自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植治療重度精神發(fā)育遲滯兒童臨床觀察

屈素清，欒 佐，李玉佳，楊 輝，汪兆艷，楊印祥

自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞移植治療重度精神發(fā)育遲滯兒童臨床觀察

屈素清，欒 佐，李玉佳，楊 輝，汪兆艷，楊印祥

目的觀察自體骨髓單個(gè)核細(xì)胞(bonemarrow mononuclear cell，BM-MNC)移植治療重度精神發(fā)育遲滯(mental retardation，MR)兒童的臨床療效。方法海軍總醫(yī)院兒科自2011年1月—2012年3月收治的重度MR患兒40例(年齡2～14歲)，骨髓動(dòng)員后進(jìn)行BM-MNC分選，分別進(jìn)行右側(cè)頸動(dòng)脈穿刺1次及腰椎穿刺3次行BM-MNC移植。每次移植的BM-MNC細(xì)胞數(shù)為1×106/kg。每例患兒對(duì)其進(jìn)行術(shù)前6個(gè)月及術(shù)后6個(gè)月自身對(duì)照觀察，采用家長(zhǎng)隨訪量表，評(píng)估2個(gè)相同長(zhǎng)度時(shí)間段內(nèi)患兒智力、運(yùn)動(dòng)的發(fā)育狀態(tài)。同時(shí)對(duì)移植術(shù)后1、3、6個(gè)月及1年患兒的發(fā)育情況進(jìn)行追蹤隨訪分析。結(jié)果40例中3例失訪，余37例完成評(píng)估隨訪。其中，術(shù)后有明顯進(jìn)步19例，有效率為51.3%；患兒在術(shù)后3 d至1個(gè)月逐漸出現(xiàn)不同程度的變化，持續(xù)至術(shù)后6個(gè)月后無(wú)再進(jìn)步病例。隨訪量表進(jìn)步值術(shù)前6個(gè)月為(4.69±4.33)分，術(shù)后6個(gè)月為(16.04±12.54)分，進(jìn)步幅度術(shù)后較術(shù)前明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。結(jié)論自體BM-MNC移植安全可靠，能在短時(shí)間內(nèi)改善重度MR患兒智力發(fā)育水平，移植及手術(shù)不良事件極其輕微。

精神發(fā)育遲滯；自體骨髓；單個(gè)核細(xì)胞；移植；兒童

前期我院開(kāi)展并報(bào)道了神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)、間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)治療難治性腦損傷所致精神發(fā)育遲滯(mental retardation，MR)、腦性癱瘓、自閉癥、中樞性視覺(jué)障礙等的臨床研究，均取得了一定的療效[1-6]。由于倫理、取材不便、培養(yǎng)等問(wèn)題，使其臨床進(jìn)一步應(yīng)用受到限制。使用自體骨髓單個(gè)細(xì)胞(bonemarrow mononuclear cell，BM-MNC)因?yàn)闆](méi)有細(xì)胞排斥、沒(méi)有倫理學(xué)問(wèn)題、不需要培養(yǎng)減少了污染和減少培養(yǎng)過(guò)程細(xì)胞死亡以及可以在可控制時(shí)間窗進(jìn)行移植而受到臨床越來(lái)越多的重視[7]。為此，我院開(kāi)展了自體BMMNC移植治療MR的臨床觀察，觀察其臨床效果及預(yù)后情況，進(jìn)一步探索難治性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病新的治療方法。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 海軍總醫(yī)院兒科自2011年1月—2012年3月收治的重度MR患兒40例，在家長(zhǎng)知情簽署手術(shù)同意書及醫(yī)院倫理委員會(huì)同意的前提下實(shí)施治療。4O例中男性24例、女性16例，年齡2～14歲。排除以下原因的智力低下患兒:遺傳代謝?。粡V泛性發(fā)育障礙患兒(如孤獨(dú)癥患兒、Rett綜合征、Asperger′s綜合征、非特殊性廣泛性發(fā)育障礙患兒)；近6個(gè)月內(nèi)有癲癇發(fā)作患兒；合并嚴(yán)重影響智力測(cè)試的疾病(如嚴(yán)重視聽(tīng)覺(jué)障礙或重度腦性癱瘓)。所有患兒都不進(jìn)行康復(fù)訓(xùn)練。

1.2 觀察指標(biāo) 術(shù)前6個(gè)月、術(shù)畢、術(shù)后6個(gè)月行智力隨訪表測(cè)試。測(cè)試總分為228分，每項(xiàng)全部完成得2分，部分完成得1分，不能完成為0分。同時(shí)記錄術(shù)前、術(shù)后患兒一般情況變化，如睡眠、飲食、情緒、行為、驚厥等，但不參與評(píng)分。電話隨訪觀察術(shù)后1、3、6個(gè)月及1年患兒的發(fā)育情況。

1.3 療效評(píng)估方法及有效性判斷

1.3.1 療效評(píng)估方法 進(jìn)行術(shù)前、術(shù)后自身對(duì)照，記錄術(shù)前6個(gè)月、術(shù)后6個(gè)月2個(gè)相同時(shí)間長(zhǎng)度內(nèi)患兒智力隨訪表得分進(jìn)步值，對(duì)術(shù)后1、3、6個(gè)月及1年的發(fā)育情況進(jìn)行追蹤隨訪分析。

1.3.2 移植有效性判斷 患兒臨床表現(xiàn)有明顯進(jìn)步；家長(zhǎng)認(rèn)為較術(shù)前有明顯變化；智力隨訪表評(píng)分至少提高15分[3]。

1.4 細(xì)胞與移植

1.4.1 BM-MNC的獲取 術(shù)前3 d開(kāi)始刺激因子每次5μg/kg骨髓動(dòng)員，2/d，皮下注射。手術(shù)當(dāng)日抽取骨髓1.5 mL/kg，送至實(shí)驗(yàn)室，分選BM-MNC備用及凍存。所有患兒均完成骨髓抽取及BM-MNC分選。

1.4.2 移植 患兒取仰臥位，基礎(chǔ)麻醉下于第1周進(jìn)行右側(cè)頸動(dòng)脈穿刺及腰椎穿刺各1次行BM-MNC移植；第2、3周分別局麻下行腰椎穿刺各1次行BM-MNC移植。每次移植的BM-MNC細(xì)胞數(shù)為1×106/kg。

2 結(jié)果

40例完成移植手術(shù)，3例失訪，37例完成最后的評(píng)估隨訪。

2.1 臨床表現(xiàn) 4例在手術(shù)后第3天開(kāi)始出現(xiàn)近期療效，表現(xiàn)為一般情況的好轉(zhuǎn)。如2例激惹、攻擊行為減少；1例術(shù)前頻繁嘔吐發(fā)作，術(shù)后次數(shù)逐漸減少至消失；2例原有入睡困難，術(shù)后入睡好，睡眠時(shí)間延長(zhǎng)；有些兒童表現(xiàn)為多動(dòng)好轉(zhuǎn)，較術(shù)前安靜。有進(jìn)步患兒在術(shù)后1～6個(gè)月逐漸出現(xiàn)改善，2～3個(gè)月時(shí)最明顯，包括智力、語(yǔ)言、精細(xì)運(yùn)動(dòng)以及部分患兒表現(xiàn)伴隨運(yùn)動(dòng)障礙的改善。每個(gè)患兒的進(jìn)步方面及進(jìn)步程度均不相同，總的進(jìn)步為智力方面，如對(duì)外界反應(yīng)較前靈活、逗引反應(yīng)改善、注意力較前集中、記憶力好轉(zhuǎn)、認(rèn)知學(xué)習(xí)能力提高、應(yīng)人和應(yīng)物能力提高。語(yǔ)言方面:有患兒術(shù)后可以指示大小便，部分聽(tīng)指令、對(duì)語(yǔ)言的理解較前好轉(zhuǎn)；說(shuō)話增多，發(fā)音較前清晰。精細(xì)運(yùn)動(dòng):患兒手精細(xì)功能改善，表現(xiàn)為手指能捏取，能交換玩具，開(kāi)始扣扣子及穿鞋，用勺吃飯較前靈活。運(yùn)動(dòng)方面:表現(xiàn)步態(tài)協(xié)調(diào)性較術(shù)前好轉(zhuǎn)，開(kāi)始自行上下樓，平衡能力好轉(zhuǎn)。移植6個(gè)月后無(wú)患兒出現(xiàn)繼續(xù)的臨床改善，追加隨訪至1年，未發(fā)現(xiàn)新增有效病例及原有效病例中療效繼續(xù)現(xiàn)象。

2.2 智力隨訪表得分

2.2.1 有效率 19例家長(zhǎng)認(rèn)為術(shù)后較術(shù)前有明顯進(jìn)步，療效在1～6個(gè)月逐漸出現(xiàn)，2～3個(gè)月最明顯，智力隨訪表進(jìn)步≥15分，總有效率為51.3%。

2.2.2 智力隨訪表評(píng)分 術(shù)前6個(gè)月患兒進(jìn)步小，所有患兒進(jìn)步均＜15(4.69±4.33)分。術(shù)后6個(gè)月智力隨訪表評(píng)分明顯高于術(shù)前6個(gè)月，其中進(jìn)步分值＞40分3例、30～40分4例、20～29分5例、15～19分7例，其余＜15分；術(shù)后進(jìn)步分值為(16.04±12.54)分，較術(shù)前評(píng)分明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t＝5.204，P＜0.001)。

2.2.3 不良反應(yīng) ①術(shù)后1例出現(xiàn)低熱，體溫37.5℃以下，持續(xù)12 h恢復(fù)正常體溫；1例出現(xiàn)腰穿后背部疼痛哭鬧，2 d后緩解；無(wú)激惹，睡眠障礙病例；無(wú)嘔吐病例；無(wú)出血病例。②在完成隨訪的27例術(shù)前進(jìn)行腦電圖檢查中，有8例因各種原因未進(jìn)行腦電圖復(fù)查，其余19例均進(jìn)行了腦電圖復(fù)查。術(shù)前4例腦電圖有棘波、尖波，臨床無(wú)發(fā)作患兒，術(shù)后2例腦電圖棘波、尖波消失，余2例棘波、尖波無(wú)改善，4例術(shù)后臨床均無(wú)發(fā)作；其余腦電圖均無(wú)明顯變化。

3 討論

MR是指在發(fā)育時(shí)期內(nèi)，一般智力功能明顯低于同齡水平，同時(shí)伴有社會(huì)適應(yīng)行為的缺陷，它是兒童神經(jīng)系統(tǒng)疾病最常見(jiàn)的病癥。發(fā)育商數(shù)(developmental quotient，DQ)＜70分同時(shí)伴社會(huì)適應(yīng)能力下降者可診斷為MR。MR分為4個(gè)等級(jí):即輕度MR，55分≤DQ＜70分；中度MR，40分≤DQ＜55分；重度MR，25分＜DQ＜40分，極重度MR，DQ＜25分。一般認(rèn)為輕度智力低下是可教育的；中度智力低下是可訓(xùn)練的；重度及極重度患兒發(fā)育期智力、運(yùn)動(dòng)發(fā)育明顯落后，成年后生活不能自理，目前無(wú)有效治療手段，需終身監(jiān)護(hù)[8-9]。

BM-MNC在臨床的應(yīng)用有較多報(bào)道，如BM-MNC治療急性腦卒中，多采用動(dòng)脈輸注的方式，結(jié)果顯示BM-MNC移植能減輕遺留殘障的比例和程度，改善患者的生存質(zhì)量，同時(shí)所有的治療都無(wú)不良事件及并發(fā)癥的報(bào)道，證明了BM-MNC治療的安全性及有效性[10-13]。在兒童也有相關(guān)報(bào)道，印度Sharma等[14]對(duì)71例兒童神經(jīng)障礙和損傷患者，采用鞘內(nèi)和肌內(nèi)注射自體骨髓來(lái)源的BM-MNC，部分患兒肌肉萎縮得到改善，脊髓損傷患兒顯示出肌肉強(qiáng)度、排尿控制、痙攣狀態(tài)改善，腦性癱瘓、孤獨(dú)癥的患兒在肌張力和語(yǔ)言方面也都出現(xiàn)改善，未發(fā)現(xiàn)移植后的不良反應(yīng)。在臨床觀察中，Barbosa da Fonseca等[12]使用99mTc標(biāo)志BM-MNC，結(jié)果顯示單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層成像技術(shù)在2 h可見(jiàn)移植細(xì)胞即優(yōu)先聚集在損傷半球，表明動(dòng)脈移植后BM-MNC能遷移至損傷區(qū)。同時(shí)，研究認(rèn)為動(dòng)脈的移植方式優(yōu)于其他方法，且認(rèn)為立體定向會(huì)造成更大的損傷，而動(dòng)脈較靜脈等其他方式更可能地彌散在損傷區(qū)，在靶點(diǎn)有更多的細(xì)胞數(shù)。證明動(dòng)脈移植途徑可能是較好的移植途徑[13]。本研究選擇動(dòng)脈輸注途徑也證明動(dòng)脈移植后有部分MR患兒的智力語(yǔ)言及運(yùn)動(dòng)得到改善。

雖然本組患兒均為重度的智力障礙兒童，但隨著年齡的增長(zhǎng)，部分兒童即使不進(jìn)行移植治療還是有微小程度的進(jìn)步。所以，為除外自身發(fā)育因素的影響，本研究采用了自身對(duì)照的觀察方法。研究采用的智力隨訪表是在多年觀察智力、運(yùn)動(dòng)發(fā)育落后患兒的基礎(chǔ)上，根據(jù)發(fā)育里程碑及各種智力量表制定。結(jié)果顯示術(shù)前6個(gè)月患兒智力隨訪表平均增長(zhǎng)分值均＜15 (4.69±4.33)分；術(shù)后智力隨訪表平均增長(zhǎng)分值較術(shù)前明顯增加，最大進(jìn)步分值達(dá)42分，表明患兒短時(shí)間內(nèi)出現(xiàn)21個(gè)功能項(xiàng)目的明顯進(jìn)步，有效病例平均增加分值＞15分，即術(shù)后至少有7個(gè)功能項(xiàng)目有進(jìn)步。但每例有效病例的進(jìn)步程度及各功能區(qū)變化各不相同，但總的來(lái)說(shuō)運(yùn)動(dòng)在治療前后進(jìn)步不顯著。推測(cè)運(yùn)動(dòng)能力進(jìn)步小可能與這些兒童運(yùn)動(dòng)除受智力影響外還受到肌力、肌張力的影響。本組患兒術(shù)后均未進(jìn)行康復(fù)訓(xùn)練，肌力、肌張力移植前后不可能在短時(shí)間內(nèi)得到明顯改善，同時(shí)部分智力障礙患兒低級(jí)運(yùn)動(dòng)功能尚可，故短時(shí)間內(nèi)變化不大，和NSCs及MSCs治療觀察到的臨床效果一樣。BM-MNC移植后臨床未發(fā)現(xiàn)移植有效病例的規(guī)律性，比如說(shuō)何種損傷類型的兒童會(huì)出現(xiàn)哪些方面的改善。就個(gè)例而言，不同患兒進(jìn)步也各不相同，特別是對(duì)約50%的患兒術(shù)后未顯示效果，其原因不明。但可以肯定的是，療效并非與疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，推測(cè)與個(gè)體內(nèi)在因素及遺傳有關(guān)。

目前，對(duì)BM-MNC移植發(fā)揮作用的機(jī)制還不明確，一些研究初步發(fā)現(xiàn)及推斷認(rèn)為BM-MNC具有:①旁分泌功能，BM-MNC是通過(guò)分泌類似于睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子、表皮細(xì)胞因子、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子等營(yíng)養(yǎng)因子而改善微環(huán)境；②通過(guò)刺激內(nèi)源性干細(xì)胞及祖細(xì)胞的成熟來(lái)達(dá)到局部的修復(fù)；③刺激血管再生，提高腦的灌注、清除有毒代謝產(chǎn)物及改善缺氧；④有免疫調(diào)節(jié)作用，通過(guò)抑制白介素-1、腫瘤壞死因子-α、干擾素-γ，上調(diào)白介素-10、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β來(lái)平衡免疫系統(tǒng)減少神經(jīng)損傷[15]。對(duì)BM-MNC能否分化為神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞，起到替代的作用是有爭(zhēng)議的。有的研究認(rèn)為BM-MNC是不太可能有分化及替代作用的，其發(fā)揮作用仍主要是因子效應(yīng)[12]。在隨后1年的隨訪中未發(fā)現(xiàn)6個(gè)月后療效持續(xù)及新的有效病例出現(xiàn)，從這一方面也推斷BM-MNC移植發(fā)揮作用更多可能是因子作用而非細(xì)胞替代作用。

除以上療效，本組資料顯示了非常好的安全性。除1例低熱、1例腰穿后局部疼痛外，無(wú)顱內(nèi)出血、激惹、嘔吐及驚厥等不良反應(yīng)。

盡管BM-MNC移植治療MR取得了一定的療效，但細(xì)胞的作用仍然是階段性的改善，其改善的程度也是有限的，目前的治療方案并不會(huì)無(wú)止境的發(fā)揮作用，也不能改善患兒的最終預(yù)后。因此，探索合適的細(xì)胞移植療程以及如何保持療效的持續(xù)性，還需要進(jìn)行更多的基礎(chǔ)和臨床研究。

[1]Luan Z，Liu W，Qu S，et al.Effects of neural progenitor cell transplantation in children with severe cerebral palsy[J]. Cell Transplant，2012，21 Suppl 1:S91-S98.

[2]Luan Z，Qu S，Du K，et al.Neural stem/progenitor cell transplantation for cortical visual impairment in neonatal brain injured patients[J].Cell Transplant，2013，22 Suppl 1:S101-S112.

[3]屈素清，欒佐，劉衛(wèi)鵬，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療重度精神發(fā)育遲滯兒童的臨床觀察[J].中華神經(jīng)醫(yī)學(xué)雜志，2011，10(4):393-396.

[4]杜侃，欒佐，屈素清，等.骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療小兒重度腦性癱瘓的療效觀察[J].臨床兒科雜志，2011，29(1):55-58.

[5]欒佐，屈素清，劉衛(wèi)鵬，等.人神經(jīng)干細(xì)胞移植治療重度視覺(jué)障礙腦癱患兒的臨床觀察[J].中國(guó)康復(fù)理論與實(shí)踐，2007，13(12):1103-1105.

[6]劉衛(wèi)鵬，王君，屈素清，等.人神經(jīng)前體細(xì)胞移植治療兒童廣泛性發(fā)育障礙初探[J].中國(guó)當(dāng)代兒科雜志，2013，15(10):860-865.

[7]Friedrich MA，Martins MP，Araújo MD，et al.Intra-arterial infusion of autologous bone marrow mononuclear cells in patients with moderate to severe middle cerebral artery acute ischemic stroke[J].Cell Transplant，2012，21 Suppl 1:S13-S21.

[8]劉智勝.兒童心理行為及其發(fā)育障礙:第1講 精神發(fā)育遲滯[J].中國(guó)實(shí)用兒科雜志，2002，17(1):55-58.

[9]左啟華.小兒神經(jīng)系統(tǒng)疾病[M].2版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2002:7l5-719.

[10]Moniche F，Gonzalez A，Gonzalez-Marcos JR，et al.Intraarterial bonemarrow mononuclear cells in ischemic stroke: a pilot clinical trial[J].Stroke，2012，43(8):2242-2244.

[11]Savitz SI，Misra V，Kasam M，et al.Intravenous autologous bonemarrowmononuclear cells for ischemic stroke[J].Ann Neurol，2011，70(1):59-69.

[12]Barbosa da Fonseca LM，Gutfilen B，Rosado de Castro PH，et al.Migration and homing of bone-marrow mononuclear cells in chronic ischemic stroke after intra-arterial injection [J].Exp Neurol，2010，221(1):122-128.

[13]Battistella V，de Freitas GR，da Fonseca LM，et al.Safety of autologous bonemarrowmononuclear cell transplantation in patients with nonacute ischemic stroke[J].Regen Med，2011，6(1):45-52.

[14]Sharma A，Gokulchandran N，Chopra G，et al.Administration of autologous bone marrow-derived mononuclear cells in children with incurable neurological disorders and injury is safe and improves their quality of life[J].Cell Transplant，2012，21 Suppl 1:S79-S90.

[15]Sharma A，Gokulchandran N，Sane H，et al.Autologous bonemarrowmononuclear cell therapy for autism:an open label proof of concept study[J].Stem Cells Int，2013，2013:623875.

Clinical application of autologous bonemarrow mononuclear cell transp lantation in children with severemental retardation

QU Suqing，LUAN Zuo，LIYujia，YANG Hui，WANG Zhaoyan，YANG Yinxiang
(Department of Pediatrics，Navy General Hospital，Beijing 100048，China)

ObjectiveTo observe the clinical efficacy of transplantation with autologous bonemarrow mononuclear cell(BM-MNC)in treatment of children with severe mental retardation (MR).MethodsFourty children with severe MR(2—14 years old)，admitted to our hospital from January 2011 to March 2012 were chosen.Autologusmononuclear cellswere isolated from mobilized bonemarrow，and then were transplanted(1×106/kg)by right carotid artery puncture(the first time)or lumbar puncture(three times)self-control observation on the mental and motor developments of these children in the same length of time periods was performed 6 months before and 6 months after the BM-MNC transplantation.Meanwhile，the improvements of each patient were followed up and analyzed by 1，3，6months and 1 year after the transplantation.ResultsThree patients failed to follow-up.The other 37 patientswere observed.Significant improvementwas noted in 19 patients after the transplantation with an effective rate of 51.3%.Gradually mental and motor improvements appeared in 19 patients at the 3rd day after the transplantation，and lasted ti1l the 6th month of transplantation.The average scores ofmental improvementwere(4.69±4.33)in 6months before transplantation，and(16.04±12.54)in 6 months after transplantation(P＜0.01).ConclusionBM-MNC transplantation can improve the intellectual development in a short time in children with severe MR. BM-MNC transplantation for severe MR is safe and effective in a short term.

Mental retardation；Autologous bone；Marrowmononuclear cell；Transplantation；Children

R748；R45

B

2095-3097(2014)06-0343-04

10.3969/j.issn.2095-3097.2014.06.007

2014-10-19 本文編輯:徐海琴)

100048北京，海軍總醫(yī)院兒科(屈素清，欒 佐，李玉佳，楊 輝，汪兆艷，楊印祥)

欒 佐，E-mail:luanzuo＠aliyun.com