xì)胞微核率和對(duì)照組相比均有顯著增加，說(shuō)明CP對(duì)小鼠生殖細(xì)胞染色體有損害作用。端粒酶是維持端粒長(zhǎng)度的逆轉(zhuǎn)錄酶，在保證染色體長(zhǎng)度和細(xì)胞增殖分化中起重要作用。有學(xué)者[23]研究發(fā)現(xiàn)CP可能通過(guò)抑制睪丸組織中端粒酶活性，造成生精細(xì)胞染色體異常，造成生精障礙。

（六）睪丸氧化應(yīng)激損傷

李杜娟等[24]用CP造成小鼠生精功能損害，發(fā)現(xiàn)小鼠睪丸超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、過(guò)氧化氫酶的活性減退，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛顯著升高。環(huán)磷酰胺經(jīng)肝微粒體P450酶系代謝生成有毒的親電子物質(zhì)，如丙烯醛等，這些親電子中間產(chǎn)物與蛋白質(zhì)、核酸、脂質(zhì)等分子結(jié)合，導(dǎo)致重要酶系如自由基清除酶活性下降，造成自由基蓄積，并發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)，使生物膜結(jié)構(gòu)破壞，造成生殖細(xì)胞損傷。同時(shí)，脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛可抑制睪酮的合成及分泌[25]，這些共同參與了環(huán)磷酰胺對(duì)生精功能的損害。

二、導(dǎo)致睪酮合成障礙

睪丸間質(zhì)細(xì)胞是合成睪酮的主要場(chǎng)所。睪酮的合成需要以膽固醇為原料，在膽固醇到睪酮的轉(zhuǎn)化過(guò)程中，膽固醇從線(xiàn)粒體膜外在類(lèi)固醇合成急性期反應(yīng)蛋白(StAR)的參與下轉(zhuǎn)運(yùn)到膜內(nèi)才能參加類(lèi)固醇合成，膽固醇轉(zhuǎn)到線(xiàn)粒體內(nèi)膜后，經(jīng)過(guò)P450scc、P450c17、17β-HSD、3β-HSD等相關(guān)酶的作用下最終轉(zhuǎn)變?yōu)椴G酮。在睪酮生物合成的調(diào)節(jié)因素中，任何一環(huán)節(jié)異常，即可最終引起睪酮合成的障礙。CP可以通過(guò)抑制膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白StAR、以及睪酮合成關(guān)鍵酶3β-HSD、17β-HSD等的表達(dá)，抑制睪酮合成。

Elangovan等[3]研究顯示不同劑量的CP均能導(dǎo)致精子減少，而且還會(huì)降低雄性ICR小鼠的血清睪酮水平，且劑量越大，各組平均睪酮水平越低。張艷等[26]給予腹腔注射CP制備生精障礙大鼠模型。60d后測(cè)睪丸組織勻漿睪酮水平，結(jié)果顯示模型組睪丸組織勻漿睪酮水平顯著降低。Das等[27]研究發(fā)現(xiàn)CP可以導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)鼠血漿T水平下降，并且伴有各種生精細(xì)胞數(shù)量的顯著減少，且睪酮合成相關(guān)酶3β-HSD、17β-HSD 的表達(dá)均降低。劉振華等[28]采用CP 50mg/ kg，連續(xù)7d處理小鼠，第35天后免疫印跡法檢測(cè)StAR蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示模型組小鼠StAR蛋白的表達(dá)明顯低于正常對(duì)照組，證明CP可能通過(guò)影響睪丸內(nèi)StAR蛋白的活性，從而抑制膽固醇從線(xiàn)粒體膜外轉(zhuǎn)導(dǎo)膜內(nèi)而造成睪酮合成原料不足，引起睪酮合成障礙。

三、展望

總之，基于CP的睪丸毒性造成的生精障礙和睪酮合成障礙，目前被廣泛用于雄性生殖損傷模型和中老年男性雄激素分泌減退等模型。CP引起睪丸損傷的具體機(jī)制有待進(jìn)一步的研究，從而可以減少CP的毒副作用，可以更好的檢驗(yàn)或研發(fā)保護(hù)睪丸損傷的藥物，避免對(duì)人體的生殖損傷。

致謝：本課題受?chē)?guó)家自然科學(xué)基金（81273760/ H2709）; 青年科學(xué)基金（81302969/H2709）資助

環(huán)磷酰胺; 睪丸毒性; 生精上皮; 睪酮

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（2014-03-28收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.07.018

R 697.22