精子DNA碎片化檢測(cè)在男性生殖領(lǐng)域的臨床應(yīng)用

陳 亮 徐 陽(yáng)

北京大學(xué)第一醫(yī)院生殖與遺傳醫(yī)療中心（北京 100034）

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精子DNA碎片化檢測(cè)在男性生殖領(lǐng)域的臨床應(yīng)用

陳 亮 徐 陽(yáng)

北京大學(xué)第一醫(yī)院生殖與遺傳醫(yī)療中心（北京 100034）

人工授精（IUI）、體外受精（IVF），特別是胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）等輔助生殖技術(shù)（ART）的廣泛應(yīng)用，解決了嚴(yán)重精子異常不育患者的受精難題[1-3]。由于精液常規(guī)分析（SA）只是對(duì)于精子的活動(dòng)率及形態(tài)進(jìn)行大致的分析，對(duì)ART診療策略的制定及助孕結(jié)局預(yù)測(cè)評(píng)估的作用價(jià)值非常有限。從分子層面檢測(cè)精子DNA損傷程度、選擇DNA損傷較小的精子對(duì)提高ART妊娠成功率大有裨益。雖然精子DNA損傷碎片化檢測(cè)尚處于初步探索階段，對(duì)其認(rèn)知存在不同學(xué)術(shù)觀點(diǎn)，具體發(fā)生機(jī)制尚未完全明了，但不可否認(rèn)，越來(lái)越多的研究結(jié)果提示精子DNA損傷性檢測(cè)對(duì)于評(píng)估男性生育力及預(yù)測(cè)ART結(jié)局顯示出不可低估的作用。本文對(duì)精子DNA損傷碎片化檢測(cè)研究動(dòng)向及其在男性生殖領(lǐng)域內(nèi)的臨床應(yīng)用做一述評(píng)。

一、精子DNA損傷導(dǎo)致碎片化的病因及發(fā)生機(jī)制

精子DNA損傷是指在精子生成及成熟過(guò)程中，各種原因?qū)е翫NA完整性被破壞而產(chǎn)生斷裂的碎片。精子DNA損傷也是多因素共同作用、精子自身抗損傷機(jī)制失衡導(dǎo)致的結(jié)果，與生殖道感染、睪丸溫度升高、精索靜脈曲張、放療及化療、吸煙、激素及環(huán)境污染包括天氣霧霾等因素有關(guān)。霧霾天氣中重金屬及有害物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致精子DNA鏈斷裂和甲基化增多。香煙中含有尼古丁、可尼丁、苯并芘、一氧化碳、鎘等有害物質(zhì)不僅影響睪丸Leydig細(xì)胞睪酮合成及分泌，更能直接導(dǎo)致精子DNA鏈斷裂導(dǎo)致精子損傷[2-7]。精子DNA碎片化的發(fā)生信號(hào)調(diào)控機(jī)制尚不完全明了，但目前研究提示，精子發(fā)生過(guò)程中染色質(zhì)組裝異常、有害刺激因素誘導(dǎo)的過(guò)度氧化應(yīng)激、異常凋亡等多種機(jī)制參與、協(xié)同作用導(dǎo)致了精子DNA完整性損傷[2]。

（一）精子染色質(zhì)組裝異常

精子與體細(xì)胞的核蛋白（主要是組蛋白）不同，成熟精子的核蛋白主要為魚(yú)精蛋白（富含精氨酸和半胱氨酸的堿性蛋白）。在精子發(fā)生周期中期，存在組蛋白被魚(yú)精蛋白替換機(jī)制，這一機(jī)制是一把“雙刃劍”，一方面，有利之處在于精子細(xì)胞核凝集程度大大增加，形成精子DNA超螺旋結(jié)構(gòu)，達(dá)到高度濃縮、凝集的特殊結(jié)構(gòu)形式，而能保持較強(qiáng)穿透卵子透明帶的能力；但另一方面，這一過(guò)程也降低了其本身應(yīng)對(duì)內(nèi)外環(huán)境損傷的修復(fù)能力。易被來(lái)自?xún)?nèi)外環(huán)境的各種有害因素所干擾，DNA雙鏈超螺旋折疊壓縮過(guò)程中產(chǎn)生的扭曲應(yīng)力修復(fù)異常，導(dǎo)致精子DNA碎片化及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)損傷。組蛋白向魚(yú)精蛋白轉(zhuǎn)化異常將會(huì)損傷精子DNA完整性，干擾生精過(guò)程及受精后胚胎早期發(fā)育[2,8,9]。

（二）氧化應(yīng)激

精子正常代謝形成多種氧化產(chǎn)物（活性氧類(lèi)物質(zhì)，ROS），同時(shí)，機(jī)體存在抗氧化系統(tǒng)，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)之間能夠保持動(dòng)態(tài)平衡，使得機(jī)體到達(dá)“穩(wěn)態(tài)”。適當(dāng)水平的ROS有助于精子獲能和頂體反應(yīng)。當(dāng)ROS大量存在，超過(guò)了抗氧化系統(tǒng)的清除能力和精核獨(dú)特緊密結(jié)構(gòu)的防御能力時(shí)，導(dǎo)致精子DNA產(chǎn)生單鏈或雙鏈的斷裂，造成精子DNA損傷。而且，由于精子膜含有高濃度的不飽和脂肪酸、低濃度的ROS清除酶，在過(guò)量ROS的攻擊下易發(fā)生脂類(lèi)過(guò)氧化反應(yīng)。使脂肪酸失去雙鍵（這些雙鍵對(duì)于維持精子膜的流動(dòng)性又是必不可少的），進(jìn)而精子膜失去流動(dòng)性，最后導(dǎo)致DNA變異或斷裂。研究顯示精子暴露在外源性ROS時(shí)，DNA斷裂明顯增加，導(dǎo)致無(wú)堿基位點(diǎn)、缺失、DNA交聯(lián)及重排等[10]。精索靜脈曲張、類(lèi)固醇激素、霧霾、吸煙等都可能通過(guò)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激導(dǎo)致精子DNA損傷[9,10]。

（三）凋亡機(jī)制異常

凋亡即細(xì)胞程序性死亡，是真核生物有核細(xì)胞的一種主動(dòng)性生理過(guò)程，是由體內(nèi)外因素觸發(fā)細(xì)胞內(nèi)預(yù)存程序而導(dǎo)致的細(xì)胞生理性主動(dòng)死亡過(guò)程。凋亡機(jī)制是機(jī)體的“清道夫”，能將損傷的細(xì)胞器及外來(lái)有害物質(zhì)主動(dòng)清除，維持細(xì)胞代謝穩(wěn)態(tài)。精子細(xì)胞表面表達(dá)凋亡蛋白Fas，F(xiàn)as/FasL信號(hào)途徑可能調(diào)控精子凋亡。研究發(fā)現(xiàn)不育男性精子表面Fas蛋白表達(dá)增加，提示精子未能啟動(dòng)正常的凋亡以清除DNA受損的精子，導(dǎo)致精子DNA損傷進(jìn)一步加劇[11]。凋亡會(huì)啟動(dòng)內(nèi)源性凋亡激酶及核酸酶的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，這些信號(hào)級(jí)聯(lián)調(diào)控發(fā)生異常，會(huì)導(dǎo)致精子啟動(dòng)凋亡程序異常，進(jìn)而導(dǎo)致DNA損傷[11]。但對(duì)于凋亡機(jī)制與DNA損傷的因果關(guān)聯(lián)，尚需分子生物學(xué)水平的詳細(xì)解析。

二、精子DNA損傷檢測(cè)方法

目前尚缺乏規(guī)范和統(tǒng)一的方法和標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)有的各種DNA損傷的檢測(cè)方法各有利弊。常用的精子DNA損傷檢測(cè)方法包括精子染色質(zhì)結(jié)構(gòu)分析試驗(yàn)（SCSA）、彗星實(shí)驗(yàn)（Comet assay）、末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP末端標(biāo)記法（TUNEL）、精子染色質(zhì)擴(kuò)散試驗(yàn)（SCD）、熒光原位雜交（FISH）、原位缺口平移法（ISNT）以及和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）等。SCSA反映了不同精子染色質(zhì)構(gòu)象結(jié)構(gòu)的異質(zhì)性，該方法快速、簡(jiǎn)便，但檢測(cè)精子標(biāo)本量的需求較大，需要使用流式細(xì)胞儀。Comet分析試驗(yàn)是在精子細(xì)胞水平檢測(cè)DNA損傷的方法，可直接對(duì)單個(gè)精子單雙鏈的斷裂損傷進(jìn)行定量，所需精子數(shù)量少，靈敏度高，但操作復(fù)雜。TUNEL法運(yùn)用分子生物學(xué)及免疫組化相結(jié)合檢測(cè)凋亡精子的DNA片段，能用于細(xì)胞凋亡的研究，但操作較為復(fù)雜。SCD法簡(jiǎn)單、快捷、但目前還難以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化檢測(cè)。FISH用已知的熒光標(biāo)記核酸探針與處理后待測(cè)的精子染色體進(jìn)行雜交，檢測(cè)精子染色體異常及非整倍體率的分析，方法簡(jiǎn)便，特異度高。PCR能更精細(xì)地研究精子DNA的完整性是否缺失、點(diǎn)突變等[12-14]。這些檢測(cè)方法之間有較好的相關(guān)性，但在檢測(cè)內(nèi)容方面尚存在某些差異性。

三、精子DNA完整性檢測(cè)與SA的比較

SA（精子濃度、活動(dòng)率和形態(tài)學(xué)）的指標(biāo)只能反映最基本的精液質(zhì)量，各參數(shù)波動(dòng)范圍較大，從形態(tài)和數(shù)量方面進(jìn)行分析，而對(duì)精子功能和受精能力方面提供的信息有限。因此，常規(guī)SA并不能完全反映精子是否具有正常的受精能力，也不能很好地預(yù)測(cè)精子的受精潛能。與SA比較，DNA損傷性檢測(cè)的變異系數(shù)更低：同一患者兩周內(nèi)連續(xù)2次標(biāo)本中精子DNA損傷的變異系數(shù)明顯低于常規(guī)SA（精子濃度、精子活動(dòng)率），且同一份標(biāo)本重復(fù)測(cè)定精子DNA完整性的變異系數(shù)較小。在預(yù)測(cè)男性生育能力方面，精子DNA損傷分析可能是比傳統(tǒng)常規(guī)SA參數(shù)更穩(wěn)定、更敏感。 更有研究認(rèn)為精子染色質(zhì)或DNA完整性可能是精子質(zhì)量的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)，作為精子質(zhì)量臨床評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)具有優(yōu)越的可行性[12-14]。DNA碎片與精子濃度沒(méi)有關(guān)聯(lián)，即SA大致正常的患者其精子DNA碎片化指數(shù)（DFI）也可能很高。Moskovtsev等[15]研究結(jié)果表明，精子DNA損傷與精子濃度、活動(dòng)率、正常形態(tài)率呈顯著負(fù)相關(guān)。在精子形態(tài)學(xué)的指標(biāo)中，精子形態(tài)異常與DNA斷裂有關(guān)，尤其精子頭異常與DNA損傷有顯著相關(guān)性[16,17]。可見(jiàn)，對(duì)于男性不育患者，除了SA之外，精子DNA檢出對(duì)預(yù)測(cè)其精子質(zhì)量提供了分子生物學(xué)層面的依據(jù)。

四、精子DNA完整性檢測(cè)在體內(nèi)受精中的預(yù)測(cè)作用

體內(nèi)受精包括自然受孕和宮腔內(nèi)人工受精（IUI）。男方精子DNA損傷率超過(guò)30%，夫婦自然受精率很低。而且當(dāng)精子DNA損傷率高于30%時(shí)（SCSA法），自然妊娠率和宮腔內(nèi)人工授精的妊娠率幾乎為零[18-20]。Duran等[20]通過(guò)TUNEL法研究發(fā)現(xiàn)，IUI時(shí)精子的DFI＞l2% 的配偶均未獲得妊娠。故認(rèn)為，檢測(cè)精子DFI水平可預(yù)測(cè)IUI的成功率。對(duì)于IUI反復(fù)失敗患者，應(yīng)檢測(cè)DNA碎片化程度，并針對(duì)相關(guān)因素進(jìn)行干預(yù)以提高精子DNA完整性，或改行IVF及ICSI。

五、精子DNA損傷在體外受精中的預(yù)測(cè)價(jià)值

精子DNA損傷與體外受精受孕率和胚胎質(zhì)量呈負(fù)相關(guān)，通過(guò)精子DNA碎片可預(yù)測(cè)IVF的成功率[21]。Henkel等報(bào)道，即使精子DFI沒(méi)有影響到受精率和體外培養(yǎng)胚胎碎片發(fā)生率，但當(dāng)TUNEL陽(yáng)性（＞36.5%）時(shí)IVF患者的妊娠率仍很低[22]。相關(guān)研究對(duì)初次行IVF或ICSI的622對(duì)夫婦精液樣本采用SCD法測(cè)定精子DNA斷裂水平，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)精子DNA斷裂率與受精率呈負(fù)相關(guān)，并指出其閾值為18%，胚胎質(zhì)量與精子DNA損傷有關(guān)，但臨床妊娠及分娩率與DNA損傷之間并沒(méi)有相關(guān)性[23]。國(guó)內(nèi)的研究結(jié)果提示DNA碎片率與IVF受精率和優(yōu)質(zhì)胚胎率均存在顯著負(fù)相關(guān)[24]。但是，也有相反的意見(jiàn)，Borini等利用TUNEL法檢測(cè)IVF及ICSI患者的精子DNA損傷，并探討精子DNA損傷與IVF及ICSI結(jié)局的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)IVF患者的臨床妊娠率與精子DNA損傷亦無(wú)顯著相關(guān)性，而ICSI患者的臨床妊娠率與精子DNA損傷呈顯著正相關(guān)[25]。另外研究發(fā)現(xiàn)精子DNA斷裂率與常規(guī)IVF受精率無(wú)關(guān)，而僅與ICSI受精率呈負(fù)相關(guān)，可能是因?yàn)橛糜贗CSI的精子繞過(guò)了精卵自然選擇過(guò)程，有可能將DNA斷裂水平高的精子注入卵子有關(guān)，其結(jié)果可進(jìn)一步影響ICSI后的胚胎質(zhì)量和臨床妊娠率[26]。但目前精子DNA完整性對(duì)IVF技術(shù)受孕率的影響尚有爭(zhēng)議。

六、精子DNA損傷與妊娠結(jié)局及子代健康的關(guān)聯(lián)

隨著精子DNA損傷程度的增加，可能會(huì)發(fā)生受精后的妊娠丟失，如臨床上某些常見(jiàn)的反復(fù)原因不明的妊娠丟失或不良妊娠結(jié)局。持反對(duì)意見(jiàn)的學(xué)者認(rèn)為不同DFI水平與IVF、ICSI受精率、優(yōu)胚率、妊娠率均無(wú)關(guān)，但與自然流產(chǎn)率有關(guān)[27]。Muriel等對(duì)85例需體外受精-胚胎移植（IVF-ET）、ICSI助孕的不孕癥患者，采用SCD法檢測(cè)精子DNA損傷，探討精子DNA損傷與ART結(jié)局，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DNA斷裂率越高，受精卵原核核仁前體發(fā)育不同步性也隨之增高；DNA斷裂高水平組胚胎發(fā)育速度緩慢并且形態(tài)異常的比例高；但I(xiàn)VF妊娠組與非妊娠組的SCD結(jié)果差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），考慮與受精以及植入前的胚胎自然選擇過(guò)程有關(guān)[28]。文獻(xiàn)報(bào)道接受ICSI治療的患者，其后代染色體異常的比例（1.6%）高于正常受精后分娩的嬰兒（0.5%），出生缺陷的風(fēng)險(xiǎn)亦高于正常人群[29]。應(yīng)用DNA損傷嚴(yán)重的精子時(shí)，胚胎可以植入宮內(nèi)并繼續(xù)發(fā)育，也可能會(huì)發(fā)生胚胎發(fā)育中斷或自然流產(chǎn)。即使當(dāng)精子DNA損傷程度較輕時(shí)，胎兒發(fā)育也可能受影響，甚至導(dǎo)致子代先天畸形。 關(guān)于精子DNA損傷與IVF/ISCI術(shù)后妊娠丟失相關(guān)的系統(tǒng)評(píng)價(jià)及Meta分析指出[27]：精子DNA損傷對(duì)子代健康產(chǎn)生不良影響，會(huì)導(dǎo)致子代壽命減短，行為異常增加、病理情況顯著增加、后代癌癥罹患率增高、顯性基因突變?cè)黾印Ｒ虼?，在進(jìn)行ICSI前，對(duì)精子DNA進(jìn)行評(píng)估十分必要。英國(guó)生殖醫(yī)學(xué)會(huì)的推薦指南：精子質(zhì)量差能干擾助孕技術(shù)成功率，建議助孕周期過(guò)程中進(jìn)行精子DNA損傷的檢測(cè)。

七、精子DNA檢測(cè)的局限性

目前對(duì)于精子DNA損傷的機(jī)制及對(duì)生育結(jié)局的影響還存在眾多未解之謎，觀點(diǎn)上也存在爭(zhēng)論，其局限性包括目前尚未能真正建立有效的臨床應(yīng)用體系，因?yàn)楸姸嘀С中匝芯慷际切颖镜?，并且研究?lèi)型各異，證據(jù)不足。實(shí)驗(yàn)室人員目前還缺乏有效培訓(xùn)，很多檢測(cè)方法還不能臨床常規(guī)性應(yīng)用。目前精子DNA檢測(cè)并不能提供特異性的DNA序列預(yù)測(cè)，或許是其短板所在。另外，有觀點(diǎn)認(rèn)為，即使能夠檢測(cè)出精子細(xì)胞核內(nèi)存在DNA碎片，那又能如何? 因?yàn)槟壳吧袩o(wú)特效治療及預(yù)防精子DNA碎片化產(chǎn)生的方法。因此，有學(xué)者認(rèn)為如果是僅僅檢測(cè)及確定精子DNA碎片而卻“束手無(wú)策”，就沒(méi)必要浪費(fèi)人力及物力去開(kāi)展。但也有研究發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的對(duì)癥治療如藥物抗氧化、必需微量元素補(bǔ)充、糾正吸煙等不良生活方式等，對(duì)于減低及恢復(fù)精子DNA碎片化、改善妊娠結(jié)局還是有益的[30]。

綜上所述，隨著ART的發(fā)展，由于其局限性，單純傳統(tǒng)的SA分析已不能滿(mǎn)足需要，急需新的檢測(cè)方法來(lái)預(yù)測(cè)精子的受精能力及對(duì)胚胎的影響。精子DNA損傷程度檢測(cè)有望成為一個(gè)新的評(píng)價(jià)精液質(zhì)量和預(yù)測(cè)生育能力的指標(biāo)，但對(duì)精子DNA損傷的病因、機(jī)制、預(yù)防及干預(yù)尚存在眾多未解之謎，方法學(xué)上也有待于建立行之有效的臨床標(biāo)準(zhǔn)體系，制定適合國(guó)人的檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)值，在臨床應(yīng)用方面仍需繼續(xù)深入研究。

致謝：本課題受北京市自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（7142158）資助

精子; DNA損傷; 受精

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（2014-03-03收稿）

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.07.017

R 321.1